Summary
Eine Biomembrankraftsonde (BFP) ist eine In-situ-Technik der dynamischen Kraftspektroskopie (DFS). BFP kann verwendet werden, um die Federkonstante molekularer Wechselwirkungen auf lebenden Zellen zu messen. Dieses Protokoll präsentiert eine Federkonstantenanalyse für molekulare Bindungen, die von BFP nachgewiesen wurden.
Abstract
Eine Biomembrankraftsonde (BFP) hat sich kürzlich als Nanowerkzeug für die native Zelloberfläche oder die dynamische Kraftspektroskopie (DFS) mit nativer Zelloberfläche oder in situ entwickelt, das die einzelmolekulare Bindungskinetik messen, mechanische Eigenschaften von Liganden-Rezeptor-Interaktionen bewerten, proteindynamische Konformationsänderungen visualisieren und rezeptorvermittelte Zellmechanosensormechanismen aufregender aufklären kann. In jüngerer Zeit wurde BFP verwendet, um die Federkonstante molekularer Bindungen zu messen. Dieses Protokoll beschreibt das schrittweise Verfahren zur Durchführung der molekularen Federkonstanten-DFS-Analyse. Konkret werden zwei BFP-Betriebsmodi diskutiert, nämlich die Bead-Cell- und Bead-Bead-Modi. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Ableitung von Federkonstanten der molekularen Bindung und Zelle aus DFS-Rohdaten.
Introduction
Als Lebendzell-DFS-Technik entwickelt BFP ein menschliches rotes Blutkörperchen (RBC; Abbildung 1) in einen ultraempfindlichen und abstimmbaren Kraftaufnehmer mit einem kompatiblen Federkonstantenbereich bei 0,1-3 pN/nm1,2,3. Um die Liganden-Rezeptor-Interaktion zu untersuchen, ermöglicht BFP DFS-Messungen bei ~1 pN (10-12 N), ~3 nm (10-9 m) und ~0,5 ms (10-3 s) in Kraft, räumlicher und zeitlicher Auflösung4,5. Seine experimentelle Konfiguration besteht aus zwei gegenüberliegenden Mikropipetten, nämlich der Sonde und dem Ziel. Die Sonden-Mikropipette saugt ein RBC an und eine Perle wird an ihrer Spitze über eine Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung geklebt. Die Perle ist mit dem interessierenden Liganden beschichtet (Abbildung 1A). Die Target-Mikropipette aspirat entweder eine Zelle oder eine Perle mit dem interessierenden Rezeptor, entsprechend den Modi Bead-Cell (Abbildung 1B) und Bead-Bead (Abbildung 1C) bzw.5.
BFP-Aufbau, Montage und die DFS-Versuchsprotokolle wurden zuvor ausführlich beschrieben1,6. Kurz gesagt, ein BFP-Touch-Zyklus besteht aus 5 Stufen: Annäherung, Impinge, Kontakt, Rückzug und Dissoziieren (Abbildung 1D). Die horizontale RBC-Spitzenposition wird als ΔxRBC bezeichnet. Zu Beginn ist die unbelastete (kraftfreie) RBC-Verformung ΔxRBC 0 (Tabelle 1). Das Ziel wird dann von einem Piezotranslator angetrieben, um auf die Sondenperle einzufallen und sich von ihr zurückzuziehen (Abbildung 1D). Die RBC-Sonde wird zunächst vom Target mit negativer RBC-Verformung ΔxRBC-< 0 komprimiert. In einem Bond-Ereignis geht die Retract-Stufe von einer Druck- in eine Zugphase mit positiver RBC-Verformung ΔxRBC > 0 über(Abbildung 2C und D). Nach dem Hookeschen Gesetz kann die BFP-Lagerkraft als F = kRBC × ΔxRBCgemessenwerden, wobei kRBC ( Tabelle1) die RBC-Federkonstante des BFP ist. Nach Abschluss eines Berührungszyklus kehrt die Sondenperle mit Δ xRBC = 0 in die Nullkraftposition zurück (Abbildung 1D).
Zur Bestimmung des kRBCmessen und erfassen wir die Radien der Sondenmikropipetten-Innenöffnung (Rp), der RBC (R0) und der kreisförmigen Kontaktfläche (Rc) zwischen dem RBC und der Sondenperle ( Abbildung1A). Dann wird kRBC nach dem Evan's Modell (Eq. 1)7,8 unter Verwendung eines LabVIEW-Programms berechnet, das als virtuelles Instrument (VI) zum Betrieb des BFP fungiert (Abbildung S1A)8,9.
(Gleichung 1)
Mit einem BFP etabliert und DFS Rohdaten erhalten, präsentieren wir hiermit, wie die Federkonstante von Liganden-Rezeptor-Paaren oder Zellen analysiert werden kann. Die DFS-Rohdaten zur Wechselwirkung des glykosylierten Proteins Thy-1 und K562 zelltragendes Integrin α5β1 (Thy-1-α5β1; Abbildungen 3A und 3B)10 und die des fibrinogen- und perlenbeschichteten Integrins αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3; Abbildung 3C) 11,12 wurden verwendet, um die Analysemodi Bead-Cell bzw. Bead-Bead zu demonstrieren.
BFP Versuchsvorbereitung
Einzelheiten zur experimentellen Vorbereitung und Instrumentierung von BFP finden Sie in den zuvor veröffentlichten Protokollen3. Kurz gesagt, humanes RBC wurde mit dem Biotin-PEG3500-NHS im Kohlenstoff-/Bicarbonatpuffer biotinyliert. Interessante Proteine wurden kovalent mit den Borosilikatglasperlen unter Verwendung von MAL-PEG3500-NHS im Phosphatpuffer gekoppelt. Zur Bindung an das biotinylierte RBC wird die Sondenperle auch mit Streptavidin (SA) unter Verwendung des MAL-SA beschichtet. Bitte beachten Sie die Materialtabelle und Tabelle 2.
Um den BFP (Abbildung 1, links) zusammenzubauen, wird die dritte Mikropipette, die als "Helper" bezeichnet wird, verwendet, um die Sondenperle zu liefern und sie an die Spitze1,3des RBC zu kleben. Die kovalente Wechselwirkung zwischen der SA-beschichteten Sondenperle und dem biotinylierten RBC ist viel stärker als die interessierende Ligandenrezeptorbindung. Daher kann das Dissoziierungsstadium als Liganden-Rezeptor-Bindungsbruch und nicht als Ablösung der Sondenperle vom RBC interpretiert werden.
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Protocol
1. Abrufen analysierbarer DFS-Ereignisse
- Starten Sie das Experiment in der Software (z. B. LabVIEW VI) für die BFP-Steuerung und Parametrierung (Abbildung S1A).
- Beobachten Sie die sich wiederholenden Berührungen der Sondenperlen-Zielperle/Zelle in der Software für BFP Monitor (Abbildung S1B).
- Testen und erreichen Sie die Adhäsionsfrequenz ≤ 20% innerhalb der ersten 50 Berührungen durch Abstimmung der Impingementkraft und der Kontaktzeit, wodurch sichergestellt wird, dass ≥ 89% des DFS-Adhäsionsereignisses durch Einzelbindungen12,13,14vermittelt werden.
HINWEIS: Für jedes Perlen-Zell/Perlen-Paar führen wir 200 sich wiederholende Berührungszyklen durch. Um eine publizierbare Datenqualität zu erhalten, führen wir in der Regel n ≥ 3 Perlen-Perlen- oder Perlenzellpaare durch.- Speichern Sie die Daten in Form von Force vs. Time am Ende jedes Paares im benutzergesteuerten Ordner, der von der Software zur BFP-Steuerung und Parametereinstellung aufgefordert wird.
- Sammeln Sie die Force vs. Time-Rohdaten von Bond-Ereignissen, wie in Abbildung 2Averanschaulicht, mithilfe der BFP-Erfassungsplattform (Abbildung S1C).
- Öffnen Sie die BFP-Datenanalysesoftware. Klicken Sie auf das gelbe Ordnersymbol und wählen Sie durch Doppelklick die entsprechende Rohdatendatei aus.
- Führen Sie das Programm aus, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche nach oben und unten, um zwischen den Ereignissen zu wechseln. Verwenden Sie die Ausreißerausschlusskriterien (Abbildung S2 ),um ungültige Ereignisse auszublenden. Wählen Sie den exportierenden Datentyp als Format Force vs. Time aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Plots Data exportieren.
2. Konvertieren Sie die Kraft-Zeit-Kurve in die Kraft-Verschiebungs-Kurve
- Exportieren Sie das Datensegment, das der Retract-Stufe entspricht, in eine Tabelle (Abbildung 2A, quadratischer Auswahlrahmen), die für die Federkonstantenanalyse relevant ist.
- Zeichnen Sie die Kraft- vs. Zeitkurve mit tabellenkalkulationssoftware. Um die Kraft-Verdrängungskurve zu erhalten, konvertieren Sie die Zeitwerte (Abbildung 2A, x-Achse) in die Gesamtverschiebungswerte (Δxtot), indem Sie Zeitwerte mit der Piezobewegungsgeschwindigkeit multiplizieren (d. h. 4.000 nm / s durch Voreinstellung).
- Null den ersten Datenpunkt, indem der kleinste Verschiebungswert von jedem erfassten Verschiebungswert subtrahiert wird. Diese horizontale Transformation wirkt sich weder auf die aufsteigenden Steigungen der Retract-Stufe noch auf die anschließende Berechnung der Federkonstante aus.
- Insbesondere wird das BFP als serielles Federsystem betrachtet, in dem Δxtot (Tabelle 1) Verformungen des RBC, ΔxRBC (Tabelle 1), der molekularen Bindung, Δxmol (Tabelle 1) und der Zielzelle, ΔxZelle (Tabelle 1), als Eq. 2 summen:
(Gleichung 2) - Zeichnen Sie die Kurve Kraft (F) vs. Verschiebung (Δxtot) wie in Abbildung 2Bdargestellt.
(Gleichung 2)3. Spring Cnstant Analyse des Perlen-Zell-Modus
- In der Kraft-Verschiebungs-Kurve können zwei unterschiedliche Steigungen identifiziert werden, wobei jede die Druckphase und die Zugphase darstellen kann. Passen Sie eine Regressionslinie an jede Datengruppe an (Abbildung 2B), wobei die größere lineare Anpassungssteigung die Gesamtfederkonstante in der Druckphase darstellt (Abbildung 2B, rot), gekennzeichnet als k1 (Tabelle 1); und die kleinere lineare Passungsneigung stellt die Gesamtfederkonstante in der Zugphase dar (Abbildung 2B, blau), gekennzeichnet als k2 (Tabelle 1).
- Für in Reihe geschaltete Federn gemäß Der Beschreibung der Stufe 2.2 wird der Kehrwert der Gesamtfederkonstante ktot (Tabelle 1) als Summe der Federkonstantenumkehrungen von RBC, kRBC (Tabelle 1), der molekularen Bindung kmol (Tabelle 1) und der Zielzelle kZelle (Tabelle 1) angegeben. Während der Druckphase des Bead-Cell-Modus wird die molekulare Bindung nicht gedehnt, daher wird kmol nicht berücksichtigt. Der Kehrwert des ktot in diesem Szenario (1/k1) wird ausgedrückt als
(Gleichung 3).
In den Beispieldaten ist kRBC vorbestimmt (standardmäßig 0,25 pN/nm). kZelle kann aus dem Eq. 3 mit dem erworbenen k1 und kRBC abgeleitet werden ( Abbildung3B). - Während der Zugphase bildet sich eine Adhäsion zwischen dem Liganden-Rezeptor-Paar. Drücken Sie den Kehrwert des ktot in diesem Szenario (1/k2) als
(Gleichung 4)
wobei k2 (Tabelle 1) die Gesamtfederkonstante während der Zugphase darstellt. - Leiten Sie kmol ab, wenn Sie 1/k1 von 1/k2 subtrahieren (vergleichen Sie Eq. 3 vs. Eq. 4).
(Gleichung 3).
(Gleichung 4)4. Federkonstante Analyse des Perlen-Perlen-Modus
- Passen Sie eine Regressionslinie an die Druckphasendaten an, um k1 zu erhalten (ähnlich wie in Abbildung 2B, rot). Bemerkenswert ist, dass im Bead-Bead-Modus die Zielzelle durch eine Glasperle ersetzt wird, die mit dem interessierenden Rezeptor beschichtet ist (Abbildung 1C). Da die Wulstverformung vernachlässigbar ist, kann der 1/kZellterm entsprechend aus dem Eq. 3 und Eq. 4 entfernt werden. Das reziproke ktot der Druckphase (1/k1) kann wie folgt ausgedrückt werden:
(Gleichung 5) - Passen Sie eine Regressionslinie an die Zugphasendaten an, um k2 zu erhalten (ähnlich wie in Abbildung 2B, blau). Das reziproke ktot der Zugphase (1/k2) kann wie folgt ausgedrückt werden:
(Gleichung 6) - Leiten Sie kmol ab, wenn Sie 1/k1 von 1/k2 subtrahieren (vergleichen Sie Eq. 5 vs. Eq. 6).
(Gleichung 5)
(Gleichung 6)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dieser Arbeit haben wir das Protokoll der BFP-Federkonstantenanalyse demonstriert. Für den Bead-Cell-Analysemodus analysierten wir das kmol der molekularen Bindung zwischen dem auf der Sondenperle beschichteten glykosylierten Protein Thy-1 und dem Integrin α5β1, exprimiert auf der Zielzelle K562 (Thy-1-integrin α5β1; Abbildung 3A) 10.Diek-Zelle ist ebenfalls aus dem Bead-Cell-Modus (K562 Cell; Abbildung 3B). Für den Bead-Bead-Modus bildet sich die molekulare Bindung zwischen Fibrinogen und Integrin αIIbβ3 (FGN-Integrin αIIbβ3; Abbildung 3C) 11,12 wird verwendet, um den Bead-Bead-Analysemodus zu demonstrieren.
Für den Bead-Cell-Modus haben wir die Federkonstanten von Thy-1-Integrin α5β1 Bindung und K562 Zelle als kmol = 0,45 ± 0,28 pN/nm (Abbildung 3A) und kZelle = 0,18 ± 0,07 pN/nm (Abbildung 3B) aus 27 vorgescreenten analysierbaren Ereignissen gemessen. Für den Bead-Bead-Modus haben wir die Federkonstanten von FGN-Integrin αIIbβ3-Bindung als kmol = 0,53 ± 0,29 pN/nm (Abbildung 3C) aus 33 vorgescreenten analysierbaren Ereignissen gemessen.
| Symbol | Definition | Symbol | Definition |
| Δxtot | Die Gesamtverschiebung des Piezos, die auch als Totalverformung von RBC, Zielzelle und molekularer Bindung interpretiert werden kann. | ΔxRBC | Die RBC-Verformung, die auch als Verschiebung der Sondenperle interpretiert werden kann. |
| ktot | Die Gesamtfederkonstante des gesamten seriellen BFP-Federsystems. | kRBC | Die Federkonstante des aspirierten RBC durch die Sondenmikropipette. |
| kmol | Die Federkonstante des BFP detektierte molekulare Bindung | Zelle k | Die Federkonstante der Zielzelle. |
| k1 | ktot der Druckphase in der Retract-Stufe. | k2 | ktot der Zugphase in der Retract-Stufe. |
| ΔF1 | Der Kraftzuwachs, der von der Sondenperle in der Druckphase erfasst wird. | ΔF2 | Der Kraftzuwachs, der von der Sondenperle in der Zugphase erfasst wird. |
| Δx1 | Das Zuwachs der Verschiebung in der Druckphase. | Δx2 | Die Verschiebungszuwachs in der Zugphase. |
Tabelle 1. Symboldefinitionen für die BFP-Molekülfederkonstantenanalyse. Horizontale Positionen aller Objekte sind als xdefiniert, während Δx [nm] sich auf die Verformung relativ zur ursprünglichen Position bezieht. ΔF [pN] bezieht sich auf das mit BFP gemessene Kraftinkrement. k [pN/nm] bezieht sich auf die Federkonstante. Die Tiefstellungen 1 und 2 entsprechen der Druck- bzw. Zugphase. Die molekulare Federkonstante leitet sich von der Kraft (F) vs. Verschiebungskurve (Δxtot).
Abbildung 1:BFP-Konfiguration und DFS-Touch-Zyklus. (A) Das BFP-System besteht aus zwei gegenüberliegenden Mikropipetten, nämlich der Sonde (links) und der Ziel (rechts). Die Sonden-Mikropipette saugt ein RBC(rot)mit einer Glasperle an, die an ihrer Spitze geklebt ist, um als Kraftaufnehmer zu dienen. Die Target-Mikropipette saugt eine rezeptortragende Zelle an (blau). Die RBC-Federkonstante (kRBC) wird durch den Aspirationsdruck (Δp) und die Radien von aspiriertem RBC (R0), Sondenmikropipette (Rp) und kreisförmiger Kontaktfläche (Rc) zwischen dem RBC und der Sondenperle bestimmt. (B und C) Mikroaufnahmen der BFP-Modi Bead-Cell (B) und Bead-Bead (C). Skalenbalken = 5 μm. (D) Ein BFP-Touch-Zyklus, der aus den Stufen Approach, Impinge, Contact, Retract und Dissociate besteht. Die Strichlinie ΔxRBC = 0 zeigt die unbeanspruchte BFP- oder Nullkraftposition an. Die Retract-Stufe umfasst die Druckphase (ΔxRBC < 0, rot),die Nullkraftposition (ΔxRBC = 0, schwarz)und die Zugphase (ΔxRBC > 0, blau)nacheinander. Der schwarze Pfeil zeigt die Position des Bond-Ereignisses an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Ableitung molekularer Federkonstanten aus DFS-Rohdaten. (A) Repräsentative Kraft (F) vs. Zeit (t) Kurve der DFS-Rohdaten in einem BFP-Touch-Zyklus. (B) Repräsentative umgerechnete Kraft (F) vs. Verschiebung (Δxtot) Kurve, die die Retract-Stufe darstellt. k1 und k2 stellen die Passneigung der aufeinanderfolgenden Druck- bzw. Zugphasen dar. ΔF1 und ΔF2 stellen die Kraftschritte in der Druckphase bzw. den Zugphasendaten dar, wobei Δx1 und Δx2 die Verschiebungsschritte in den Druckphasen- bzw. Zugphasendaten darstellen. R2-Werte für federkonstante während der Druckstufe (R12) und Zugphase (R22) sind in der Grafik markiert, um eine gute statistische Eignung anzuzeigen. (C und D) Illustrationen der Retract-Stufe in den experimentellen Modi Bead-Cell (C) und Bead-Bead (D). kRBC stellt die Federkonstante von RBC dar; k-Zelle und kmol repräsentieren die Federkonstanten der Zielzelle bzw. der molekularen Bindung. Während der Zugphase bildet sich eine Adhäsion zwischen dem Liganden-Rezeptor-Paar, das RBC lenkt in die gleiche Richtung ab, in der sich das Piezo über die Nullkraftposition hinaus zurückzieht (ΔxRBC > 0). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Histogramme der BFP-gemessenen Federkonstanten. Die Ereigniszahl (linke y-Achse) und Die Häufigkeitsverteilung (rechte y-Achse) der gemessenen Federkonstanten für Thy-1-Integrin α5β1 Bindung (A) und K562 Zielzelle (B) im Bead-Cell-Modus und FGN-Integrin αIIbβ3 Bindung (C) im Bead-Bead-Modus. Histogramme passen zur Gaußschen Verteilungskurve (rosa) und der statistische Parameter R2wird verwendet, um die Stärke der Fitness anzuzeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung S1: Die selbstgebaute BFP-Schnittstelle. (A) BFP-Steuer- und Parametrierschnittstelle. Die Parameter zur Bestimmung der RBC-Federkonstante werden aus dem Panel der biophysikalischen Parameter eingegeben. (B) BFP-Überwachung. Live-BFP-Touch-Zyklen werden aus dieser Kameraansicht beobachtet. (C) BFP DFS-Analyseschnittstelle, bei der die Kraft- (F) vs. Zeitkurven (t) offline überprüft und für die anschließende molekulare Federkonstantenanalyse vorverarbeitet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Abbildung S2. BFP-analysierbare Datenqualitätskontrolle und Pre-Screening-Kriterien. (A) Gute DFS-Ereignisse mit hoher Qualität: (i) Perlen-Zell-Bruchkraftereignis; (ii) Bead-Cell Lifetime Event; (iii) Bead-Bead-Bruchkraftereignis; (iv) Bead-Bead Lifetime Event. (B) Akzeptable DFS-Ereignisse mit etwas Rauschen: (i) Datendrifting, aber die Zoom-In-Retract-Stufe bleibt gültig; ii) Leichte Datendrift nach Bindungsdissoziation; iii) Datenknick beim Null-Kraft-Regime; (iv) Die Haltekraft ist gering (< 10 pN). C) Ereignisse von schlechter Qualität, die verworfen werden sollten: (i) Keine Haftung; ii) Datenoszillation; (iii) Daten, die die ganze Zeit driften; (iv) Diskontinuierliche Daten; v) Druckkraft zu gering (≈ 0 pN); vi) Mehrfachbindungen; vii) ungültige Daten mit abgeleiteten kmol < 0; (viii) Signalfehler. Nullkraft wird durch die graue intermittierende Linie angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Zusammenfassend haben wir ein detailliertes Datenanalyseprotokoll zur Vorverarbeitung der DFS-Rohdaten und zur Ableitung molekularer Federkonstanten in den BFP-Analysemodi Bead-Bead und Bead-Cell bereitgestellt. Biomechanische Modelle und Gleichungen, die zur Bestimmung molekularer und zellulärer Federkonstanten erforderlich sind, werden vorgestellt. Obwohl verschiedene Integrine untersucht werden, besitzt das kmol, gemessen durch den Bead-Bead-Modus und den Bead-Cell-Modus signifikante Reichweitenunterschiede (Abbildung 3A vs. Abbildung 3C). Bemerkenswert ist, dass beim Bead-Bead-Modus der Rezeptor kovalent mit der Glasperle verbunden ist. Im Gegensatz dazu wird beim Bead-Cell-Modus der Oberflächenrezeptor durch die darunter liegende Plasmamembran und Zytoskelette angepasst, die höchstwahrscheinlich das gemessene kmolbeeinflussen.
Die Datenqualitätskontrolle ist entscheidend, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Zu diesem Zweck haben wir die DFS-Daten-Pre-Screening- und Ausreißer-Ausschlusskriterien auf den Diagrammen Kraft vs. Zeit implementiert. Um dies zu demonstrieren, wurde ein repräsentativer Datensatz ausgewählt, in dem wir die DFS-Rohdaten in drei Qualitätsstufen kategorisiert haben: Gut (Abbildung S2A), Akzeptabel mit Rauschen (Abbildung S2B) und Schlecht inakzeptabel (Abbildung S2C). Für Anfänger der Verwendung des BFP empfehlen wir die strengen Kriterien, um die Daten mit der guten Qualität (Abbildung S2A) vorzuscreenen. Auf der Grundlage der Kriterien für die Daten vor dem Screening sollte die Regressionspasslinie der Druckphase steiler sein als die der Zugphase, insbesondere k1 > k2 (Abbildung S2C,vii). Bei messung k1 < k2 (Abbildung S2C,vii) steht die abgeleitete kmol < 0 gegen die Begründung pro Berechnung in Schritt 4. Solche Ereignisse sollten dann als ungültige Ausreißer betrachtet und verworfen werden.
Um die BFP-Messung auf einzelmolekularer Ebene während der Datenerfassung zu begünstigen, wurden gemäß der vorherigen Studie12mehrere experimentelle Konfigurationen implementiert. Erstens wird die Proteinbeschichtungsdichte auf Perlen in der Regel bis zu einem minimalen Niveau (z. B. 60 μm-2)titriert, indem die Lösungskonzentration, die Menge des Proteins und die Reaktionsbedingungen streng kontrolliert werden15. Der durchschnittliche räumliche Abstand zwischen Proteinen auf der Perle wird dadurch viel größer geschätzt als die linearen Dimensionen des Proteins, was unsere Messungen auf einzelmolekularer Ebene12,13,14begünstigt. Zweitens kontrollieren wir die Adhäsionsfrequenz für jedes Liganden-Rezeptor-Paar ≤ 20%, unter der molekulare Bindungsereignisse der Poisson-Verteilung folgen und vorhersagen, ≥ 89% der Ereignisse eine einzelmolekulare Bindungwären 14,15. Um dies zu erreichen, werden Aufdringkraft und Kontaktzeit entsprechend eingestellt und müssen während des gesamten Experiments konsistent sein12. Dennoch ist es immer noch möglich, dass mehrere Bindungen nacheinander auftreten (Abbildung S2C, vi). In solchen Fällen werden wir die Ereignisse mit Unterschriften mehrerer Anleihen verwerfen. Last but not least werden Negativkontrollexperimente mit Perlen durchgeführt, die mit Rinderserumalbumin (Materialtabelle) oder SA allein beschichtet sind, um sicherzustellen, dass die unspezifische Adhäsionshäufigkeit ≤ 2%16,17beträgt.
Obwohl BFP die Proteindynamik auf der lebenden Zelloberfläche10,11,12untersuchenkann,gibt es technische Einschränkungen. Bei BFP kann nur ein Liganden-Rezeptor-Paar gleichzeitig untersucht werden. Es wäre zeitaufwendig, ausreichende Daten mit statistischer Signifikanz zu erhalten. Außerdem sind die experimentellen Verfahren arbeitsintensiv mit steilen Lernkurven. In Bezug auf die Implementierung ist das aktuelle BFP-System anfällig für die Umweltdrift und die umgebenden mechanischen Vibrationen. Daher ist eine kontinuierliche manuelle Anpassung erforderlich, um die DFS-Datenqualität sicherzustellen. Zu diesem Zweck hat eine unserer jüngsten Studien ultrastabile BFP-Feedback-Steuerungsalgorithmen eingeführt, um die Stabilität der BFP-Kraftklemmen-DFS-Assays zu verbessern4. Dieser technische Fortschritt ermöglicht Messungen einer stärkeren molekularen Interaktion wie antigen-Antikörper-Bindung mit ultralanger Bindungslebensdauer (>50 s). Dennoch gehen wir davon aus, dass in Zukunft Anstrengungen unternommen werden, um die BFP-Datenerfassung und DFS-Analyse in einem computergestützten Programm zu automatisieren und zu integrieren, wodurch der gesamte BFP-Betrieb und die Datenanalyse benutzerfreundlicher und mit hohem Durchsatz werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben, über die vorliegende Studie zu berichten.
Acknowledgments
Wir danken Guillaume Troadec für die hilfreiche Diskussion, Zihao Wang für die Hardware-Beratung und Sydney Manufacturing Hub, Gregg Suaning und Simon Ringer für die Unterstützung unseres Labor-Startups. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Australian Research Council Discovery Project (DP200101970 - L.A.J.), das NSW Cardiovascular Capacity Building Program (Early-Mid Career Researcher Grant - L.A.J.), den Sydney Research Accelerator Prize (SOAR - L.A.J.), den Ramaciotti Foundations Health Investment Grant (2020HIG76 - L.A.J.), den National Health and Medical Research Council Ideas Grant (APP2003904 - L.A.J.) und den University of Sydney Faculty of Engineering Startup Fund and Major Equipment Scheme (L.A.J.). Lining Arnold Ju ist deCRA-Fellow des Australian Research Council (DE190100609).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) | Uct, Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
| BFP data acquisition VI | LabVIEW | BFP control and parameter setting | |
| BFP data analysis VI | LabVIEW | BFP raw data analysis | |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
| Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology, Netherlands | 9002 | Glass bead functionalization |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalization |
| Camera VI | LabVIEW | BFP monitoring | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Tyrode’s buffer preparation |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s buffer preparation |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Glass bead functionalization |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation; Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
| Streptavidin-Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
References
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