Summary
Протокол описывает метод исследования вязкоупругости внеклеточного матрикса и его зависимости от белкового состава или факторов внешней среды. Целевой матричной системой является зонул мыши. Эффективность метода демонстрируется путем сравнения вязкоупругогого поведения зональных волокон дикого типа с теми, в которых отсутствует микрофибрил-ассоциированный гликопротеин-1.
Abstract
Эластичность имеет важное значение для функции тканей, таких как кровеносные сосуды, мышцы и легкие. Это свойство получено в основном из внеклеточного матрикса (ECM), белковой сетки, которая связывает клетки и ткани вместе. Как упругие свойства сети ECM связаны с ее составом, и играют ли релаксационные свойства ECM физиологическую роль, являются вопросами, которые еще предстоит полностью решить. Часть проблемы заключается в сложной архитектуре большинства ECM-систем и сложности изоляции компонентов ECM без ущерба для их структуры. Одним из исключений является зонула, система ECM, обнаруженная в глазу позвоночных. Зонула содержит волокна длиной от сотен до тысяч микрометров, которые охватывают бесклеточное пространство между линзой и глазной стенкой. В этом отчете мы описываем механический метод, который использует преимущества высокоорганизованной структуры зонулы для количественной оценки ее вязкоупругих свойств и определения вклада отдельных белковых компонентов. Метод включает в себя рассечение фиксированного глаза для обнажения хрусталика и зонулы и использует технику подтягивания, которая растягивает зонулярные волокна одинаково, пока контролируется их натяжение. Метод относительно недорогой, но достаточно чувствительный, чтобы обнаружить изменения в вязкоупругих свойствах зонулярных волокон у мышей, у которых отсутствуют специфические зонулярные белки или при старении. Хотя метод, представленный здесь, предназначен в первую очередь для изучения глазного развития и заболеваний, он также может служить экспериментальной моделью для изучения более широких вопросов, касающихся вязкоупругих свойств упругих ECM и роли внешних факторов, таких как концентрация ионов, температура и взаимодействия с сигнальными молекулами.
Introduction
Глаз позвоночного содержит живую оптическую линзу, которая помогает фокусировать изображения на сетчатке1. Линза подвешена на оптической оси системой тонких, радиально ориентированных волокон, как показано на рисунке 1А. На одном конце волокна прикрепляются к экватору хрусталика, а на другом — к поверхности цилиарного тела. Их длина охватывает расстояния от 150 мкм у мышей до 1 мм у людей. В совокупности эти волокна известны как зонула Zinn2, цилиарная зону или просто зонула. Глазная травма, заболевание и некоторые генетические нарушения могут повлиять на целостность зонулярных волокон3, что приводит к их возможному отказу и сопутствующей потере зрения. У мышей волокна имеют ядро, состоящее в основном из белка фибриллина-2, окруженного мантией, богатой фибриллином-14. Хотя зональные волокна уникальны для глаза, они имеют много общего с волокнами ECM на основе эластина, обнаруженными в других частях тела. Последние покрыты мантией фибриллина-15 и имеют размеры, аналогичные зональным волокнам6. Другие белки, такие как латентно-трансформирующий фактор роста β-связывающие белки (LTBPs) и микрофибрил-ассоциированный гликопротеин-1 (MAGP-1), встречаются в ассоциации с обоими типами волокон7,8,9,10,11. Модуль упругости зональных волокон находится в диапазоне 0,18-1,50 МПа12,13,14,15,16, что сопоставимо с модулем волокон на основе эластина (0,3-1,2 МПа)17. Эти архитектурные и механические сходства заставляют нас полагать, что любое понимание ролей зонул-ассоциированных белков может помочь прояснить их роль в других эластических волокнах ECM.
Основная цель разработки метода, описанного здесь, заключается в том, чтобы получить представление о роли специфических зонулярных белков в прогрессировании наследственного заболевания глаз. Общий подход заключается в сравнении вязкоупругих свойств зональных волокон у мышей дикого типа с свойствами мышей, несущих целевые мутации в генах, кодирующих зонулярные белки. Хотя ранее для измерения эластомеханических свойств зональных волокон использовалось несколько методов, все они были разработаны для глаз гораздо более крупных животных12,13,14,15,16. Поскольку такие модели генетически не поддаются обработке; мы стремились разработать экспериментальный метод, который лучше подходил бы для маленьких и нежных глаз мышей.
Метод, который мы разработали для оценки вязкоупругости зональных волокон мыши, представляет собой метод, который мы называем анализом подтягивания4,18, который обобщен визуально на рисунке 1. Подробное описание метода подтягивания и анализ результатов приводится ниже. Начнем с описания конструкции аппарата, включая трехмерные (3D)-печатные детали, используемые в проекте. Далее мы подробно описываем протокол, используемый для получения и подготовки глаз к эксперименту. Наконец, мы предоставляем пошаговые инструкции о том, как получить данные для определения вязкоупругих свойств зональных волокон. В разделе «Репрезентативные результаты» мы делимся ранее неопубликованными данными, полученными с помощью нашего метода, о вязкоупругих свойствах зональных волокон у мышей, лишенных MAGP-119, а также контрольным набором, полученным от животных дикого типа, соответствующих возрасту. Наконец, мы завершаем общими замечаниями о преимуществах и ограничениях метода, а также предложениями для потенциальных экспериментов, которые могут прояснить, как экологические и биохимические факторы влияют на вязкоупругие свойства волокон ECM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по изучению животных Вашингтонского университета и соответствовали Заявлению ARVO об использовании животных в офтальмологических и зрительных исследованиях.
1. Изготовление специализированных деталей и конструирование аппаратов
- Изготовление специализированных деталей
- Изготовление зонда. Держите стеклянный капилляр под углом, как показано на левой панели рисунка 2A. Поместите пламя от прикуривателя примерно в 2 см от одного конца и держите его там до тех пор, пока конец не согнется на 90°, как показано на правой панели рисунка 2А.
- Пример изготовления платформы. Используя программное обеспечение для 3D-рисования, спроектируйте платформу размером 30 x 30 x 5 мм и содержащую полусферические отступы диаметром 2,0, 2,5 и 3,0 мм, как показано на рисунке 2B.
- Изготовление держателя зонда. Используя программное обеспечение для 3D-рисования, спроектируйте крепление, удерживающее капиллярный зонд, и прикрепите его к микроманипулятору (см. Рисунок 2C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Образец 3D-файла для изготовления платформы и держателя зонда в формате STL доступен по запросу от соответствующего автора. - Отрицательная сборка линзы. Поместите отрицательную цилиндрическую линзу (-75 мм по фокусному расстоянию и примерно 50 мм по высоте и длине), как показано на рисунке 1C и рисунке 1D , чтобы исправить искажение, вызванное добавлением жидкости в чашку Петри (добавление жидкости искажает вид рассеченного глаза при изображении сбоку).
- Приклейте негативную линзу к одному из 2-щелевых оснований (см. Рисунок 2D для позиционирования объектива на основании).
- Соберите оставшиеся детали, как показано на рисунке 2D.
- Отрегулируйте высоту стойки так, чтобы объектив едва нависал над шкалой и затяните винт в держателе.
- Конструкция аппарата
- Установите на компьютер программу регистрации, поставляемую с весами, программное обеспечение камеры микроскопа и приложение контроллера моторизованного микрометра.
- Подключите моторизованный микрометр к контроллеру серводвигателя, а последний к компьютеру. Запустите приложение контроллера двигателя и отредактируйте настройки двигателя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Двигательные настройки, которые перечислены ниже, были выбраны после предварительных экспериментов, которые показали, что напряжения расслабляются на временной шкале 10-20 с. Основываясь на этом определении, мы выбрали скорость и ускорение, которые позволили двигателю выполнить смещение на 50 мкм за время, меньшее, чем время релаксации, но не слишком короткое, чтобы избежать встряхивания образца. Здесь мы выбрали время смещения около 5-10 с. - Установите максимальную скорость 0,01 мм/с, а ускорение 0,005 мм/с2.
- Установите камеру в инспекционный микроскоп и протестируйте программное обеспечение для визуализации камеры.
- Поместите весы на скамейку, отведенную под аппарат.
- Приклейте 3D-печатную платформу (из шага 1.1.2) на чашку Петри и добавьте стеклянную бусину 2-3 мм в одну из скважин. Поместите чашку Петри на весы так, чтобы шарик располагался вблизи центра кастрюли.
- Замените ручной микрометр с микроманипулятора на моторизованный.
- Вкрутите два винта по 4-40 в держатель зонда. Прикрепите держатель зонда к манипулятору, как показано на рисунке 1С.
- Подготовьте зонд, как показано на рисунке 2А, поместите его внутрь держателя зонда изогнутой частью вниз и затяните винты.
- Расположите микроманипулятор на столе так, чтобы кончик зонда находился над шариком на платформе. Прикрепите микроманипулятор к столу, чтобы предотвратить случайное движение во время эксперимента.
- Расположите боковой микроскоп на столе так, чтобы шарик находился в центре поля его зрения и в фокусе.
2. Подготовка образцов и сбор данных
- Фиксация и рассечение глаз
- Поддерживайте мышей дикого типа и животных Magp1-null на идентичном фоне C57/BL6J. Усыпляйте 1-месячных или 1-летних мышей путем вдыхания CO2 .
- Удалите глаза тонкими щипцами и зафиксируйте энуклеированные глобусы при 4 °C в течение ночи в 4% параформальдегиде /фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS, pH 7,4). Поддерживать положительное давление 15-20 мм рт.ст. в глазу во время процесса фиксации, как описано6.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты проводятся на самцах мышей, чтобы контролировать возможные половые различия в размерах глазного шара. Положительное давление гарантирует, что земной шар остается раздутым, сохраняя зазор между хрусталиком и стенкой глаза, охватываемый зональными волокнами. - Промывайте глаза в течение 10 мин в PBS. Используя офтальмологические хирургические ножницы и работая под стереомикроскопом, сделайте разрез полной толщины в стенке глаза возле головки зрительного нерва.
- Вытяните разрез вперед к экватору, а затем вокруг экваториальной окружности глаза. Позаботьтесь о том, чтобы сохранить деликатные цилиарные процессы и связанные с ними зональные волокна.
- Снимите заднюю часть земного шара, обнажив заднюю поверхность хрусталика.
- Используйте щипцы, чтобы удалить рассеченный глаз из буферного раствора и поместить его на сухую салфетку с роговицей вниз. Осторожно перетащите роговицу по поверхности салфетки, чтобы высушить ее.
- Добавьте 3 мкл мгновенного клея в колодцы платформы, которые будут вмещать глаз в чашку Петри.
- Поместите блюдо на сценическую пластину стереомикроскопа так, чтобы колодец с клеем был в поле зрения.
- Перенесите глаз от салфетки к краю лунки, содержащей клей. Затем осторожно перетащите глаз в колодец и быстро отрегулируйте его ориентацию так, чтобы задняя часть объектива была самой верхней.
- Высушите открытую сторону хрусталика, аккуратно промокав ее уголком сухой салфетки.
- Нанесите мазок мгновенного клея на дно 50-миллиметровой чашки Петри и зацементируйте к ней платформу.
- Измерение зонального вязкоупругого отклика
- Включите шкалу, запустите программу регистрации масштаба и программное обеспечение камеры. Убедитесь, что программа ведения журнала может получать данные в течение 30 минут, так как некоторые испытания могут длиться так долго.
- Включите контроллер серводвигателя и запустите приложение контроллера на компьютере. Убедитесь, что контроллер настроен на перемещение с шагом 50 мкм, используя параметры движения, аналогичные тем, которые описаны в ПРИМЕЧАНИИ на шаге 1.2.2.
- Создайте изгиб на 90° в капиллярном стержне, как описано в шаге 1.1.1.
- Вставьте изогнутый капилляр в держатель капиллярного зонда и затяните крепежные винты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму обезвоживание образца, мы рекомендуем выполнить шаги 1-4 до или во время рассечения глаз. - Добавьте небольшой (~1 мм) шарик УФ-отверждающего клея к кончику капилляра.
- Используя ручные регулировки на манипуляторе, переместите наконечник капиллярного зонда так, чтобы он находился непосредственно над центром линзы. Проверьте, кажется ли нижняя часть УФ-клея центрированной над верхней частью объектива при взгляде спереди (визуальным осмотром) и сбоку (через камеру микроскопа).
- Глядя через камеру, опустите наконечник зонда до тех пор, пока ультрафиолетовый клей не вступит в контакт с объективом и не покроет от одной трети до половины его верхней поверхности.
- Используйте низкоинтенсивный (~ 1 мВт), направленный, почти видимый УФ-источник света (380-400 нм) для отверждения клея.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этих спецификаций достаточно, чтобы вылечить клей за несколько секунд, сводя к минимуму возможность индуцирования сшивки белка. Источники ультрафиолетового света, поставляемые с коммерческими УФ-клеевыми ручками, соответствуют этим спецификациям. - Добавьте раствор PBS в блюдо до тех пор, пока глаз не будет покрыт жидкостью на глубину не менее 2 мм.
- Поместите цилиндрическую линзу перед смотровым микроскопом и как можно ближе к чашке Петри, не прикасаясь к ней.
- Одновременно запустите программу ведения журнала и программу таймера. Сделайте снимок глаза/зонда с помощью камеры.
- Через 60 с инициируют еще одно смещение на 50 мкм, а затем каждые 60 с до завершения эксперимента, т. е. до тех пор, пока все волокна не будут разорваны. Обратите внимание, что сигнал не вернется к исходным уровням из-за буферного испарения во время эксперимента. Исправьте последующий дрейф показаний во время анализа данных, как показано на этапе 2.2.14.
- По завершении выполнения сохраните данные журналирования масштаба и экспортируйте их в формат, совместимый с электронной таблицей, например, формат .csv. Сохраните снимки объектива, которые были собраны во время пробега.
- Импорт данных в электронную таблицу. Используйте первое и последнее показание шкалы для интерполяции дрейфа в фоновом чтении с течением времени из-за испарения (см. Рисунок 3). Вычтите интерполированное чтение из показаний в каждой точке времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании электронной таблицы интерполяцию можно выполнить автоматически, введя формулу = B2 - $B$2 + ($B$2 - @INDIRECT("B"&COUNTA(B:B)))/(COUNTA(B:B)-2) * A2 в ячейку справа от первого чтения шкалы, затем переместив курсор в правый-нижний угол ячейки и перетащив его вниз к последнему значению данных. Формула предполагает, что данные организованы в столбец с первой точкой данных, появляющейся в ячейке B2. При желании данные, обработанные на этапе 2.2.14, могут быть проанализированы с помощью квазиупругой вязкоупругой модели, разработанной одним из соавторов, доктором Мэтью Райли4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описанный здесь метод подтягивания обеспечивает простой подход к определению вязкоупругих свойств зональных волокон у мышей. Короче говоря, глаз мыши сначала сохраняется путем инъекции фиксатора при физиологическом внутриглазном давлении. Этот подход поддерживает естественную инфляцию глаза и поддерживает волокна должным образом предварительно натянутыми (фиксация была признана приемлемой после предварительных экспериментов, которые показали, что она существенно не изменяет эластичность или прочность волокон). Задняя часть глаза мыши затем удаляется путем рассечения, чтобы обнажить хрусталик и зональные волокна, которые его подвешивают. Передняя часть глаза прикреплена к платформе и помещена внутрь чашки Петри, которая опирается на цифровую шкалу. Далее стеклянный капилляр, прикрепленный к микроманипулятору, цементируется к задней поверхности хрусталика. Затем линза поднимается с шагом 50 мкм, в то время как сила на шкале регистрируется. Уменьшение кажущегося веса препарата дает информацию о силах, растягивающих волокна. За каждым смещением следует период равновесия продолжительностью около 1 мин, чтобы наблюдать любое ослабление напряжения, вызванного смещением. Наконец, результаты анализируются с использованием квазилинейной вязкоупругой модели, разработанной специально для геометрии зональных волокон мыши и направления втягивания для анализа4.
Типичные вязкоупругие данные, полученные с помощью нашего метода, показаны на рисунке 3. Кривая выглядит перевернутой (отрицательной), так как подъемная сила на линзе уменьшает вес тарелки/платформы/глазного узла на весах на эквивалентную величину. Реакция включает мгновенные всплески силы во время каждого из 50-мкм вертикальных смещений линзы, за которыми следует фаза релаксации со сроком службы порядка 10 с. Аналогичное расслабление стресса наблюдалось для зональных волокон крупного рогатого скота12. Величина мгновенных и расслабленных сил увеличивается с каждым шагом примерно до 1000 с (~ 800 мкм полного смещения), а затем начинает падать, когда волокна начинают выходить из строя. Отказ Zonule завершается к точке времени 1 500 с (общее смещение ~ 1,25 мм). Отметим, что из-за испарения буфера в ходе эксперимента кривая не возвращается к первоначальным показаниям после освобождения хрусталика от глаза.
Рисунок 4 противопоставляет ответы, полученные для нокаутирующей мыши Magp-1 (красная кривая) и соответствующего возрасту животного дикого типа (синяя кривая). Эти кривые были скорректированы для испарения, инвертированы, и необработанные измерения массы (см. Рисунок 3) теперь выражаются как сила (с единицами мН). Начальная вязкоупругая реакция истощенной магпа-1 зонулы (время 0-600 с) очень напоминает реакцию дикого типа, предполагая, что вязкоупругие свойства зонулы не были существенно изменены отсутствием Magp-1. Тем не менее, волокна, по-видимому, разрываются при гораздо более низком напряжении по сравнению с их аналогами дикого типа.
Чтобы проиллюстрировать надежность метода, мы собрали данные от нескольких животных о максимальной мгновенной силе, приложенной к глазам до того, как их волокна разорвались. Результаты показаны на рисунке 5. Данные для 1-месячных мышей демонстрируют очень небольшие значения стандартной погрешности среднего значения (SEM), несмотря на относительно низкое количество используемых образцов (n = 5 или 6), что свидетельствует о высокой воспроизводимости. Результаты показывают, что прочность волокон существенно различается между двумя генотипами (p-значение = 2,4 х 10-6). Результаты, не показанные на рисунках, также свидетельствуют о том, что существует тонкое, но статистически значимое увеличение силы разрушения с возрастом для диких животных (p-значение = 0,024).
Метод подтягивания также может генерировать количественные оценки вязкоупругих параметров, которые учитывают наблюдаемые изменения во временных реакциях. В таблице 1 обобщены наиболее подходящие параметры к нашим данным MAGP-1, полученным с помощью квазилинейной вязкоупругой модели, описанной ранее4. Результаты показывают, что как делеция MAGP-1, так и старение могут оказывать весьма значительное влияние на некоторые механические свойства зональных волокон.
Рисунок 1: Визуальная сводка метода подтягивания. (A) Поперечный вид глаза позвоночных, показывающий хрусталик и зональные волокна, которые его подвешивают. (B) Общий подход к определению вязкоупругогого поведения в зонулярных волокнах путем смещения хрусталика вверх (от роговицы). (C) Фактический вид рассеченного глаза, приклеенного к платформе, с его линзой, вытянутой вверх стеклянным зондом, прикрепленным к микроманипулятору. D) Схема всего аппарата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Изготовление различных деталей. (А) Изготовление стеклянного зонда. Стеклянный капилляр удерживается под углом, а пламя наносится на место примерно в 2 см от одного конца. В течение нескольких секунд конец капилляра начинает падать. Пламя удаляется, когда конец капилляра изгибается примерно на 90°. (B) Изготовление глазной платформы. Деталь изготовлена с помощью 3D-стереолитографического (SLA) принтера. Он имеет размеры 30 х 30 х 5 мм и содержит три полусферических углубления диаметром 2,0, 2,5 и 3,0 мм, в которые вклеены рассеченные глаза различных размеров. (C) Изготовление держателя зонда. Эта деталь также была изготовлена с помощью 3D-принтера SLA. Он состоит из двух ортогональных стержней диаметром 7,3 мм. Нижний стержень содержит отверстие 1,5 мм и два сквозных отверстия по 2,5 мм на внешней поверхности для размещения металлических винтов, которые закрепляют капиллярный зонд на месте. (D) Отрицательная линза в сборе. Изображения, снятые боковым микроскопом, содержат астигматическое искажение из-за кривизны чашки Петри и буферного раствора. Объектив в сборе предназначен для компенсации искажений, позволяя боковому микроскопу захватывать изображения в резком фокусе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Типичные необработанные данные, полученные с помощью анализа. Показанный график был записан с помощью программного обеспечения для регистрации, которое записывает данные из цифровой шкалы с точностью 0,01 g. Левый край графика (время 0) отражает вес образца без подъемной силы. Ось Y изображает массу в g. Затем хрусталик поднимается с шагом 50 мкм до тех пор, пока все зонулярные волокна не будут разорваны, и чашка Петри снова полностью упирается в весы. Обратите внимание, что конечное значение смещено от начального значения. Смещение обусловлено постепенным испарением буферного раствора в ходе эксперимента и может быть учтено в ходе анализа данных, как описано на этапе 2.2.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные зональные кривые смещения силы для мышей дикого типа и с дефицитом MAGP-1. График сравнивает вязкоупругий отклик, полученный после дискретных перемещений линзы от ее равновесного положения. Реакция глаза нокаутирующей мыши MAGP-1 (KO) отслеживает реакцию животного дикого типа, соответствующего возрасту, до такой степени, что волокна в нокаутирующей мыши преждевременно ломаются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Зонулярные силы разрушения волокна, полученные методом подтягивания для MAGP-1 KO по сравнению с мышами дикого типа и в двух возрастах. Все показанные измерения основаны на n = 5 или 6 глаз, с полосами погрешностей, представляющими стандартную погрешность среднего значения (SEM). Сокращения: WT = дикий тип; НОКАУТ = нокаут МАГП-1 . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Генотип/возраст | G0 (Па) | Г∞ (Па) | Ʈ (сек) | σ ф (Па) | |
| WT 1 месяц | ЗНАЧИТЬ | 2.34Е+05 | 9.33Е+04 | 16.3 | 9.61E+05 |
| СД | 2.83Е+04 | 2.94Е+04 | 3.4 | 1.25E+05 | |
| 95% Cl | 5.55E+04 | 5.76Е+04 | 6.7 | 2.45E+05 | |
| КО 1 месяц | ЗНАЧИТЬ | 2.73Е+05 | 6.74Е+04 | 17.6 | 4.44Е+05 |
| СД | 6.30Е+04 | 2.06Е+04 | 3.8 | 7.85Е+04 | |
| 95% Cl | 1.23E+05 | 4.03Е+04 | 7.5 | 1.54E+05 | |
| Значения p | 0.25 | 0.12 | 0.58 | 0.000022 | |
| WT 1 год | ЗНАЧИТЬ | 1.98Е+05 | 7.42Е+04 | 17 | 1.41Е+06 |
| СД | 1.17Е+05 | 2.39Е+04 | 9.1 | 2.44Е+05 | |
| 95% Cl | 2.29Е+05 | 4.69Е+04 | 17.9 | 4.79Е+05 | |
| КО 1 год | ЗНАЧИТЬ | 1.70E+04 | 2.46Е+04 | 12.9 | 5.05Е+05 |
| СД | 9.06Е+03 | 8.04Е+03 | 7.4 | 1.48Е+05 | |
| 95% Cl | 1.78Е+04 | 1.58Е+04 | 14.4 | 2.91Е+05 | |
| Значения p | 0.0063 | 0.001 | 0.41 | 0.000014 | |
| значения p, возраст | ВТ | 0.46 | 0.23 | 0.85 | 0.002 |
| КО | 0.0007 | 0.0068 | 0.26 | 0.44 | |
Таблица 1: Вязкоупругие свойства, полученные с помощью квазилинейной вязкоупругой (QLV) модели. Сканирование данных, подобное показанному на рисунке 4 , было проанализировано с помощью модели QLV, разработанной специально для подтягивающего анализа и зонула мыши. Показаны наилучшие параметры соответствия для мгновенной (G0) и равновесной (G∞) жесткости, константы времени релаксации (τ) и предельной прочности на растяжение (σ f). Сокращения: SD = стандартное отклонение; CI = доверительный интервал.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Зонула представляет собой необычную систему ECM, где волокна расположены симметрично и ими можно манипулировать идентично, смещая глазную линзу вдоль оптической оси. Пространство также может быть легко доступно без клеточного разрушения, что позволяет изучать волокна в среде, близкой к их родному состоянию. Метод подтягивания использует эту презентацию ECM для манипулирования тонкими волокнами мышей, генетически поддающейся обработке системой, и точной количественной оценки их механических свойств. Это позволило нам изучить вклад ключевых белков ECM (фибриллин-118, LTBP-24 и MAGP-1, о которых сообщается здесь) в биомеханические свойства зонулярных волокон. Наш анализ мышей с дефицитом фибриллина-1 показал, что зонулярные волокна, в которых отсутствует фибриллин-1, ослабевают с возрастом и в конечном итоге разрываются, что приводит к смещению хрусталика в глазу (у людей состояние, известное как ectopia lentis). Примечательно, что вывих хрусталика также является распространенным явлением у пациентов с синдромом Марфана, заболеванием, вызванным мутациями в гене FBN120. Таким образом, подтягивающий анализ дает возможность смоделировать аспекты заболевания соединительной ткани человека у мышей. У мышей, у которых отсутствовал LTPB-2 (белок, который, как считается, участвует в генезисе микрофибрилл), мы смогли продемонстрировать, что зональные волокна были получены в отсутствие этого белка, но разорвались при значительно меньших стрессах и в конечном итоге распадались с возрастом 4. Эти результаты свидетельствуют о том, что LTBP-2 способствует долговечности волокон, а не их синтезу. В текущем исследовании мы определили, что волокна с дефицитом MAGP-1 обладали вязкоупругими свойствами, аналогичными волокнам дикого типа, но разрывались при более низких напряжениях, без признаков дальнейшей возрастной деградации. Это согласуется с моделью, в которой волокна, лишенные MAGP-1, по своей сути слабее, как только они развиваются.
Отметим, что предел прочности на растяжение, перечисленный в таблице 1 , оценивается исходя из предположения, что волокна ломаются где-то в середине пролета. Однако мы не можем исключить возможность того, что разрушение волокна происходит из-за отрыва от точек крепления на поверхности линзы или цилиарном теле. Если бы это было так, то прочность волокна на растяжение на разрыв могла бы быть выше значений, перечисленных в таблице 1. Для различения этих возможностей потребуется микроскопический анализ. Такой анализ далеко не тривиален, поскольку задействованные волокна очень тонкие (~ 0,5-0,6 мкм в ширину) и почти соответствуют индексу воды, что делает их по существу невидимыми. В отсутствие этой дополнительной информации мы можем лишь констатировать, что пределы прочности на растяжение, перечисленные в таблице 1 , представляют собой их нижние пределы. Также было бы интересно, в принципе, проверить, отличаются ли измерения силы в зависимости от того, в каком направлении тянется объектив. На практике, однако, вытягивание линзы с передней стороны потребует удаления радужной оболочки, не повреждая зонулярные волокна, лежащие непосредственно под ней. Такое точное рассечение выходит за рамки того, чего мы можем достичь в настоящее время с помощью мышиного глаза.
Относительная простота метода и высокая воспроизводимость его результатов являются желательными качествами для сравнительных исследований механических свойств ЭВМ. Кроме того, как показано здесь, можно также использовать подтягивающий анализ для получения абсолютных значений вязкоупругих параметров, предполагая вязкоупругую модель и подгоняя к ней кривые времени. Например, используя стандартную квазилинейную вязкоупругую (QLV) модель, мы смогли извлечь значения для мгновенных (G0) и равновесных (G∞) жесткостей, константы времени релаксации (τ) и предельной прочности на растяжение (σ f) зональных волокон у мышей дикого типа, а также у мышей, у которых отсутствует LTBP-24 или MAGP-1. Значения G0 и G∞, полученные для диких животных в обоих исследованиях, варьируются от 6,7 х 104 Па до 2,3 х 105 Па, диапазон, в целом сопоставимый с теми, которые обнаружены в гораздо более крупных волокнах, полученных из зонул человека, крупного рогатого скота и свиней (1,8 х 105-1,5 х 106 Па) 12,13, 14,15,16. Это соглашение между видами предполагает, что это универсальные особенности этих волокон, и дает нам уверенность в том, что значимые вязкоупругие параметры могут быть извлечены с помощью нашего метода.
Критическим этапом для получения качественных вязкоупругих откликов является ориентация рассеченного глаза, приклеенного к платформе (этап 2.1.9). Незначительный наклон (менее 10°), по-видимому, не оказывает существенного влияния на результаты. Эксперименты, выполненные за пределами этого предела, могут генерировать кривые с формами, которые отклоняются от показанных на рисунке 4. Например, некоторые из этих кривых могут иметь два широких пика вместо одного.
В идеале процедура, описанная в этой статье, должна была быть выполнена без фиксации глаз, что ограничивает нашу способность оценивать истинные вязкоупругие параметры свежих зональных волокон. Однако после того, как наши предварительные эксперименты не показали существенной разницы между параформальдегидно-фиксированными и свежими образцами, мы решили принять фиксацию, поскольку она давала несколько преимуществ. Как упоминается в Протоколе, использование фиксированных тканей помогает сохранить нативное растяжение волокон для экспериментов по подтягиванию. Кроме того, мы обнаружили, что фиксация способствует большей адгезии УФ-клея к глазной капсуле, тем самым уменьшая шансы отсоединения зонда от линзы во время действия подтягивания, как это обычно наблюдается со свежими образцами (отслоение зонда может быть легко распознано как внезапное возвращение силы к исходному уровню). Фиксация также предотвращала изгиб глазной стенки в направлении тяги. Несмотря на это ограничение, наш метод обеспечивает надежный подход к определению относительного вклада белковых компонентов в вязкоупругие свойства зональных волокон.
Хотя наша работа на сегодняшний день сосредоточена на вкладе конкретных белков, метод может быть легко адаптирован для изучения влияния факторов, внешних по отношению к волокнам, на их механические свойства. К таким факторам относятся температура, рН, концентрация кальция, а также наличие или отсутствие сшивающих ферментов. Высокоточные измерения могут быть достигнуты с использованием нашего метода в дифференциальном режиме, то есть путем предварительного натяжения зональных волокон с начальным напряжением / деформацией, а затем считывания разницы в напряжении, которая возникает при изменении внешних условий. Некоторые из этих вмешательств могут предположительно влиять на эластичность тканей, которые окружают зонул, и, следовательно, вызывать изменения напряжения, которые конкурируют с теми, которые генерируются в зонуле. Контрольные измерения с изолированными тканями понадобятся для оценки их значимости для предлагаемых экспериментов. Мы ожидаем, что такие эффекты могут быть незначительными, основываясь на наблюдениях с боковой камерой, показывающих, что смежные ткани ведут себя как очень жесткие материалы, которые по существу не подвергаются деформации, даже когда зонулярные волокна полностью растянуты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH R01 EY029130 (S.B.) и P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 и Инес Мандл Research Foundation (R.P.M.), Фондом Марфана, а также неограниченным грантом Департаменту офтальмологии и визуальных наук Вашингтонского университета от Исследований по предотвращению слепоты. J.R. также получил грант от Университета медицинских наук и фармации в поддержку этого проекта.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4-20 hex screws 3/4 inch long | Thorlabs | SH25S075 | |
| 1/4-20 nut | Hardware store | ||
| 3D SLA printer | Anycubic | Photon | |
| 4-40 screws 3/8 inch long, 2 | Hardware store | ||
| Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament | WPI | 1B120-3 | |
| Cyanoacrylate (super) glue | Loctite | ||
| Digital Scale accurate to 0.01 g | Vernier | OHAUS Scout 220 | |
| Excel | Microsoft | Spreadsheet | |
| Gas cigarette lighter | |||
| Inspection/dissection microscope | Amscope | SKU: SM-4NTP | Working distance ~ 15 cm |
| Micromanipulator, Economy 4-axis | WPI | Kite-L | |
| Motorized micrometer | Thorlabs | Z812B | |
| Negative cylindrical lens | Thorlabs | LK1431L1 | -75 mm focal length |
| Petri dishes, 50 mm | |||
| Post holder, 3 inches | Thorlabs | PH3 | |
| Post, 4 inches | Thorlabs | TR4 | |
| Scale logging software | Vernier | LoggePro | |
| Servo motor controller | Thorlabs | KDC101 | |
| Servo motor controller software | Thorlabs | APT | |
| Slotted base, 1 | Thorlabs | BA1S | |
| Slotted bases, 2 | Thorlabs | BA2 | |
| Stand for micromanipular | WPI | M-10 | |
| USB-camera for microscope | Amscope | SKU: MD500 | |
| UV activated glue with UV source | Amazon |
References
- Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: structural determinants of eye lens transparency. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
- Bassnett, S.
- Dureau, P.
- Shi, Y., et al. Latent-transforming growth factor beta-binding protein-2 (LTBP-2) is required for longevity but not for development of zonular fibers. Matrix Biology. 95, 15-31 (2021).
- Ushiki, T. Collagen fibers, reticular fibers and elastic fibers. A comprehensive understanding from a morphological viewpoint. Archives of Histology and Cytology. 65 (2), 109-126 (2002).
- Bassnett, S. A method for preserving and visualizing the three-dimensional structure of the mouse zonule. Experimental Eye Research. 185, 107685 (2019).
- Todorovic, V., Rifkin, D. B. LTBPs, more than just an escort service. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (2), 410-418 (2012).
- Mecham, R. P., Gibson, M. A. The microfibril-associated glycoproteins (MAGPs) and the microfibrillar niche. Matrix Biology. 47, 13-33 (2015).
- Hubmacher, D., Reinhardt, D. P., Plesec, T., Schenke-Layland, K., Apte, S. S. Human eye development is characterized by coordinated expression of fibrillin isoforms. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (12), 7934-7944 (2014).
- Inoue, T., et al. Latent TGF-β binding protein-2 is essential for the development of ciliary zonule microfibrils. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5672-5682 (2014).
- De Maria, A., Wilmarth, P. A., David, L. L., Bassnett, S. Proteomic analysis of the bovine and human ciliary zonule. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 573-585 (2017).
- Wright, D. M., Duance, V. C., Wess, T. J., Kielty, C. M., Purslow, P. P. The supramolecular organization of fibrillin-rich microfibrils determines the mechanical properties of bovine zonular filaments. Journal of Experimental Biology. 202 (21), 3011-3020 (1999).
- Bocskai, Z. I., Sandor, G. L., Kiss, Z., Bojtar, I., Nagy, Z. Z. Evaluation of the mechanical behaviour and estimation of the elastic properties of porcine zonular fibres. Journal of Biomechanics. 47 (13), 3264-3271 (2014).
- Fisher, R. F.
- Michael, R., et al. Elastic properties of human lens zonules as a function of age in presbyopes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (10), 6109-6114 (2012).
- van Alphen, G. W., Graebel, W. P.
- Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).
- Jones, W., Rodriguez, J., Bassnett, S. Targeted deletion of fibrillin-1 in the mouse eye results in ectopia lentis and other ocular phenotypes associated with Marfan syndrome. Disease Models & Mechanisms. 12 (1), 037283 (2019).
- Weinbaum, J. S., et al. Deficiency in microfibril-associated glycoprotein-1 leads to complex phenotypes in multiple organ systems. Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25533-25543 (2008).
- Comeglio, P., Evans, A. L., Brice, G., Cooling, R. J., Child, A. H. Identification of FBN1 gene mutations in patients with ectopia lentis and marfanoid habitus. British Journal of Ophthalmology. 86 (12), 1359-1362 (2002).
