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Medicine

जैविक तैयारी और यांत्रिक Zonular फाइबर के Viscoelastic गुणों का निर्धारण करने के लिए तकनीक

Published: December 16, 2021 doi: 10.3791/63171
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 2,4
1Department of Basic Sciences, University of Health Sciences and Pharmacy, 2Department of Ophthalmology & Visual Sciences, Washington University School of Medicine, 3Department of Biomedical Engineering, The Ohio State University, 4Department of Cell Biology & Physiology, Washington University School of Medicine

Summary

प्रोटोकॉल बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स viscoelasticity और प्रोटीन संरचना या पर्यावरणीय कारकों पर इसकी निर्भरता के अध्ययन के लिए एक विधि का वर्णन करता है। लक्षित मैट्रिक्स प्रणाली माउस zonule है. विधि के प्रदर्शन को माइक्रोफिब्रिल-संबद्ध ग्लाइकोप्रोटीन -1 की कमी वाले लोगों के साथ जंगली-प्रकार के ज़ोनुलर फाइबर के व्हिस्कोइलिस्टिक व्यवहार की तुलना करके प्रदर्शित किया जाता है।

Abstract

लोच रक्त वाहिकाओं, मांसपेशियों और फेफड़ों जैसे ऊतकों के कार्य के लिए आवश्यक है। यह गुण ज्यादातर एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) से प्राप्त होता है, प्रोटीन मेशवर्क जो कोशिकाओं और ऊतकों को एक साथ बांधता है। एक ईसीएम नेटवर्क के लोचदार गुण इसकी संरचना से कैसे संबंधित हैं, और क्या ईसीएम के विश्राम गुण एक शारीरिक भूमिका निभाते हैं, ऐसे प्रश्न हैं जिन्हें अभी तक पूरी तरह से संबोधित नहीं किया गया है। चुनौती का हिस्सा अधिकांश ईसीएम प्रणालियों की जटिल वास्तुकला और उनकी संरचना से समझौता किए बिना ईसीएम घटकों को अलग करने में कठिनाई में निहित है। एक अपवाद ज़ोन्यूल है, जो कशेरुकियों की आंखों में पाया जाने वाला एक ईसीएम सिस्टम है। ज़ोन्यूल में सैकड़ों से हजारों माइक्रोमीटर की लंबाई में फाइबर होते हैं जो लेंस और आईवॉल के बीच सेल-मुक्त स्थान को फैलाते हैं। इस रिपोर्ट में, हम एक यांत्रिक तकनीक का वर्णन करते हैं जो ज़ोन्यूल की अत्यधिक संगठित संरचना का लाभ उठाता है ताकि इसके विस्कोइलिस्टिक गुणों को निर्धारित किया जा सके और व्यक्तिगत प्रोटीन घटकों के योगदान को निर्धारित किया जा सके। इस विधि में लेंस और ज़ोन्यूल को उजागर करने के लिए एक निश्चित आंख का विच्छेदन शामिल है और एक पुल-अप तकनीक का उपयोग करता है जो ज़ोनुलर फाइबर को समान रूप से फैलाता है जबकि उनके तनाव की निगरानी की जाती है। तकनीक अपेक्षाकृत सस्ती अभी तक काफी संवेदनशील है जो चूहों में ज़ोनुलर फाइबर के व्हिस्कोइलिस्टिक गुणों में परिवर्तन का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील है, जिसमें विशिष्ट ज़ोनुलर प्रोटीन की कमी है या उम्र बढ़ने के साथ। यद्यपि यहां प्रस्तुत विधि मुख्य रूप से ओकुलर विकास और बीमारी का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन की गई है, यह लोचदार ईसीएम के व्हिस्कोइलिस्टिक गुणों और बाहरी कारकों की भूमिका जैसे आयनिक एकाग्रता, तापमान और सिग्नलिंग अणुओं के साथ बातचीत के बारे में व्यापक प्रश्नों की खोज के लिए एक प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में भी काम कर सकती है।

Introduction

कशेरुक की आंख में एक जीवित ऑप्टिकल लेंस होता है जो रेटिना 1 पर छवियों को केंद्रित करने में मदद करता है। लेंस को ऑप्टिकल अक्ष पर नाजुक, रेडियल रूप से उन्मुख फाइबर की एक प्रणाली द्वारा निलंबित कर दिया जाता है, जैसा कि चित्र 1 ए में दिखाया गया है। एक छोर पर, फाइबर लेंस भूमध्य रेखा से जुड़ते हैं और दूसरे पर, सिलियरी शरीर की सतह पर। उनकी लंबाई चूहों में 150 μm से लेकर मनुष्यों में 1 मिमी तक की दूरी तक फैली हुई है। सामूहिक रूप से, इन तंतुओं को Zinn2 के zonule, ciliary zonule, या बस zonule के रूप में जाना जाता है। ओकुलर आघात, बीमारी, और कुछ आनुवंशिक विकार ज़ोनुलर फाइबर 3 की अखंडता को प्रभावित कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप उनकी अंतिम विफलता और दृष्टि के नुकसान के साथ होता है। चूहों में, तंतुओं में एक कोर होता है जिसमें ज्यादातर प्रोटीन फिब्रिलिन -2 होता है, जो फिब्रिलिन -14 में समृद्ध मेंटल से घिरा होता है। हालांकि ज़ोनुलर फाइबर आंखों के लिए अद्वितीय हैं, वे शरीर में कहीं और पाए जाने वाले इलास्टिन-आधारित ईसीएम फाइबर के लिए कई समानताएं सहन करते हैं। उत्तरार्द्ध एक फाइब्रिलिन -1 मेंटल 5 द्वारा कवर किया गया है और ज़ोनुलर फाइबर 6 के समान आयाम हैं। अन्य प्रोटीन, जैसे अव्यक्त-रूपांतरण विकास कारक β-बाध्यकारी प्रोटीन (LTBPs) और माइक्रोफिब्रिल-संबद्ध ग्लाइकोप्रोटीन -1 (MAGP-1), दोनों प्रकार के तंतुओं के सहयोग से पाए जाते हैं7,8,9,10,11। ज़ोनुलर फाइबर का लोचदार मापांक 0.18-1.50 MPa12,13,14,15,16 की सीमा में है, जो इलास्टिन-आधारित फाइबर (0.3-1.2 MPa) 17 की तुलना में तुलनीय है। ये वास्तुशिल्प और यांत्रिक समानताएं हमें यह विश्वास करने के लिए प्रेरित करती हैं कि ज़ोनुल से जुड़े प्रोटीन की भूमिकाओं में कोई भी अंतर्दृष्टि अन्य ईसीएम लोचदार फाइबर में उनकी भूमिकाओं को स्पष्ट करने में मदद कर सकती है।

यहां वर्णित विधि को विकसित करने का मुख्य उद्देश्य विरासत में मिली आंखों की बीमारी की प्रगति में विशिष्ट ज़ोनुलर प्रोटीन की भूमिका में अंतर्दृष्टि प्राप्त करना है। सामान्य दृष्टिकोण जंगली प्रकार के चूहों में ज़ोनुलर फाइबर के व्हिस्कोइलिस्टिक गुणों की तुलना जीन एन्कोडिंग ज़ोनुलर प्रोटीन में लक्षित उत्परिवर्तन ले जाने वाले चूहों के साथ करना है। जबकि ज़ोनुलर फाइबर के इलास्टो-मैकेनिकल गुणों को मापने के लिए पहले कई तरीकों का उपयोग किया गया है, सभी को बहुत बड़े जानवरों की आंखों के लिए डिज़ाइन किया गया था12,13,14,15,16। इस तरह के मॉडल आनुवंशिक रूप से असभ्य नहीं हैं; हमने एक प्रयोगात्मक विधि विकसित करने की मांग की जो चूहों की छोटी और नाजुक आंखों के लिए बेहतर अनुकूल थी।

माउस ज़ोनुलर फाइबर की विस्कोइलिस्टिसिटी का आकलन करने के लिए हमने जो विधि विकसित की है, वह एक ऐसी तकनीक है जिसे हम पुल-अप परख4,18 के रूप में संदर्भित करते हैं, जिसे चित्रा 1 में नेत्रहीन रूप से संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। पुल-अप विधि और परिणामों के विश्लेषण का एक विस्तृत विवरण नीचे प्रदान किया गया है। हम परियोजना में उपयोग किए जाने वाले तीन-आयामी (3 डी) -मुद्रित भागों सहित उपकरण के निर्माण का वर्णन करके शुरू करते हैं। अगला, हम प्रयोग के लिए आंखों को प्राप्त करने और तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं। अंत में, हम ज़ोनुलर फाइबर के व्हिस्कोइलिस्टिक गुणों के निर्धारण के लिए डेटा प्राप्त करने के तरीके पर चरण-दर-चरण निर्देश प्रदान करते हैं। प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में, हम MAGP-119 की कमी वाले चूहों से ज़ोनुलर फाइबर के व्हिस्कोइलिस्टिक गुणों के साथ-साथ उम्र-मिलान वाले जंगली-प्रकार के जानवरों से प्राप्त एक नियंत्रण सेट पर हमारी विधि के साथ प्राप्त पहले अप्रकाशित डेटा साझा करते हैं। अंत में, हम विधि के फायदों और सीमाओं पर सामान्य टिप्पणियों के साथ निष्कर्ष निकालते हैं, और संभावित प्रयोगों के लिए सुझाव जो स्पष्ट कर सकते हैं कि पर्यावरणीय और जैव रासायनिक कारक ईसीएम फाइबर के व्हिस्कोइलिस्टिक गुणों को कैसे प्रभावित करते हैं।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों को वाशिंगटन विश्वविद्यालय पशु अध्ययन समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में जानवरों के उपयोग के लिए एआरवीओ बयान का पालन किया गया था।

1. विशेष भागों के निर्माण और उपकरण का निर्माण

  1. विशेष भागों का निर्माण
    1. जांच निर्माण. चित्र 2A के बाएं पैनल में दिखाए गए अनुसार एक कोण पर एक कांच की केशिका को पकड़ो। एक सिगरेट लाइटर से एक लौ को एक छोर से लगभग 2 सेमी रखें और इसे तब तक रखें जब तक कि अंत 90 डिग्री तक न झुक जाए, जैसा कि चित्रा 2 ए के दाएं पैनल में दिखाया गया है।
    2. नमूना मंच निर्माण. 3 डी ड्राइंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करते हुए, 30 x 30 x 5 मिमी को मापने वाले एक प्लेटफ़ॉर्म को डिज़ाइन करें और जिसमें व्यास में 2.0, 2.5 और 3.0 मिमी के अर्धगोलाकार इंडेंटेशन शामिल हैं, जैसा कि चित्र 2 बी में दिखाया गया है।
    3. जांच धारक निर्माण. 3 डी ड्राइंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करते हुए, एक माउंट डिज़ाइन करें जो केशिका जांच को रखता है और इसे माइक्रोमैनिपुलेटर से संलग्न करता है (चित्रा 2 सी देखें)।
      नोट:: STL प्रारूप में मंच निर्माण और जांच धारक निर्माण के लिए एक नमूना 3 डी फ़ाइल संबंधित लेखक से अनुरोध पर उपलब्ध है।
    4. नकारात्मक लेंस असेंबली. एक नकारात्मक बेलनाकार लेंस (फोकल लंबाई में -75 मिमी और ऊंचाई और लंबाई में लगभग 50 मिमी) रखें जैसा कि चित्र 1 सी और चित्रा 1 डी में दिखाया गया है ताकि पेट्री डिश में तरल पदार्थ के अतिरिक्त होने के कारण विकृति को सही किया जा सके (तरल पदार्थ के अलावा विच्छेदित आंख के दृश्य को विकृत करता है जब पक्ष से चित्रित किया जाता है)।
    5. 2-slotted ठिकानों में से एक के लिए नकारात्मक लेंस गोंद (आधार पर लेंस की स्थिति के लिए चित्रा 2 डी देखें)।
    6. शेष भागों को इकट्ठा करें जैसा कि चित्र 2D में दिखाया गया है।
    7. पोस्ट की ऊंचाई को समायोजित करें ताकि लेंस मुश्किल से पैमाने पर मंडराए और पोस्ट-होल्डर में पेंच को कस सके।
  2. उपकरण का निर्माण
    1. एक कंप्यूटर पर स्केल, माइक्रोस्कोप कैमरा सॉफ़्टवेयर, और motorized माइक्रोमीटर नियंत्रक अनुप्रयोग के साथ आपूर्ति की लॉगिंग प्रोग्राम स्थापित करें।
    2. मोटरचालित माइक्रोमीटर को सर्वो मोटर नियंत्रक और बाद में कंप्यूटर से कनेक्ट करें। मोटर नियंत्रक अनुप्रयोग प्रारंभ करें और मोटर सेटिंग्स संपादित करें।
      नोट: मोटर सेटिंग्स, जो नीचे सूचीबद्ध हैं, को प्रारंभिक प्रयोगों के बाद चुना गया था, जिससे पता चला कि 10-20 सेकंड के समय पैमाने पर तनाव आराम से किया गया था। इस निर्धारण के आधार पर, हमने एक गति और त्वरण का चयन किया जिसने मोटर को विश्राम समय से छोटे समय में 50 μm विस्थापन को पूरा करने की अनुमति दी, लेकिन नमूने को झटका देने से बचने के लिए बहुत कम नहीं। यहां हमने लगभग 5-10 सेकंड का विस्थापन समय चुना।
    3. अधिकतम वेग को 0.01 mm/s और त्वरण को 0.005 mm/s2 पर सेट करें.
    4. निरीक्षण माइक्रोस्कोप में कैमरा स्थापित करें और कैमरा इमेजिंग सॉफ्टवेयर का परीक्षण करें।
    5. उपकरण के लिए समर्पित बेंच स्पेस पर पैमाने को रखें।
    6. एक पेट्री डिश के लिए एक 3 डी-मुद्रित प्लेटफ़ॉर्म (चरण 1.1.2 से) गोंद करें और कुओं में से एक में 2-3 मिमी ग्लास मनका जोड़ें। पेट्री डिश को पैमाने पर रखें ताकि मनका पैन के केंद्र के पास स्थित हो।
    7. मोटरचालित एक के साथ माइक्रोमैनिपुलेटर से मैनुअल माइक्रोमीटर को बदलें।
    8. जांच धारक में दो 4-40 शिकंजा पेंच. जांच धारक को मैनिपुलेटर से अनुलग्न करें जैसा कि चित्र 1C में दिखाया गया है.
    9. चित्रा 2A में सचित्र के रूप में एक जांच तैयार करें, इसे नीचे की ओर मुड़े हुए हिस्से के साथ जांच धारक के अंदर रखें, और शिकंजा कसें।
    10. मेज पर माइक्रोमैनिपुलेटर को इस तरह से रखें कि जांच की नोक मंच पर मनका के ऊपर हो। प्रयोग के दौरान आकस्मिक आंदोलन को रोकने के लिए माइक्रोमैनिपुलेटर को तालिका में चिपकाएं।
    11. टेबल पर साइड माइक्रोस्कोप को रखें ताकि मनका अपने दृश्य के क्षेत्र के केंद्र में और फोकस में हो।

2. नमूना तैयारी और डेटा अधिग्रहण

  1. नेत्र निर्धारण और विच्छेदन
    1. एक समान C57/ BL6J पृष्ठभूमि पर जंगली प्रकार के चूहों और Magp1-नल जानवरों को बनाए रखें। CO2 साँस लेने से 1 महीने के या 1-वर्षीय चूहों को Euthanize करें।
    2. ठीक संदंश के साथ आंखों को निकालें और 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड / फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस, पीएच 7.4) में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एन्यूक्लिएटेड ग्लोब को ठीक करें। निर्धारण प्रक्रिया के दौरान आंख में 15-20 mmHg का सकारात्मक दबाव बनाए रखें, जैसा कि वर्णित है6।
      नोट: पुरुष चूहों पर प्रयोग किए जाते हैं, ओकुलर ग्लोब के आकार में संभावित सेक्स से संबंधित अंतरों को नियंत्रित करने के लिए। सकारात्मक दबाव यह सुनिश्चित करता है कि ग्लोब फुलाया रहता है, लेंस और आंख की दीवार के बीच के अंतर को संरक्षित करता है जो ज़ोनुलर फाइबर द्वारा फैलाया जाता है।
    3. पीबीएस में 10 मिनट के लिए आंखों को धोएं। नेत्र शल्य चिकित्सा कैंची का उपयोग करना और एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत काम करना, ऑप्टिक तंत्रिका सिर के पास आंख की दीवार में एक पूर्ण मोटाई चीरा बनाएं।
    4. कट को भूमध्य रेखा तक आगे बढ़ाएं, और फिर आंख की भूमध्यरेखीय परिधि के चारों ओर। नाजुक सिलियरी प्रक्रियाओं और संबंधित ज़ोनुलर फाइबर को बचाने के लिए ध्यान रखें।
    5. लेंस की पीछे की सतह को उजागर करते हुए, ग्लोब के पीछे निकालें।
    6. बफर समाधान से एक विच्छेदित आंख को हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें और इसे कॉर्निया के साथ एक सूखे कार्य पोंछे पर रखें। इसे सूखने के लिए पोंछे की सतह पर कॉर्निया को धीरे से खींचें।
    7. प्लेटफ़ॉर्म कुओं में तत्काल गोंद के 3 μL जोड़ें जो पेट्री डिश में आंख को समायोजित करेंगे।
    8. डिश को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप की स्टेज प्लेट पर रखें ताकि गोंद के साथ अच्छी तरह से दृश्य में हो।
    9. पोंछे से आंख को कुएं के किनारे पर स्थानांतरित करें जिसमें गोंद होता है। फिर, ध्यान से आंख को अच्छी तरह से खींचें और जल्दी से इसके अभिविन्यास को समायोजित करें ताकि लेंस का पिछला हिस्सा सबसे ऊपर हो।
    10. लेंस के उजागर पक्ष को धीरे से एक सूखी पोंछे के कोने के साथ ब्लोटिंग करके सुखाएं।
    11. एक 50 मिमी पेट्री डिश के तल पर तत्काल गोंद का एक थपका लागू करें और इसे मंच को सीमेंट करें।
  2. ज़ोनुलर विस्कोइलिस्टिक प्रतिक्रिया का मापन
    1. पैमाने पर चालू करें, स्केल लॉगिंग प्रोग्राम और कैमरा सॉफ़्टवेयर शुरू करें। सुनिश्चित करें कि लॉगिंग प्रोग्राम 30 मिनट के लिए डेटा प्राप्त कर सकता है, क्योंकि कुछ परीक्षण उस लंबे समय तक चल सकते हैं।
    2. सर्वो मोटर नियंत्रक पर स्विच करें और कंप्यूटर पर नियंत्रक अनुप्रयोग प्रारंभ करें। सुनिश्चित करें कि नियंत्रक 50 μm वेतन वृद्धि में चरण 1.2.2 में नोट में उल्लिखित उन लोगों के समान गति पैरामीटर का उपयोग कर ले जाने के लिए सेट किया गया है।
    3. चरण 1.1.1 में वर्णित के रूप में एक केशिका रॉड में एक 90 ° मोड़ बनाएँ।
    4. केशिका जांच धारक में मुड़ी हुई केशिका पर्ची और सुरक्षित शिकंजा कस.
      नोट: नमूना निर्जलीकरण को कम करने के लिए, हम अनुशंसा करते हैं कि चरण 1-4 को आंख विच्छेदन से पहले, या उसके दौरान पूरा किया जाए।
    5. केशिका की नोक पर यूवी-इलाज गोंद का एक छोटा (~ 1 मिमी) मनका जोड़ें।
    6. मैनिपुलेटर पर मैनुअल समायोजन का उपयोग करते हुए, केशिका जांच की नोक को स्थानांतरित करें ताकि यह सीधे लेंस के केंद्र पर हो। जांचें कि क्या यूवी गोंद का निचला हिस्सा लेंस के शीर्ष पर केंद्रित दिखाई देता है जब सामने से देखा जाता है (दृश्य निरीक्षण द्वारा) और पक्ष (माइक्रोस्कोप कैमरे के माध्यम से)।
    7. कैमरे के माध्यम से देखते समय, जांच टिप को कम करें जब तक कि यूवी गोंद लेंस के साथ संपर्क नहीं करता है और इसकी ऊपरी सतह के एक तिहाई से आधे हिस्से को कवर करता है।
    8. गोंद का इलाज करने के लिए एक कम तीव्रता (~ 1 mW), दिशात्मक, निकट-दृश्यमान यूवी (380-400 एनएम) प्रकाश स्रोत का उपयोग करें।
      नोट: ये विनिर्देश प्रोटीन क्रॉसलिंकिंग को प्रेरित करने की क्षमता को कम करते हुए कुछ सेकंड में गोंद का इलाज करने के लिए पर्याप्त हैं। वाणिज्यिक यूवी गोंद पेन के साथ आपूर्ति किए गए यूवी प्रकाश स्रोत इन विनिर्देशों को पूरा करते हैं।
    9. डिश में पीबीएस समाधान जोड़ें जब तक कि आंख कम से कम 2 मिमी की गहराई तक तरल पदार्थ से ढकी न हो।
    10. बेलनाकार लेंस को निरीक्षण माइक्रोस्कोप के सामने रखें और इसे छूने के बिना पेट्री डिश के जितना संभव हो उतना करीब रखें।
    11. साथ ही लॉगिंग प्रोग्राम और एक टाइमर प्रोग्राम शुरू करें। कैमरे का उपयोग करके आंख / जांच की एक तस्वीर लें।
    12. 60 सेकंड के बाद, एक और 50 μm विस्थापन शुरू करें, और उसके बाद प्रयोग पूरा होने तक हर 60 सेकंड में, यानी, जब तक कि सभी फाइबर टूट न जाएं। ध्यान दें कि संकेत प्रयोग के दौरान बफर वाष्पीकरण के कारण आधार रेखा स्तर पर वापस नहीं आएगा। डेटा विश्लेषण के दौरान रीडिंग में आगामी बहाव को सही करें, जैसा कि चरण 2.2.14 में उदाहरण दिया गया है।
    13. एक रन पूरा होने पर, स्केल लॉगिंग डेटा को सहेजें और इसे स्प्रेडशीट के साथ संगत प्रारूप में निर्यात करें, उदाहरण के लिए, एक .csv प्रारूप। रन के दौरान एकत्र किए गए लेंस चित्रों को सहेजें।
    14. किसी स्प्रेडशीट में डेटा आयात करें. वाष्पीकरण के कारण समय के साथ पृष्ठभूमि पढ़ने में बहाव को इंटरपोल करने के लिए पहले और अंतिम पैमाने पर पढ़ने का उपयोग करें ( चित्रा 3 देखें)। प्रत्येक समय बिंदु पर पठन से इंटरपोलेटेड पठन घटाएं।
      नोट: यदि स्प्रेडशीट का उपयोग करते हुए, इंटरपोलेशन को सूत्र = B2 - $B$ 2 + ($B$ 2 - @INDIRECT ("B"&COUNTA(B:B)))/(COUNTA(B:B)-2) * A2 को सेल में पहले स्केल रीडिंग के दाईं ओर दर्ज करके स्वचालित रूप से निष्पादित किया जा सकता है, फिर कर्सर को सेल के दाएं-निचले कोने में ले जाकर और इसे अंतिम डेटा मान तक खींचकर। सूत्र मानता है कि डेटा को कक्ष B2 में दिखाई देने वाले पहले डेटा बिंदु के साथ किसी स्तंभ में व्यवस्थित किया जाता है. यदि वांछित हो, तो चरण 2.2.14 में संसाधित डेटा का विश्लेषण सह-लेखकों में से एक, डॉ मैथ्यू रिले 4 द्वारा विकसित अर्ध-लोचदार व्हिस्कोइलिस्टिक मॉडल के साथ किया जा सकता है।

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Representative Results

यहां वर्णित पुल-अप तकनीक चूहों में ज़ोनुलर फाइबर के व्हिस्कोइलिस्टिक गुणों को निर्धारित करने के लिए एक सीधा दृष्टिकोण प्रदान करती है। संक्षेप में, माउस आंख को पहले शारीरिक इंट्राओकुलर दबाव पर एक फिक्सेटिव के इंजेक्शन द्वारा संरक्षित किया जाता है। यह दृष्टिकोण आंखों की प्राकृतिक मुद्रास्फीति को बनाए रखता है और तंतुओं को ठीक से पूर्व-तनावपूर्ण रखता है (प्रारंभिक प्रयोगों के बाद निर्धारण को स्वीकार्य माना जाता था, यह प्रदर्शित करता है कि यह फाइबर की लोच या ताकत को महत्वपूर्ण रूप से नहीं बदलता है)। माउस आंख के पीछे को तब लेंस और ज़ोनुलर फाइबर को उजागर करने के लिए विच्छेदन द्वारा हटा दिया जाता है जो इसे निलंबित करते हैं। आंख के सामने एक मंच पर चिपकाया जाता है और एक पेट्री डिश के अंदर रखा जाता है जो डिजिटल पैमाने पर रहता है। इसके बाद, एक माइक्रोमैनिपुलेटर से जुड़ी एक कांच की केशिका को लेंस की पीछे की सतह पर सीमेंट किया जाता है। लेंस को तब 50 μm वृद्धि में उठाया जाता है जबकि पैमाने पर बल दर्ज किया जाता है। तैयारी के स्पष्ट वजन में कमी उन बलों के बारे में जानकारी प्रदान करती है जो तंतुओं को फैलाते हैं। प्रत्येक विस्थापन के बाद विस्थापन द्वारा प्रेरित तनाव के किसी भी विश्राम का निरीक्षण करने के लिए लगभग 1 मिनट तक चलने वाली एक संतुलन अवधि होती है। अंत में, परिणामों का विश्लेषण एक अर्ध-रैखिक व्हिस्कोइलिस्टिक मॉडल का उपयोग करके किया जाता है जो विशेष रूप से माउस ज़ोनुलर फाइबर की ज्यामिति और assay4 के लिए पुल की दिशा के लिए डिज़ाइन किया गया है।

हमारी विधि के साथ प्राप्त विशिष्ट व्हिस्कोइलिस्टिक डेटा को चित्र 3 में दिखाया गया है। वक्र उल्टा (नकारात्मक) दिखाई देता है क्योंकि लेंस पर लिफ्ट बल एक बराबर मात्रा में पैमाने पर डिश / प्लेटफ़ॉर्म / आई असेंबली के वजन को कम करता है। प्रतिक्रिया में लेंस के 50 μm ऊर्ध्वाधर विस्थापनों में से प्रत्येक के दौरान तात्कालिक बल स्पाइक्स शामिल हैं, इसके बाद 10 s के क्रम पर जीवनकाल के साथ एक विश्राम चरण होता है। गोजातीय ज़ोनुलर फाइबर 12 के लिए एक समान तनाव छूट देखी गई है। तात्कालिक और आराम बलों का परिमाण प्रत्येक चरण के साथ लगभग 1000 s (~ 800 μm कुल विस्थापन) तक बढ़ जाता है और फिर फाइबर के विफल होने के रूप में ड्रॉप करना शुरू कर देता है। Zonule विफलता 1,500 s समय बिंदु (~ 1.25 मिमी कुल विस्थापन) द्वारा पूरा होता है। ध्यान दें कि प्रयोग के दौरान बफर के वाष्पीकरण के कारण, लेंस को आंख से मुक्त करने के बाद वक्र प्रारंभिक पढ़ने के लिए वापस नहीं आता है।

चित्रा 4 एक Magp-1 नॉकआउट माउस (लाल वक्र) और एक उम्र से मेल खाने वाले जंगली प्रकार के जानवर (नीले वक्र) के लिए प्राप्त प्रतिक्रियाओं के विपरीत है। इन वक्रों को वाष्पीकरण, उल्टे, और द्रव्यमान के कच्चे माप ( चित्रा 3 देखें) के लिए सही किया गया है, अब बल के रूप में व्यक्त किया जाता है (एमएन की इकाइयों के साथ)। Magp-1-depleted zonule (समय 0-600 s) की प्रारंभिक व्हिस्कोइलिस्टिक प्रतिक्रिया जंगली-प्रकार के समान है, यह सुझाव देते हुए कि ज़ोन्यूल के व्हिस्कोइलिस्टिक गुणों को मैगपी -1 की अनुपस्थिति से महत्वपूर्ण रूप से नहीं बदला गया था। हालांकि, फाइबर अपने जंगली-प्रकार के समकक्षों की तुलना में बहुत कम तनाव में टूटने लगते हैं।

विधि की विश्वसनीयता को स्पष्ट करने के लिए, हमने कई जानवरों से उनके तंतुओं के टूटने से पहले आंखों पर लागू अधिकतम तात्कालिक बल पर डेटा एकत्र किया। परिणाम चित्र 5 में दिखाए गए हैं। 1 महीने के चूहों के लिए डेटा उपयोग किए गए नमूनों की अपेक्षाकृत कम संख्या (एन = 5 या 6) के बावजूद माध्य (एसईएम) की मानक त्रुटि के लिए बहुत छोटे मूल्यों को प्रदर्शित करता है, जो उच्च पुनरुत्पादन का सुझाव देता है। परिणामों से संकेत मिलता है कि फाइबर की ताकत दो जीनोटाइप (पी-मान = 2.4 x 10-6) के बीच काफी भिन्न होती है। आंकड़ों में नहीं दिखाए गए परिणाम यह भी बताते हैं कि जंगली-प्रकार के जानवरों के लिए उम्र के साथ बल की ताकत को तोड़ने में एक सूक्ष्म लेकिन सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण वृद्धि हुई है (पी-मान = 0.024)।

पुल-अप विधि भी viscoelastic पैरामीटर है कि अस्थायी प्रतिक्रियाओं में मनाया विविधताओं के लिए खाते के मात्रात्मक अनुमान उत्पन्न कर सकते हैं। तालिका 1 हमारे MAGP-1 डेटा के लिए सबसे अच्छा फिट पैरामीटर को सारांशित करती है, जो पहले वर्णित अर्ध-रैखिक व्हिस्कोइलिस्टिक मॉडल के साथ प्राप्त होती है। परिणामों से पता चलता है कि MAGP-1 विलोपन और उम्र बढ़ने दोनों का ज़ोनुलर फाइबर के कुछ यांत्रिक गुणों पर अत्यधिक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: पुल-अप विधि का एक दृश्य सारांश। (ए) एक कशेरुकी आंख का क्रॉस-अनुभागीय दृश्य जो लेंस और ज़ोनुलर फाइबर दिखाता है जो इसे निलंबित करता है। (बी) लेंस को ऊपर की ओर (कॉर्निया से दूर) विस्थापित करके ज़ोनुलर फाइबर में व्हिस्कोइलिस्टिक व्यवहार का निर्धारण करने के लिए एक सामान्य दृष्टिकोण। (c) एक विच्छेदित आंख का वास्तविक दृश्य एक मंच पर चिपका हुआ है, जिसके लेंस को एक माइक्रोमैनिपुलेटर से जुड़े ग्लास प्रोब द्वारा ऊपर की ओर खींचा जा रहा है। (d) संपूर्ण उपकरण की योजनाबद्ध। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: विभिन्न भागों का निर्माण. (ए) कांच की जांच का निर्माण। एक कांच केशिका को एक कोण पर आयोजित किया जाता है और एक छोर से लगभग 2 सेमी की दूरी पर एक स्थान पर एक लौ लागू की जाती है। कुछ ही सेकंड के भीतर, केशिका का अंत गिरना शुरू हो जाता है। लौ को हटा दिया जाता है जब केशिका का अंत लगभग 90 डिग्री पर मुड़ा होता है। (बी) आंखों के मंच का निर्माण। भाग एक 3 डी stereolithography (SLA) प्रिंटर के साथ गढ़ा गया है. यह 30 x 30 x 5 मिमी को मापता है और इसमें 2.0, 2.5 और 3.0 मिमी व्यास के साथ तीन अर्धगोलाकार इंडेंटेशन होते हैं जिसमें विभिन्न आकारों की विच्छेदित आंखें चिपकी होती हैं। (ग) जांच धारक का निर्माण। यह हिस्सा भी एक 3 डी SLA प्रिंटर के साथ गढ़ा गया था। इसमें दो ओर्थोगोनल, 7.3 मिमी व्यास की छड़ें होती हैं। निचली छड़ में एक 1.5 मिमी बोर और बाहरी सतह पर छेद के माध्यम से दो 2.5 मिमी होते हैं ताकि धातु के शिकंजा को समायोजित किया जा सके जो केशिका जांच को सुरक्षित करते हैं। (d) नकारात्मक लेंस असेंबली। साइड माइक्रोस्कोप द्वारा कैप्चर की गई छवियों में पेट्री डिश और बफर समाधान की वक्रता के कारण एक अस्थिरता विरूपण होता है। लेंस असेंबली को विरूपण की भरपाई करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जिससे साइड माइक्रोस्कोप को तेज फोकस में छवियों को कैप्चर करने की अनुमति मिलती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: परख के साथ प्राप्त ठेठ कच्चे डेटा. दिखाए गए ग्राफ को लॉगिंग सॉफ़्टवेयर के साथ रिकॉर्ड किया गया था जो 0.01 ग्राम सटीकता के साथ डिजिटल पैमाने से डेटा रिकॉर्ड करता है। ग्राफ का बायां किनारा (समय 0) एक उठाने के बल के बिना नमूने के वजन को दर्शाता है। y-अक्ष g में द्रव्यमान को दर्शाता है। लेंस को तब तक 50 μm चरणों में उठाया जाता है जब तक कि सभी ज़ोनुलर फाइबर टूट नहीं जाते हैं और पेट्री डिश फिर से पैमाने पर पूरी तरह से आराम करती है। ध्यान दें कि अंतिम पठन प्रारंभिक पठन से ऑफ़सेट है। ऑफसेट प्रयोग के दौरान बफर समाधान के क्रमिक वाष्पीकरण के कारण होता है और डेटा विश्लेषण के दौरान इसके लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, जैसा कि चरण 2.2.14 में उल्लिखित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: जंगली प्रकार और MAGP-1-कमी वाले चूहों के लिए प्रतिनिधि ज़ोनुलर बल-विस्थापन घटता है। ग्राफ अपनी संतुलन स्थिति से दूर लेंस के असतत विस्थापन के बाद प्राप्त व्हिस्कोइलिस्टिक प्रतिक्रिया की तुलना करता है। एक MAGP-1 नॉकआउट (KO) माउस से एक आंख की प्रतिक्रिया एक उम्र से मेल खाने वाले जंगली-प्रकार के जानवर को उस बिंदु तक ट्रैक करती है जहां नॉकआउट माउस में फाइबर समय से पहले टूट जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: Zonular फाइबर तोड़ने बलों MAGP-1 KO बनाम जंगली प्रकार चूहों के लिए पुल-अप विधि के साथ प्राप्त और दो उम्र में. दिखाए गए सभी माप n = 5 या 6 आंखों पर आधारित हैं, जिसमें त्रुटि सलाखों का मतलब (SEM) की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व किया जाता है। संक्षेप: डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार; KO = MAGP-1 नॉकआउट. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

जीनोटाइप / उम्र G0 (Pa) G∞ (Pa) π (sec) σ f (Pa)
WT 1-महीने औसत 2.34E+05 9.33E+04 16.3 9.61E+05
एसडी 2.83E+04 2.94E+04 3.4 1.25E+05
95% Cl 5.55E+04 5.76E+04 6.7 2.45E+05
KO 1-महीने औसत 2.73E+05 6.74E+04 17.6 4.44E+05
एसडी 6.30E+04 2.06E+04 3.8 7.85E+04
95% Cl 1.23E+05 4.03E+04 7.5 1.54E+05
p मान 0.25 0.12 0.58 0.000022
WT 1-वर्ष औसत 1.98E+05 7.42E+04 17 1.41E+06
एसडी 1.17E+05 2.39E+04 9.1 2.44E+05
95% Cl 2.29E+05 4.69E+04 17.9 4.79E+05
KO 1-वर्ष औसत 1.70E+04 2.46E+04 12.9 5.05E+05
एसडी 9.06E+03 8.04E+03 7.4 1.48E+05
95% Cl 1.78E+04 1.58E+04 14.4 2.91E+05
p मान 0.0063 0.001 0.41 0.000014
p मान, आयु WT 0.46 0.23 0.85 0.002
को 0.0007 0.0068 0.26 0.44

तालिका 1: एक अर्ध-रैखिक विस्कोइलिस्टिक (QLV) मॉडल के साथ प्राप्त व्हिस्कोइलिस्टिक गुण। चित्रा 4 में दिखाए गए लोगों की तरह डेटा स्कैन का विश्लेषण विशेष रूप से पुल-अप परख और माउस ज़ोनुल के लिए विकसित एक क्यूएलवी मॉडल के साथ किया गया था। तात्कालिक (G0) और संतुलन (G∞) कठोरता, विश्राम समय स्थिरांक (π), और अंतिम तन्यता शक्ति (σ f) के लिए सर्वोत्तम फिट पैरामीटर दिखाए गए हैं। संक्षेप: एसडी = मानक विचलन; CI = आत्मविश्वास अंतराल।

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Discussion

ज़ोन्यूल एक असामान्य ईसीएम प्रणाली है जहां फाइबर को सममित रूप से व्यवस्थित किया जाता है और ऑप्टिकल अक्ष के साथ आंखों के लेंस को विस्थापित करके समान रूप से हेरफेर किया जा सकता है। अंतरिक्ष को सेलुलर व्यवधान के बिना भी आसानी से एक्सेस किया जा सकता है, जिससे फाइबर को उनके मूल राज्य के करीब के वातावरण में अध्ययन करने की अनुमति मिलती है। पुल-अप तकनीक चूहों से नाजुक तंतुओं में हेरफेर करने के लिए इस ईसीएम प्रस्तुति का लाभ उठाती है, एक आनुवंशिक रूप से सभ्य प्रणाली, और उनके यांत्रिक गुणों को सटीक रूप से मापती है। इसने हमें ज़ोनुलर फाइबर के बायोमैकेनिकल गुणों के लिए प्रमुख ईसीएम प्रोटीन (फिब्रिलिन -118, एलटीबीपी -24, और एमएजीपी -1 यहां रिपोर्ट किए गए) के योगदान की जांच करने की अनुमति दी है। फाइब्रिलिन -1-कमी वाले चूहों के हमारे विश्लेषण से पता चला है कि ज़ोनुलर फाइबर में फिब्रिलिन -1 की कमी उम्र के साथ कमजोर हो जाती है और अंततः टूट जाती है, जिससे आंख के भीतर लेंस का विस्थापन होता है (मनुष्यों में, एक स्थिति जिसे एक्टोपिया लेंटिस के रूप में जाना जाता है)। गौरतलब है कि लेंस अव्यवस्था भी मारफान सिंड्रोम के रोगियों में एक आम घटना है, जो एफबीएन 1 जीन 20 में उत्परिवर्तन के कारण होने वाली बीमारी है। इस प्रकार, पुल-अप परख चूहों में मानव संयोजी ऊतक रोग के पहलुओं को मॉडल करने का अवसर प्रदान करता है। एलटीपीबी -2 की कमी वाले चूहों में (एक प्रोटीन जिसे माइक्रोफिब्रिल की उत्पत्ति में शामिल माना जाता है), हम यह प्रदर्शित करने में सक्षम थे कि उस प्रोटीन की अनुपस्थिति में ज़ोनुलर फाइबर का उत्पादन किया गया था, लेकिन काफी कम तनाव में टूट गया और अंततः उम्र 4 के साथ विघटित हो गया। इन परिणामों से पता चलता है कि LTBP-2 उनके संश्लेषण के बजाय फाइबर की दीर्घायु में योगदान देता है। वर्तमान अध्ययन में, हमने निर्धारित किया कि एमएजीपी -1-कमी वाले फाइबर में जंगली-प्रकार के फाइबर के समान व्हिस्कोइलिस्टिक गुण थे, लेकिन कम तनाव में टूट गए, जिसमें आगे की उम्र से संबंधित गिरावट का कोई संकेत नहीं था। यह एक मॉडल के अनुरूप होगा जिसमें एमएजीपी -1 की कमी वाले फाइबर विकसित होते ही आंतरिक रूप से कमजोर होते हैं।

हम ध्यान देते हैं कि तालिका 1 में सूचीबद्ध अंतिम तन्यता शक्तियों का अनुमान इस धारणा के तहत लगाया गया है कि फाइबर कहीं मध्य-अवधि में टूट जाते हैं। हालांकि, हम इस संभावना से इनकार नहीं कर सकते हैं कि फाइबर विफलता लेंस की सतह या सिलियरी शरीर पर एंकरेज बिंदुओं से टुकड़ी के कारण होती है। यदि यह मामला था, तो फाइबर की फ्रैक्चर तन्यता शक्ति तालिका 1 में सूचीबद्ध मूल्यों की तुलना में अधिक हो सकती है। इन संभावनाओं के बीच अंतर करने के लिए सूक्ष्म विश्लेषण की आवश्यकता होगी। इस तरह का विश्लेषण तुच्छ से बहुत दूर है क्योंकि इसमें शामिल फाइबर बहुत पतले हैं (~ 0.5-0.6 μm चौड़ाई में) और लगभग सूचकांक-पानी से मेल खाते हैं, जिससे उन्हें अनिवार्य रूप से अदृश्य बना दिया जाता है। इस अतिरिक्त जानकारी की अनुपस्थिति में, हम केवल यह बता सकते हैं कि तालिका 1 में सूचीबद्ध अंतिम तन्यता ताकत उनकी निचली सीमाओं का प्रतिनिधित्व करती है। यह भी दिलचस्प होगा, सिद्धांत रूप में, यह जांचने के लिए कि क्या बल माप इस बात पर निर्भर करता है कि लेंस किस दिशा में खींचा जाता है। व्यवहार में, हालांकि, पूर्वकाल की ओर से लेंस खींचने के लिए तुरंत नीचे झूठ बोलने वाले ज़ोनुलर फाइबर को नुकसान पहुंचाए बिना आईरिस को हटाने की आवश्यकता होगी। इस तरह के सटीक विच्छेदन से परे है कि हम वर्तमान में माउस आंख के साथ क्या प्राप्त कर सकते हैं।

विधि की सापेक्ष सादगी और इसके परिणामों की उच्च पुनरुत्पादकता ईसीएम यांत्रिक गुणों के तुलनात्मक अध्ययन के लिए वांछनीय गुण हैं। इसके अतिरिक्त, जैसा कि यहां प्रदर्शित किया गया है, पुल-अप परख का उपयोग करने के लिए एक विस्कोइलिस्टिक मॉडल को मानते हुए और इसके लिए समय घटता फिटिंग द्वारा विस्कोइलिस्टिक पैरामीटर के पूर्ण मूल्यों को प्राप्त करना भी संभव है। उदाहरण के लिए, एक मानक अर्ध-रैखिक विस्कोइलिस्टिक (क्यूएलवी) मॉडल का उपयोग करके, हम तात्कालिक (जी 0) और संतुलन (जी∞) कठोरता, विश्राम समय स्थिरांक (π), और जंगली-प्रकार के चूहों से ज़ोनुलर फाइबर की अंतिम तन्यता शक्ति (σ एफ) के साथ-साथ एलटीबीपी -24 या एमएजीपी -1 की कमी वाले लोगों के लिए मूल्यों को निकालने में सक्षम थे। दोनों अध्ययनों में जंगली प्रकार के जानवरों के लिए प्राप्त जी 0 और जी∞ मान 6.7 x 104 Pa से 2.3 x 105 Pa तक भिन्न होते हैं, जो मानव, गोजातीय और पोर्सिनी ज़ोनुल्स (1.8 x 105-1.5 x 106 Pa)12,13 से व्युत्पन्न बहुत बड़े फाइबर में पाए जाने वाले लोगों के लिए मोटे तौर पर तुलनीय है। 14,15,16. प्रजातियों के बीच इस समझौते से पता चलता है कि ये इन तंतुओं की सार्वभौमिक विशेषताएं हैं, और हमें विश्वास दिलाता है कि सार्थक व्हिस्कोइलिस्टिक पैरामीटर को हमारी विधि के साथ निकाला जा सकता है।

गुणवत्ता viscoelastic प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम मंच (चरण 2.1.9) से चिपके हुए विच्छेदित आंख का अभिविन्यास है। मामूली झुकाव (10 डिग्री से कम) परिणामों को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करने के लिए प्रकट नहीं होता है। इस सीमा के बाहर किए गए प्रयोग आकृतियों के साथ वक्र उत्पन्न कर सकते हैं जो चित्र 4 में दिखाए गए लोगों से विचलित होते हैं। उदाहरण के लिए, उन वक्रों में से कुछ में एक के बजाय दो व्यापक चोटियां हो सकती हैं।

आदर्श रूप से, इस पेपर में उल्लिखित प्रक्रिया आंखों के निर्धारण के बिना की गई होगी, जो ताजा ज़ोनुलर फाइबर के सच्चे व्हिस्कोइलिस्टिक मापदंडों का आकलन करने की हमारी क्षमता को सीमित करती है। हालांकि, हमारे प्रारंभिक प्रयोगों के बाद पैराफॉर्मेल्डिहाइड-फिक्स्ड और ताजा नमूनों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया गया, हमने निर्धारण को अपनाने का फैसला किया क्योंकि इससे कई फायदे हुए। जैसा कि प्रोटोकॉल में उल्लेख किया गया है, निश्चित ऊतकों का उपयोग पुल-अप प्रयोगों के लिए तंतुओं के मूल खिंचाव को संरक्षित करने में मदद करता है। इसके अतिरिक्त, हमने पाया कि निर्धारण ने आंखों के कैप्सूल में यूवी गोंद के अधिक आसंजन को बढ़ावा दिया, इस प्रकार पुल-अप कार्रवाई के दौरान लेंस से अलग होने वाली जांच की संभावना को कम कर दिया, जैसा कि आमतौर पर ताजा नमूनों के साथ अनुभव किया जाता है (जांच टुकड़ी को बेसलाइन स्तर पर बल की अचानक वापसी के रूप में आसानी से पहचाना जा सकता है)। निर्धारण ने पुल की दिशा में आईवॉल के बकलिंग को भी रोका। इस सीमा के बावजूद, हमारी विधि ज़ोनुलर फाइबर के व्हिस्कोइलिस्टिक गुणों के लिए प्रोटीन घटकों के सापेक्ष योगदान को निर्धारित करने के लिए एक मजबूत दृष्टिकोण प्रदान करती है।

यद्यपि आज तक हमारे काम ने विशिष्ट प्रोटीन के योगदान पर ध्यान केंद्रित किया है, विधि को आसानी से उनके यांत्रिक गुणों पर फाइबर के बाहरी कारकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। ऐसे कारकों में तापमान, पीएच, कैल्शियम एकाग्रता, और क्रॉस-लिंकिंग एंजाइमों की उपस्थिति या अनुपस्थिति शामिल है। विभेदक मोड में हमारी विधि का उपयोग करके उच्च-परिशुद्धता माप प्राप्त किया जा सकता है, यानी, प्रारंभिक तनाव / तनाव के साथ ज़ोनुलर फाइबर को पूर्व-तनाव देकर, और फिर तनाव में अंतर को पढ़ना जो बाहरी स्थितियों को बदलने पर होता है। इनमें से कुछ हस्तक्षेप संभवतः ऊतकों की लोच को प्रभावित कर सकते हैं जो ज़ोन्यूल को घेरते हैं और इसलिए तनाव में परिवर्तन का उत्पादन करते हैं जो ज़ोन्यूल में उत्पन्न लोगों के साथ प्रतिस्पर्धा करते हैं। प्रस्तावित प्रयोगों के लिए उनकी प्रासंगिकता का आकलन करने के लिए अलग-थलग ऊतकों के साथ नियंत्रण माप की आवश्यकता होगी। हम उम्मीद करते हैं कि साइड कैमरे के साथ टिप्पणियों के आधार पर इस तरह के प्रभाव नगण्य हो सकते हैं, यह दिखाते हुए कि सन्निहित ऊतक अत्यधिक कठोर सामग्री के रूप में व्यवहार करते हैं जो अनिवार्य रूप से कोई विरूपण से गुजरते हैं, भले ही ज़ोनुलर फाइबर पूरी तरह से फैले हुए हों।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम NIH R01 EY029130 (S.B.) और P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 और Ines Mandl Research Foundation (R.P..M.), Marfan Foundation, और वाशिंगटन विश्वविद्यालय में नेत्र विज्ञान और दृश्य विज्ञान विभाग के लिए एक अप्रतिबंधित अनुदान द्वारा समर्थित था। जे.आर. को इस परियोजना के समर्थन में स्वास्थ्य विज्ञान और फार्मेसी विश्वविद्यालय से अनुदान भी मिला।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/4-20 hex screws 3/4 inch long Thorlabs SH25S075
1/4-20 nut Hardware store
3D SLA printer Anycubic Photon
4-40 screws 3/8 inch long, 2 Hardware store
Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament WPI 1B120-3
Cyanoacrylate (super) glue Loctite
Digital Scale accurate to 0.01 g Vernier OHAUS Scout 220
Excel Microsoft Spreadsheet
Gas cigarette lighter
Inspection/dissection microscope Amscope SKU: SM-4NTP Working distance ~ 15 cm
Micromanipulator, Economy 4-axis WPI Kite-L
Motorized micrometer Thorlabs Z812B
Negative cylindrical lens Thorlabs LK1431L1 -75 mm focal length
Petri dishes, 50 mm
Post holder, 3 inches Thorlabs PH3
Post, 4 inches Thorlabs TR4
Scale logging software Vernier LoggePro
Servo motor controller Thorlabs KDC101
Servo motor controller software Thorlabs APT
Slotted base, 1 Thorlabs BA1S
Slotted bases, 2 Thorlabs BA2
Stand for micromanipular WPI M-10
USB-camera for microscope Amscope SKU: MD500
UV activated glue with UV source Amazon

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References

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चिकित्सा मुद्दा 178 बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स zonule zonular फाइबर viscoelasticity microfibril-संबद्ध ग्लाइकोप्रोटीन -1 तन्यता शक्ति लोचदार मापांक तनाव विश्राम अर्ध रैखिक viscoelastic मॉडल
जैविक तैयारी और यांत्रिक Zonular फाइबर के Viscoelastic गुणों का निर्धारण करने के लिए तकनीक
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Rodriguez, J., Reilly, M., Mecham, R. P., Bassnett, S. Biological Preparation and Mechanical Technique for Determining Viscoelastic Properties of Zonular Fibers. J. Vis. Exp. (178), e63171, doi:10.3791/63171 (2021).

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