Summary
एक बायोमेम्ब्रेन फोर्स प्रोब (बीएफपी) सीटू डायनामिक फोर्स स्पेक्ट्रोस्कोपी (डीएफएस) तकनीक में है। BFP का उपयोग जीवित कोशिकाओं पर आणविक बातचीत के वसंत को मापने के लिए किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल बीएफपी द्वारा पता लगाया आणविक बांड के लिए वसंत निरंतर विश्लेषण प्रस्तुत करता है।
Abstract
एक बायोमेम्ब्रान फोर्स प्रोब (बीएफपी) हाल ही में एक देशी-सेल-सतह के रूप में या सीटू डायनामिक फोर्स स्पेक्ट्रोस्कोपी (डीएफएस) नैनोटूल के रूप में उभरा है जो एकल आणविक बाध्यकारी गतिज को माप सकता है, लिगांड-रिसेप्टर इंटरैक्शन के यांत्रिक गुणों का आकलन कर सकता है, प्रोटीन गतिशील संरचना परिवर्तनों की कल्पना करता है और अधिक रोमांचक रूप से रिसेप्टर मध्यस्थता सेल मेचनो संवेदन तंत्र को स्पष्ट करता है। हाल ही में, BFP आणविक बांड के वसंत स्थिर उपाय करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । यह प्रोटोकॉल आणविक वसंत निरंतर डीएफएस विश्लेषण करने के लिए कदम-दर-कदम प्रक्रिया का वर्णन करता है। विशेष रूप से, दो बीएफपी ऑपरेशन मोड पर चर्चा की जाती है, अर्थात् मनका-सेल और मनका-मनका मोड। यह प्रोटोकॉल डीएफएस कच्चे डेटा से आणविक बंधन और सेल के वसंत स्थिरांक प्राप्त करने पर केंद्रित है।
Introduction
एक लाइव सेल डीएफएस तकनीक के रूप में, बीएफपी एक मानव लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) इंजीनियरों; चित्रा 1) 0.1-3 पीएन / एनएम 1 ,2,3पर एक संगत स्प्रिंग लगातार रेंज के साथ एक अल्ट्रासेंसिटिव और ट्यूनबल फोर्स ट्रांसड्यूसर में । लिगांड-रिसेप्टर इंटरैक्शन की जांच करने के लिए, बीएफपी ~ 1 पीएन (10-12 एन), ~ 3 एनएम(10-9 मीटर), और बल में ~ 0.5 एमएस (10-3 एस), स्थानिक, और लौकिक संकल्प 4,5पर डीएफएस माप सक्षम बनाता है। इसके प्रायोगिक विन्यास में दो विरोधी माइक्रोपिपेटेस होते हैं, अर्थात् जांच और लक्ष्य। प्रोब माइक्रोपिपेट एक आरबीसी को एस्पिरेट्स करता है और एक मनका एक बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन इंटरैक्शन के माध्यम से अपने शीर्ष पर चिपका हुआ है । मनका ब्याज की लिगामेंट(चित्रा 1A)के साथ लेपित है । लक्ष्य माइक्रोपिपेट या तो एक सेल या एक मनका ब्याज के रिसेप्टर असर, मनका सेल(चित्रा 1B)और मनका-मनका(चित्रा 1C)मोड, क्रमशः5के अनुरूप ।
बीएफपी निर्माण, असेंबली और डीएफएस प्रायोगिक प्रोटोकॉल को पहले1,6विस्तार से वर्णित किया गया था। संक्षेप में, एक बीएफपी स्पर्श चक्र में 5 चरण होते हैं: दृष्टिकोण, इम्पिंग, संपर्क, रीक और डिसोसिएट(चित्र 1डी)। क्षैतिज आरबीसी शीर्ष स्थिति को एक्सआरबीसीके रूप में चिह्नित किया गया है। शुरुआत में, अनस्ट्रेस्ट (जीरो-फोर्स) आरबीसी विरूपणएक्सआरबीसी 0(टेबल 1)है। इसके बाद लक्ष्य को जांच मनका(चित्रा 1डी)से अतिक्रमण करने और वापस लेने के लिए एक पीजोट्रांसलेटर द्वारा संचालित किया जाता है। आरबीसी जांच पहले नकारात्मक आरबीसी विरूपण के साथ लक्ष्य से संकुचित हैएक्सआरबीसी < 0 । एक बांड घटना में, सकारात्मक आरबीसी विरूपण के साथ एक तन्य चरण के लिए एक संपीड़न से वापस लेना चरण संक्रमण 0(चित्रा 2C और डी)>एक्सआरबीसी ) । हुक के कानून के अनुसार, बीएफपी असर बल को एफ = केआरबीसी ×एक्सआरबीसीके रूप में मापा जा सकताहै, जहां केआरबीसी (टेबल 1)बीएफपी का आरबीसी स्प्रिंग कॉन्स्टेंट है। बांड टूटना और एक स्पर्श चक्र के पूरा होने पर, जांच मनकाशून्य-बलस्थिति में लौटता है, जिसमें एक्सआरबीसी = 0(चित्रा 1D)है।
के आरबीसी का निर्धारण करने केलिए, हमआरबीसीऔर जांच मनका(चित्रा 1A)के बीच जांच माइक्रोपिपेट इनर छिद्र(आरपी),आर सी(आर0)और परिपत्र संपर्क क्षेत्र(आरसी)की रेडी को मापते और रिकॉर्ड करते हैं। फिर केआरबीसी की गणना इवान के मॉडल (Eq. 1)7, 8के अनुसार की जाती है जो एक लैबव्यू प्रोग्राम का उपयोग करके है जो बीएफपी(चित्रा S1A)8, 9को संचालित करने के लिए एक आभासी साधन (VI) के रूप में कार्य करता है।
(Eq. 1)
एक BFP की स्थापना की और DFS कच्चे डेटा प्राप्त के साथ, इसके द्वारा हम मौजूद कैसे ligand-रिसेप्टर जोड़ी या कोशिकाओं के वसंत स्थिर विश्लेषण करने के लिए । ग्लाइकोसाइलेटेड प्रोटीन थाय-1 और K562 सेल असर इंटीग्रिन α 5 β1(तेरा-1-α 5 β1) कीबातचीत परडीएफएसकच्चे डेटा; आंकड़े 3ए और 3 बी)10 औरफाइबα फाइ β3 (एफजीएन-αआईआईबीβ3) फिब्रिनोजेन और मनका कोटेड इंटीग्रीन के हैं । चित्रा 3C) 11,12 का उपयोग क्रमशः मनका-सेल और मनका-मनका विश्लेषण मोड प्रदर्शित करने के लिए किया गया है।
बीएफपी प्रायोगिक तैयारी
बीएफपी प्रायोगिक तैयारी और इंस्ट्रूमेंटेशन के विवरण के लिए, कृपया पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल3का उल्लेख करें। संक्षेप में, कार्बन/बाइकार्बोनेट बफर में बायोटिन-PEG3500-NHS का उपयोग करके मानव आरबीसी को बायोटिनीलेटेड किया गया है । फास्फेट बफर में मल-PEG3500-NHS का उपयोग करके बोरोसिलिकेट ग्लास मोतियों के लिए ब्याज के प्रोटीन को एकजुट रूप से जोड़ा गया है । बायोटिनेलेटेड आरबीसी से अटैच करने के लिए, जांच मनका भी MAL-SA का उपयोग कर स्ट्रेप्टाविडिन (एसए) के साथ लेपित है । कृपया सामग्री और तालिका 2की तालिका देखें ।
बीएफपी(चित्रा 1, बाएं)को इकट्ठा करने के लिए, तीसरे माइक्रोपिपेट को 'हेल्पर' कहा जाता है, इसका उपयोग जांच मनका को वितरित करने और इसे आरबीसी के शीर्ष1, 3पर गोंद करने के लिए किया जाएगा। एसए कोटेड प्रोब बीड और बायोटिनेलेटेड आरबीसी के बीच सहसंयोजक बातचीत ब्याज के लिगांड-रिसेप्टर बॉन्ड की तुलना में काफी मजबूत है । इस प्रकार, असंबद्ध चरण को आरबीसी से जांच मनका की टुकड़ी के बजाय लिगांड-रिसेप्टर बॉन्ड टूटना के रूप में समझा जा सकता है।
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Protocol
1. प्राल्य DFS घटनाओं प्राप्त
- बीएफपी नियंत्रण और पैरामीटर सेटिंग(चित्रा S1A)के लिए सॉफ्टवेयर (जैसे, लैबव्यू VI) में प्रयोग शुरू करें।
- बीएफपी मॉनिटर(चित्रा S1B)के लिए सॉफ्टवेयर में दोहराव जांच मनका-लक्ष्य मनका/सेल छू का निरीक्षण करें ।
- इम्प्लाइमेंट फोर्स और कॉन्टैक्ट टाइम ट्यूनिंग करके पहले 50 टच के भीतर 20% ≤ आसंजन फ्रीक्वेंसी का परीक्षण करें और प्राप्त करें, जिसके द्वारा यह सुनिश्चित किया गया है कि डीएफएस आसंजन घटना के 89% ≥ एकल बांड12,13,14द्वारा मध्यस्थता की जाती है।
नोट: प्रत्येक मनका सेल/मनका जोड़ी के लिए, हम २०० दोहराव स्पर्श चक्र प्रदर्शन करते हैं । प्रकाशनीय डेटा गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए, हम आमतौर पर एन ≥ 3 मनका-मनका या मनका-सेल जोड़े करते हैं।- बीएफपी नियंत्रण और पैरामीटर सेटिंग के लिए सॉफ्टवेयर द्वारा प्रेरित प्रत्येक जोड़ी के अंत तक उपयोगकर्ता निर्देशित फ़ोल्डर के लिए, फोर्स बनाम टाइम के रूप में डेटा सहेजें।
- बीएफपी अधिग्रहण मंच(चित्रा S1C)का उपयोग करके, चित्रा 2Aमें उदाहरण के रूप में बॉन्ड इवेंट्स के बल बनाम टाइम रॉ डेटा एकत्र करें।
- बीएफपी डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें। येलो फोल्डर आइकन पर क्लिक करें और उन पर डबल क्लिक करके संबंधित रॉ डेटा फाइल का चयन करें।
- कार्यक्रम चलाएं, और फिर घटनाओं के बीच स्विच करने के लिए अप और डाउन बटन पर क्लिक करें। अमान्य घटनाओं को स्क्रीन करने के लिए आउटलियर अपवर्जन मानदंड(चित्रा S2)का उपयोग करें। निर्यात डेटा प्रकार को फोर्स बनाम टाइम फॉर्मेट के रूप में चुनें और एक्सपोर्ट प्लॉट्स डेटा बटन पर क्लिक करें ।
2. बल बनाम समय वक्र को बल बनाम विस्थापन वक्र में परिवर्तित करें
- रिऐडेंकेशन स्टेज के अनुरूप डेटा सेगमेंट को स्प्रेडशीट(चित्रा 2 ए, स्क्वायर मार्की)में निर्यात करें, जो स्प्रिंग कॉन्स्टेंट एनालिसिस के लिए प्रासंगिक है।
- स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर का उपयोग करके फोर्स बनाम टाइम कर्व को प्लॉट करें। बल बनाम विस्थापित वक्र प्राप्त करने के लिए, पीजो आंदोलन वेग (यानी, 4,000 एनएम/एस पूर्व निर्धारित) के साथ समय मूल्योंकोगुणा करके कुल विस्थापन मूल्यों(चित्रा 2 ए, एक्स-एक्सिस)को कुल विस्थापन मूल्यों (एक्स-एक्सिस) में परिवर्तित करें।
- प्रत्येक अधिग्रहीत विस्थापन मूल्य से सबसे छोटे विस्थापन मूल्य को घटाकर पहले डेटा बिंदु को शून्य करें। यह क्षैतिज परिवर्तन वापस लेने की अवस्था की आरोही ढलानों को प्रभावित नहीं करता है और न ही बाद में वसंत निरंतर गणना।
- विशेष रूप से, बीएफपीको एक धारावाहिक स्प्रिंगसिस्टम के रूप में माना जाता है जिसमें आरबीसी,एक्सआरबीसी (टेबल 1),आणविक बांड, एक्सएमोल (टेबल 1)और लक्ष्य सेल,एक्ससेल (तालिका 1)के एक धारावाहिक स्प्रिंग सिस्टम के रूप में माना जाता है।
(Eq. 2) - फोर्स(एफ)बनाम विस्थापन (एक्सएक्समुन्ना)वक्र की साजिश करें जैसा कि चित्र 2बीमें दिखाया गया है ।
(Eq. 2)3. मनका के स्प्रिंग सीनस्टेंट विश्लेषण- सेल मोड
- बल बनाम विस्थापन वक्र में, दो अलग स्लोप की पहचान की जा सकती है, जहां प्रत्येक संपीड़न चरण और तन्य चरण का प्रतिनिधित्व कर सकता है। प्रत्येक डेटा समूह(चित्रा 2 बी)के लिए एक प्रतिगमन रेखा फिट करें, जहां बड़ा रैखिक फिट ढलान कंप्रेसिव चरण(चित्रा 2 बी, लाल)पर कुल वसंत स्थिर का प्रतिनिधित्व करता है,जो k 1(तालिका 1)के रूप में चिह्नित है; और छोटे रैखिक फिट ढलान टेन्सलाइल चरण(चित्रा 2 बी, नीला)पर कुल वसंत स्थिर का प्रतिनिधित्व करता है, जो k2 (तालिका 1)के रूप में चिह्नित है।
- चरण 2.2 विवरण प्रति श्रृंखला में जुड़े स्प्रिंग्स के लिए, आरबीसी, केआरबीसी (टेबल 1), आणविक बांड, कश्मीरमोल (तालिका 1) और लक्ष्यसेल, कश्मीर सेल(तालिका 1)के वसंत निरंतर विलोपन के योग के रूप में कुल वसंत स्थिर, कश्मीरमुन्ना (टेबल 1)के पारस्परिक व्यक्त करतेहैं। मनका-सेल मोड के कंप्रेसिव चरण के दौरान, आणविक बंधन को बढ़ाया नहीं जाता है, इसलिए कश्मीरमोल को ध्यान में नहीं रखाजाता है। इस परिदृश्य में कश्मीरमुन्ना के पारस्परिक (1/k1)के रूप में व्यक्त किया जाता है
(Eq. 3) ।
उदाहरण के आंकड़ों में, केआरबीसी पूर्व निर्धारित (०.२५ पीएन/एनएम डिफ़ॉल्ट रूप से) है । Kसेल एक्साइटेड के 1और केआरबीसी (चित्रा3 बी) केसाथ ईक्यू3 से ली जा सकती है। - तन्य चरण के दौरान, लिगांड-रिसेप्टर जोड़ी के बीच आसंजन बनता है। इस परिदृश्य में कश्मीरमुन्ना के पारस्परिक व्यक्त करें (1/k2)के रूप में
(Eq. 4)
जहां k2 (तालिका 1)तन्य चरण के दौरान कुल वसंत स्थिर का प्रतिनिधित्व करता है। - 1/k1 से घटाना कश्मीरमोल 1/k2 (तुलना Eq. 3 बनाम Eq. 4) ।
(Eq. 3) ।
(Eq. 4)4. मनका का स्प्रिंग लगातार विश्लेषण- मनका मोड
- K1 (चित्रा 2B, लाल)प्राप्त करने के लिए कंप्रेसिव चरण डेटा के लिए एक प्रतिगमन लाइन फिट करें। ध्यान दें, मनका-मनका मोड में, लक्ष्य सेल को ब्याज के रिसेप्टर(चित्रा 1C)के साथ लेपित ग्लास मनका द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है। चूंकि मनका विरूपण नगण्य है,इसलिए1/kसेल शब्द को Eq. 3 और Eq. 4 से तदनुसार हटाया जा सकता है । कंप्रेसिव चरण (1/k 1) के पारस्परिककश्मीर मुन्ना को व्यक्त किया जा सकता है:
(Eq. 5) - K2 (चित्रा2 B, नीलेरंग के समान) प्राप्त करने के लिए तन्य चरण डेटा के लिए एक प्रतिगमन लाइन फिट करें। तन्य चरण (1/k2)के पारस्परिक कश्मीरमुन्ना को व्यक्तकियाजा सकता है:
(Eq. 6) - 1/k1 से घटाना कश्मीरमोल 1/k2 (तुलना Eq. 5 बनाम Eq. 6) ।
(Eq. 5)
(Eq. 6)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
इस काम में, हमने बीएफपी स्प्रिंग लगातार विश्लेषण के प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया है। मनका-सेल विश्लेषण मोड के लिए, हमने जांच मनका पर लेपित ग्लाइकोसाइलेटेड प्रोटीन थाय-1 के बीच आणविक बंधन के कश्मीरमोल का विश्लेषण किया और लक्ष्यK562सेल पर व्यक्त 5 β1 α तेरीग्रिन (तेरा-1-इंस्टेग्रिन α5β1; चित्रा 3ए) 10. कश्मीरसेल भी मनका-सेल मोड (K562 सेल) से ली गई है; चित्रा 3B)। मनका-मनका मोड के लिए,आईआईबीα β 3 (एफजीएन-इंटीग्रिन αआईआईबीβ3) के बीच गठितआणविक बंधन; चित्रा 3C) 11,12 मनका-मनका विश्लेषण मोड प्रदर्शित करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
मनका-सेल मोड के लिए, हमने 5 α β 1 बॉन्ड और K562 सेल के रूपमें5β1 बांड और K562 सेल के वसंत स्थिरों ± 0मापा .28 पीएन/एनएम(चित्रा 3 ए)और kसेल = 0.18 ± 0.07 पीएन/एनएम(चित्रा 3 बी)27 पूर्व-जांच विश्लेषणीय घटनाओं से। मनका-मनका मोड के लिए, हम FGN के वसंत स्थिरांक-integrin αIIbβ3 बांड के रूप में कश्मीरमोल = ०.५३ ± ०.२९ pN/nm(चित्रा 3C)से ३३ पूर्व जांच विश्लेषण योग्य घटनाओं से मापा ।
| चिह्न | परिभाषा | चिह्न | परिभाषा |
| एक्समुन्ना | पीजो का कुल विस्थापन, जिसे आरबीसी, लक्ष्य कोशिका और आणविक बांड के कुल विरूपण के रूप में भी समझा जा सकता है। | एक्सआरबीसी | आरबीसी विरूपण, जिसकी व्याख्या जांच मनका के विस्थापन के रूप में भी की जा सकती है । |
| केमुन्ना | पूरे बीएफपी धारावाहिक वसंत प्रणाली के कुल वसंत स्थिर। | केआरबीसी | जांच माइक्रोपिपेट द्वारा एस्पिरेटेड आरबीसी का वसंत स्थिर। |
| कश्मीरमोल | BFP के वसंत स्थिर आणविक बांड का पता चला | केसेल | लक्ष्य सेल का वसंत स्थिर। |
| कश्मीर1 | वापस लेना चरण में कंप्रेसिव चरण का मुन्ना। | k2 | वापस लेना चरण में तन्य चरण का मुन्ना। |
| 1एफ1 | संपीड़न चरण में जांच मनका द्वारा महसूस की गई बल की वृद्धि। | 10 एफ2 | तन्य चरण में जांच मनका द्वारा महसूस की गई बल की वृद्धि। |
| एक्स1 | संपीड़न चरण में विस्थापन की वृद्धि। | एक्स2 | तनिंतर चरण में विस्थापन की वृद्धि। |
तालिका 1. बीएफपी आणविक वसंत निरंतर विश्लेषण के लिए प्रतीक परिभाषाएं। सभी वस्तुओं की क्षैतिज स्थितियों को एक्सके रूप में परिभाषित किया गया है, जबकिएक्स एक्स [एनएम] मूल स्थिति के सापेक्ष विरूपण को संदर्भित करता है। 1एफ [पीएन] बीएफपी द्वारा मापी गई बल वृद्धि को संदर्भित करता है। कश्मीर [पीएन/एनएम] वसंत स्थिर को संदर्भित करता है । सबस्क्रिप्ट 1 और 2 क्रमशः कंप्रेसिव और टेंपरेने वाले चरणों के अनुरूप हैं। आणविक वसंत स्थिर बल(एफ)बनाम से लिया जाताहै । विस्थापन(एक्समुन्ना)वक्र।
चित्रा 1:बीएफपी विन्यास और डीएफएस स्पर्श चक्र। (क) बीएफपी प्रणाली दो विरोधी माइक्रोपिपेट्स अर्थात् जांच(बाएं)और लक्ष्य(दाएं)को इकट्ठा करती है । प्रोब माइक्रोपिपेट एक आरबीसी(लाल)को अपने शीर्ष पर चिपके हुए ग्लास मनका के साथ एक बल ट्रांसड्यूसर के रूप में काम करने के लिए प्रेरित करता है । लक्ष्य माइक्रोपिपेट एक रिसेप्टर-असर सेल(नीला)को एस्प्रिट्स करता है। आरबीसी स्प्रिंग कंटेंस्ट(केआरबीसी)का निर्धारण आकांक्षा दबाव(आर0),प्रोब माइक्रोपिपेट(आरपी)और सर्कुलर कॉन्टैक्ट एरिया (आरसी)के आरबीसी और प्रोब बीड के बीच एस्पिरेटेड आरबीसी(आरपी) की रेडी द्वारा किया जाता है । (बी और सी) मनका-सेल (बी) और मनका-मनका (सी) बीएफपी मोड के माइक्रोग्राफ। स्केल बार = 5 माइक्रोन (डी) एक बीएफपी स्पर्श चक्र जिसमें दृष्टिकोण, इम्पिंग, संपर्क, वापस लेना और अलग चरण होते हैं। इसकेबाद एक्सआरबीसी = 0 डैश लाइन बीएफपी अनस्ट्रेस्ट, या जीरो-फोर्स, स्थिति को इंगित करती है। रियाव चरण में कंप्रेसिवचरण (एक्सआरबीसी < 0, लाल),शून्य-बल स्थिति(एक्सआरबीसी = 0, ब्लैक)और टेंसिनल चरण (एक्सआरबीसी > 0, नीला)शामिल हैं। काला तीर बॉन्ड इवेंट की स्थिति को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 2:डीएफएस कच्चे डेटा से आणविक वसंत स्थिरांक प्राप्त करें। (ए)प्रतिनिधि बल(एफ)बनाम समय(टी)एक बीएफपी टच चक्र में डीएफएस कच्चे डेटा का वक्र । (ख)प्रतिनिधि परिवर्तित बल(एफ)बनाम विस्थापन(एक्समुन्ना)वक्र जो रिऐक्शन स्टेज को दर्शाता है । k1 और k2 क्रमशः लगातार कंप्रेसिव और तन्य चरणों के फिट ढलान का प्रतिनिधित्व करते हैं। 1 और1 एफ2 क्रमशः कंप्रेसिव चरण और तन्य चरण डेटा में बलकी वृद्धि काप्रतिनिधित्व करते हैं, जहां क्रमशः संपीड़न चरणऔर तन्य चरण डेटा में विस्थापन की वृद्धिका प्रतिनिधित्व करते हैं। वसंत के लिए आर2 मूल्यों को कंप्रेसिव चरण(आर12)और तन्य चरण(आर2 2)के दौरान ग्राफ पर लेबल कियाजाताहै ताकि अच्छी सांख्यिकीय फिटनेस का संकेत मिल सके। (सी और डी) मनका-सेल (सी) और मनका-मनका (डी) प्रयोगात्मक मोड में वापस लेने की अवस्था के चित्र। कश्मीरआरबीसी आरबीसी के वसंत स्थिर का प्रतिनिधित्व करता है; कश्मीरसेल और कश्मीरमोल क्रमशः लक्ष्य कोशिका और आणविक बंधन के वसंत स्थिरांकों का प्रतिनिधित्व करते हैं। तन्य चरण के दौरान, लिगांड-रिसेप्टर जोड़ी के बीच आसंजन बनता है, आरबीसी उसी दिशा में विक्षेपित होता है क्योंकि पीजो शून्य-बल स्थिति (एक्सएक्सआरबीसी > 0) से परे है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3:बीएफपी के प्रतिनिधि हिस्टोग्राम वसंत स्थिरांक मापा। घटना संख्या(बाएं वाई-अक्ष)और आवृत्ति वितरण(दाएं वाई-अक्ष)के लिए मापा वसंत स्थिरांक के तेरी-1-integrin α5β1 बांड (ए) और K562 लक्ष्य सेल (बी) मनका-सेल मोड में और FGN-integrin αIIbβ3 बांड (C) मनका-मनका मोड में । हिस्टोग्राम गॉसियन डिस्ट्रीब्यूशन कर्व(पिंक)के साथ फिट हैं और फिटनेस की ताकत को इंगित करने के लिए सांख्यिकीय पैरामीटर, आर2 का उपयोग कियाजाताहै। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा S1: घर का बना BFP इंटरफेस। (क) बीएफपी कंट्रोल और पैरामीटर सेटिंग इंटरफेस। आरबीसी स्प्रिंग कॉन्स्टेंट निर्धारित करने के मापदंडों को जैव भौतिक मापदंडों के पैनल से दर्ज किया जाता है। (ख) बीएफपी निगरानी। इस कैमरा व्यू से लाइव बीएफपी टच साइकिल देखी जाएगी। (ग) बीएफपी डीएफएस विश्लेषण इंटरफेस जहां बल(एफ)बनाम समय(टी)घटता ऑफलाइन समीक्षा की जाती है और बाद में आणविक वसंत निरंतर विश्लेषण के लिए पूर्व संसाधित किया जाता है । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा S2। बीएफपी विश्लेषण योग्य डेटा गुणवत्ता नियंत्रण और प्री-स्क्रीनिंग मानदंड। (A)उच्च गुणवत्ता के साथ अच्छा DFS घटनाओं: (i) मनका सेल टूटना बल घटना; (ii) मनका-सेल लाइफटाइम इवेंट; (iii) मनका-मनका टूटना बल घटना; 4 मनका-मनका लाइफटाइम इवेंट। (ख)कुछ शोर के साथ स्वीकार्य DFS घटनाओं: (i) डेटा बहती है लेकिन ज़ूम-इन रिऐक्शन चरण वैध रहता है; (ii) बांड वियोजन के बाद मामूली डेटा बहती है; (iii) शून्य बल व्यवस्था पर आंकड़ों की गुत्थी; (iv) होल्डिंग फोर्स छोटी (< 10 पीएन) है। (ग) खराब गुणवत्ता वाली घटनाओं को छोड़ दिया जाना चाहिए: (i) कोई आसंजन नहीं; (ii) डाटा आदोलन; (iii) आंकड़े हर समय बहती रहती हैं; (iv) असतत आंकड़े; (v) कंप्रेसिव फोर्स बहुत छोटा (≈ 0 पीएन); (vi) कई बांड; (vii) व्युत्पन्न कश्मीरमोल <0 के साथ अमान्य डेटा; 8 सिग्नल एरर। शून्य बल ग्रे आंतरायिक रेखा द्वारा इंगित किया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
संक्षेप में, हमने डीएफएस कच्चे डेटा को प्रीप्रोसेस करने और बीएफपी मनका-मनका और मनका-सेल विश्लेषण मोड में आणविक वसंत स्थिरांश प्राप्त करने के लिए एक विस्तृत डेटा विश्लेषण प्रोटोकॉल प्रदान किया है। आणविक और सेलुलर स्प्रिंग कॉन्स्टेंशेंट निर्धारित करने के लिए आवश्यक बायोमैकेनिकल मॉडल और समीकरण प्रस्तुत किए जाते हैं। हालांकि विभिन्न integrins का अध्ययन कियाजाता है, केमोल मनका-मनका मोड और मनका-सेल मोड द्वारा मापा महत्वपूर्ण सीमा मतभेदों के पास(चित्रा 3A बनाम चित्रा 3C)। ध्यान दें, मनका-मनका मोड के साथ, रिसेप्टर को ग्लास मनका से सहसंयोजक रूप से जोड़ा गया है। इसके विपरीत, मनका-सेल मोड के साथ, सतह रिसेप्टर अंतर्निहित प्लाज्मा झिल्ली और साइटोस्केलेटन द्वारा अनुकूलित कियाजाताहै, जो सबसे अधिक संभावना मापा कश्मीरमोल को प्रभावित करता है।
पुन: उत्पन्नता सुनिश्चित करने के लिए डेटा गुणवत्ता नियंत्रण महत्वपूर्ण है। इस उद्देश्य के लिए, हमने फोर्स बनाम टाइम प्लॉट्स पर डीएफएस डेटा प्री-स्क्रीनिंग और आउटलियर अपवर्जन मापदंड लागू किए हैं । इसे प्रदर्शित करने के लिए, एक प्रतिनिधि डेटासेट का चयन किया गया था, जिसमें हमने डीएफएस कच्चे डेटा को गुणवत्ता के तीन स्तरों में वर्गीकृत किया: अच्छा(चित्रा S2A),शोर के साथ स्वीकार्य(चित्रा S2B),और गरीब अस्वीकार्य(चित्रा S2C)। बीएफपी का उपयोग करने के शुरुआती लोगों के लिए, हम डेटा को अच्छी गुणवत्ता(चित्रा S2A)के साथ प्री-स्क्रीन करने के लिए सख्त मानदंडों की सलाह देतेहैं। ध्यान दें, डेटा पूर्व स्क्रीनिंग मानदंडों के आधार पर, संपीड़न चरण की प्रतिगमन फिट लाइन तन्य चरण की तुलना में खड़ी होनी चाहिए, विशेष रूप से k1 > k2(चित्रा S2C,vii)। जब के1 < k2 (चित्रा S2C,vii) मापा,व्युत्पन्न कश्मीरमोल < 0 कदम 4 में प्रति गणना के औचित्य के खिलाफ है । इसके बाद ऐसी घटनाओं को अमान्य आउटलियर्स माना जाना चाहिए और उन्हें छोड़ दिया जाना चाहिए ।
डेटा अधिग्रहण के दौरान एकल आणविक स्तर पर बीएफपी माप का पक्ष लेने के लिए, पिछले अध्ययन12के अनुसार कई प्रायोगिक विन्यास लागू किए गए हैं। सबसे पहले, मोतियों पर प्रोटीन कोटिंग घनत्व आमतौर पर न्यूनतम स्तर तक नीचे किया जाता है (उदाहरण के लिए 60 माइक्रोन-2)समाधान एकाग्रता, प्रोटीन की मात्रा और प्रतिक्रिया की स्थिति को कड़ाई से नियंत्रित करके15। मनका पर प्रोटीन के बीच औसत स्थानिक दूरी इस प्रकार प्रोटीन के रैखिक आयामों से बहुत बड़ी अनुमानित है, जो एकल आणविक स्तर12,13,14पर हमारे माप के पक्ष में है। दूसरे, हम प्रत्येक लिगांड-रिसेप्टर जोड़ी के लिए आसंजन आवृत्ति को 20% ≤ नियंत्रित करते हैं, जिसके तहत आणविक बाध्यकारी घटनाएं पॉइसन वितरण का पालन करेंगी ≥ ८९% घटनाएं एकल-आणविक बाध्यकारी14,15होंगी। ऐसा करने के लिए, अतिक्रमण बल और संपर्क समय तदनुसार निर्धारित किया जाता है और12प्रयोग भर में सुसंगत होने की जरूरत है । फिर भी, यह अभी भी संभव है कि कई बांड क्रमिक रूप से होते हैं(चित्रा S2C,vi)। ऐसे मामलों में, हम कई बांड के हस्ताक्षर के साथ घटनाओं को त्याग देंगे । अंतिम लेकिन कम से कम, नकारात्मक नियंत्रण प्रयोग गोजातीय सीरम एल्बुमिन(सामग्री की तालिका)या एसए अकेले एसए के साथ लेपित मोतियों के साथ किए जाएंगे ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि गैर-विशिष्ट आसंजन आवृत्ति 2%16, 17≤ है।
यद्यपि बीएफपी जीवित कोशिका सतह10, 11,12पर प्रोटीन गतिशीलता की जांच करनेकेलिए शक्तिशाली है, लेकिन तकनीकी सीमाएं हैं। बीएफपी में एक बार में सिर्फ एक लिगामेंट-रिसेप्टर जोड़ी की जांच की जा सकती है । सांख्यिकीय महत्व के साथ पर्याप्त डेटा प्राप्त करने में समय लगेगा । इसके अलावा, प्रायोगिक प्रक्रियाएं तेजी से सीखने के घटता के साथ श्रम गहन हैं। कार्यान्वयन बुद्धिमान, वर्तमान बीएफपी प्रणाली पर्यावरण बहती और आसपास के यांत्रिक कंपन के लिए अतिसंवेदनशील है। नतीजतन, डीएफएस डेटा गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए निरंतर मैनुअल समायोजन की आवश्यकता होती है। इस उद्देश्य के लिए, हमारे हाल के अध्ययनों में से एक ने बीएफपी फोर्स-क्लैंप डीएफएस की स्थिरता में सुधार करने के लिए अल्ट्रा-स्थिर बीएफपी फीडबैक कंट्रोल एल्गोरिदम पेश किया है4। यह तकनीकी अग्रिम अल्ट्रा-लॉन्ग बॉन्ड लाइफटाइम (>50 एस) के साथ एंटीजन-एंटीबॉडी बाइंडिंग जैसे मजबूत आणविक इंटरैक्शन के माप को सक्षम बनाता है। फिर भी, हमें उम्मीद है कि बीएफपी डेटा अधिग्रहण और डीएफएस विश्लेषण को एक कंप्यूटरीकृत कार्यक्रम में स्वचालित और एकीकृत करने के लिए भविष्य के प्रयास किए जाएंगे, जिससे पूरे बीएफपी ऑपरेशन और डेटा विश्लेषण अधिक उपयोगकर्ता अनुकूल और उच्च-थ्रूपुट बन जाएंगे।
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Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी हितों के लिए वर्तमान अध्ययन के बारे में रिपोर्ट है ।
Acknowledgments
हम सहायक चर्चा के लिए Guillaume Troadec, हार्डवेयर परामर्श के लिए Zihao वांग, और सिडनी विनिर्माण हब, ग्रेग Suaning और साइमन रिंगर हमारे प्रयोगशाला स्टार्टअप के समर्थन के लिए धन्यवाद । इस काम को ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद डिस्कवरी परियोजना (DP200101970-L.A.J.), एनएसडब्ल्यू हृदय क्षमता निर्माण कार्यक्रम (अर्ली-मिड करियर शोधकर्ता अनुदान-ला.जे.), सिडनी रिसर्च एक्सीलरेटर पुरस्कार (चढ़ता-ला जे), रामासिओटी फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था स्वास्थ्य निवेश अनुदान (2020HIG76-L.A.J.), राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद विचार अनुदान (APP2003904-L.J.), और इंजीनियरिंग स्टार्टअप फंड और प्रमुख उपकरण योजना (L.A.J.) के सिडनी संकाय विश्वविद्यालय । अस्तर अर्नोल्ड जू एक ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद DECRA फेलो (DE190100609) है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) | Uct, Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
| BFP data acquisition VI | LabVIEW | BFP control and parameter setting | |
| BFP data analysis VI | LabVIEW | BFP raw data analysis | |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
| Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology, Netherlands | 9002 | Glass bead functionalization |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalization |
| Camera VI | LabVIEW | BFP monitoring | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Tyrode’s buffer preparation |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s buffer preparation |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Glass bead functionalization |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation; Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
| Streptavidin-Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
References
- Chen, Y., et al. Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell. The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975 (2015).
- Su, Q. P., Ju, L. A. Biophysical nanotools for single-molecule dynamics. Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).
- Ju, L. Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds. Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).
- An, C., et al. Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells. Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).
- Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C.
- Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes. Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
- Ju, L., Zhu, C. Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models. Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysical Journal. 68, 2580 (1995).
- Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature Communications. 5, 4886 (2014).
- Passam, F., et al.
- Chen, Y., et al. An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation. Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).
- Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. Force regulated conformational change of integrin αVβ3. Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).
- Liu, B., Chen, W., Zhu, C. Molecular force spectroscopy on cells. Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).
- Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).
- Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ibα. Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).
- Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals. Elife. 5, 15447 (2016).
