Summary
Protokol, hücre dışı matris viskoelastisitesinin incelenmesi ve protein bileşimine veya çevresel faktörlere bağımlılığı için bir yöntem tanımlamaktadır. Hedeflenen matris sistemi fare zonule'sidir. Yöntemin performansı, vahşi tip zonular liflerin viskoelastik davranışı ile mikrofibril ilişkili glikoprotein-1'den yoksun olanlar karşılaştırılarak gösterilmiştir.
Abstract
Elastikiyet kan damarları, kaslar ve akciğerler gibi dokuların işlevi için gereklidir. Bu özellik çoğunlukla hücre ve dokuları birbirine bağlayan protein meshwork olan hücre dışı matristen (ECM) türetilmiştir. Bir ECM ağının elastik özelliklerinin bileşimiyle nasıl ilişkili olduğu ve ECM'nin gevşeme özelliklerinin fizyolojik bir rol oynayıp oynamadığı, henüz tam olarak ele alınmamış sorulardır. Zorluğun bir kısmı, çoğu ECM sisteminin karmaşık mimarisinde ve ECM bileşenlerinin yapılarından ödün vermeden izole edilmesindeki zorlukta yatmaktadır. Bunun bir istisnası, omurgalıların gözünde bulunan bir ECM sistemi olan zonule'dir. Zonule, lens ve göz duvarı arasındaki hücresiz boşluğu kapsayan yüzlerce ila binlerce mikrometre uzunluğunda liflerden oluşur. Bu raporda, viskoelastik özelliklerini ölçmek ve bireysel protein bileşenlerinin katkısını belirlemek için zonulün son derece organize yapısından yararlanan mekanik bir tekniği açıklıyoruz. Yöntem, lensi ve zonuleyi açığa çıkarmak için sabit bir gözün diseksiyonu içerir ve gerginlikleri izlenirken zonular lifleri eşit olarak uzatan bir barfiks tekniği kullanır. Teknik nispeten ucuzdur, ancak belirli zonular proteinlerden yoksun veya yaşlanmaya sahip farelerde zonular liflerin viskoelastik özelliklerindeki değişiklikleri tespit edecek kadar hassastır. Burada sunulan yöntem öncelikle oküler gelişim ve hastalığı incelemek için tasarlanmış olsa da, elastik ECM'lerin viskoelastik özellikleri ve iyonik konsantrasyon, sıcaklık ve sinyal molekülleriyle etkileşimler gibi dış faktörlerin rolü ile ilgili daha geniş soruları keşfetmek için deneysel bir model olarak da hizmet edebilir.
Introduction
Bir omurgalının gözü, görüntüleri retinaya odaklamaya yardımcı olan canlı bir optik lens içerir1. Lens, Şekil 1A'da gösterildiği gibi hassas, radyal yönelimli fiberlerden oluşan bir sistem tarafından optik eksende askıya alınmıştır. Bir uçta, lifler lens ekvatoru ve diğer ucunda siliary gövdenin yüzeyine bağlanır. Uzunlukları farelerde 150 μm ile insanlarda 1 mm arasında değişen mesafelere yayılır. Toplu olarak, bu lifler Zinn2 zonule, siliary zonule veya sadece zonule olarak bilinir. Oküler travma, hastalık ve bazı genetik bozukluklar zonular liflerin bütünlüğünü etkileyebilir3, bu da nihai başarısızlıklarına ve eşlik eden görme kaybına neden olabilir. Farelerde, lifler çoğunlukla fibrilin-2 proteini içeren bir çekirdeğe sahiptir ve fibrilin-14 bakımından zengin bir mantle ile çevrilidir. Zonular lifler göze özgü olmasına rağmen, vücudun başka yerlerinde bulunan elastin bazlı ECM lifleri ile birçok benzerlik taşırlar. İkincisi bir fibrilin-1 mantle5 ile kaplıdır ve zonular liflerle benzer boyutlara sahiptir6. Gizli dönüştürücü büyüme faktörü β bağlayıcı proteinler (LTBP'ler) ve mikrofibril ilişkili glikoprotein-1 (MAGP-1) gibi diğer proteinler, her iki lif türüyle de ilişkili olarak bulunur7,8,9,10,11. Zonular liflerin elastik modülü 0.18-1.50 MPa12,13,14,15,16 aralığındadır, elastin bazlı liflerinkiyle karşılaştırılabilir (0.3-1.2 MPa)17. Bu mimari ve mekanik benzerlikler, zonule ilişkili proteinlerin rollerine ilişkin herhangi bir içgörünün diğer ECM elastik liflerdeki rollerini aydınlatabileceğine inanmamıza neden olur.
Burada açıklanan yöntemi geliştirmenin temel amacı, kalıtsal göz hastalığının ilerlemesinde spesifik zonular proteinlerin rolü hakkında fikir edinmektir. Genel yaklaşım, vahşi tip farelerdeki zonular liflerin viskoelastik özelliklerini, zonular proteinleri kodlayan genlerde hedeflenen mutasyonları taşıyan farelerinkilerle karşılaştırmaktır. Zonular liflerin elasto-mekanik özelliklerini ölçmek için daha önce çeşitli yöntemler kullanılmış olsa da, hepsi çok daha büyük hayvanların gözleri için tasarlanmıştır12,13,14,15,16. Bu modeller genetik olarak çekişli olmadığı için; farelerin küçük ve narin gözlerine daha uygun deneysel bir yöntem geliştirmeye çalıştık.
Fare zonular liflerinin viskoelastisitesini değerlendirmek için geliştirdiğimiz yöntem, Şekil 1'de görsel olarak özetlenen barfiks tahlil4,18 olarak adlandırdığımız bir tekniktir. Barfiks yönteminin ayrıntılı bir açıklaması ve sonuçların analizi aşağıda verilmiştir. Projede kullanılan üç boyutlu (3D) baskılı parçalar da dahil olmak üzere cihazın yapımını anlatarak başlıyoruz. Daha sonra, gözleri deney için elde etmek ve hazırlamak için kullanılan protokolü detaylandırıyoruz. Son olarak, zonular liflerin viskoelastik özelliklerinin belirlenmesi için veri elde etme konusunda adım adım talimatlar sunuyoruz. Temsili Sonuçlar bölümünde, MAGP-119'dan yoksun farelerden zonular liflerin viskoelastik özellikleri ve yaşla eşleşen vahşi tip hayvanlardan elde edilen bir kontrol seti ile ilgili yöntemimizle daha önce yayınlanmamış verileri paylaşıyoruz. Son olarak, yöntemin avantajları ve sınırlamaları hakkında genel açıklamalar ve çevresel ve biyokimyasal faktörlerin ECM liflerinin viskoelastik özelliklerini nasıl etkilediğini ortaya çıkarabilecek potansiyel deneyler için önerilerle sonlandırıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Washington Üniversitesi Hayvan Çalışmaları Komitesi tarafından onaylandı ve OFTALMIK ve Vizyon Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için ARVO Bildirimi'ne bağlı kalındı.
1. Özel parçaların imalatı ve aparatların yapımı
- Özel parçaların imalatı
- Sonda imalatı. Şekil 2A'nın sol panelinde gösterildiği gibi bir açıyla cam kılcal damar tutun. Bir ucundan yaklaşık 2 cm uzaklıktaki bir çakmağın alevini yerleştirin ve Şekil 2A'nın sağ panelinde gösterildiği gibi, uç 90 ° bükülene kadar orada tutun.
- Örnek platform imalatı. 3B çizim yazılımını kullanarak, Şekil 2B'de gösterildiği gibi 30 x 30 x 5 mm ölçülerinde ve 2,0, 2,5 ve 3,0 mm çapında yarım küre girintiler içeren bir platform tasarlayın.
- Prob tutucu imalatı. 3B çizim yazılımını kullanarak, kılcal probu tutan bir montaj tasarlayın ve bir mikromanipülatöre takın (bkz. Şekil 2C).
NOT: Platform imalatı ve STL formatında prob tutucu imalatı için örnek bir 3D dosya, ilgili yazardan talep üzerine temin edilebilir. - Negatif lens montajı. Petri kabına sıvı eklenmesinin neden olduğu bozulmayı düzeltmek için Şekil 1C ve Şekil 1D'de gösterildiği gibi negatif silindirik bir lens (odak uzaklığında -75 mm ve yaklaşık 50 mm yükseklik ve uzunluk) yerleştirin (sıvı ilavesi, yandan görüntülendiğinde parçalanmış gözün görünümünü bozulur).
- Negatif lensi 2 yuvalı tabanlardan birine yapıştırın (lensin tabana yerleştirilmesi için Bkz. Şekil 2D ).
- Kalan parçaları Şekil 2D'de gösterildiği gibi birleştirin.
- Direğin yüksekliğini, lensin kantarın üzerinde zar zor gezinmesi için ayarlayın ve post tutucudaki vidayı sıkın.
- Aparat yapımı
- Bir bilgisayara ölçek, mikroskop kamera yazılımı ve motorlu mikrometre denetleyicisi uygulaması ile birlikte verilen günlük programını yükleyin.
- Motorlu mikrometreyi servo motor denetleyicisine ve ikincisini bilgisayara bağlayın. Motor kontrolör uygulamasını başlatın ve motor ayarlarını düzenleyin.
NOT: Aşağıda listelenen motor ayarları, streslerin 10-20 s zaman ölçeğinde gevşediğini ortaya çıkaran ön deneylerin ardından seçildi. Bu belirlemeye dayanarak, motorun gevşeme süresinden daha küçük bir sürede 50 μm'lik bir yer değiştirme işlemini tamamlamasına izin veren bir hız ve ivme seçtik, ancak numuneyi sarsmaktan kaçınmak için çok kısa değil. Burada yaklaşık 5-10 sn'lik bir yer değiştirme süresi seçtik. - Maksimum hızı 0,01 mm/sn ve ivmeyi 0,005 mm/s2 olarak ayarlayın.
- Kamerayı muayene mikroskobuna takın ve kamera görüntüleme yazılımını test edin.
- Teraziyi aparatlara ayrılmış tezgah alanına yerleştirin.
- 3D baskılı bir platformu (adım 1.1.2'den) petri kabına yapıştırın ve kuyulardan birine 2-3 mm'lik bir cam boncuk ekleyin. Petri kabını, boncuk tava merkezinin yakınında yer olacak şekilde tartıya yerleştirin.
- Mikromanipülatörden manuel mikrometreyi motorlu olanla değiştirin.
- İki 4-40 vidayı prob tutucusuna vidala. Prob tutucuyu Şekil 1C'de gösterildiği gibi manipülatöre takın.
- Şekil 2A'da gösterildiği gibi bir prob hazırlayın, bükülmüş kısmı aşağı bakacak şekilde prob tutucusuna yerleştirin ve vidaları sıkın.
- Mikromanipülatörü, probun ucu platformdaki boncuk üzerinde olacak şekilde masaya yerleştirin. Deney sırasında yanlışlıkla hareketi önlemek için mikromanipülatörü masaya yapıştırın.
- Yan mikroskobu masaya yerleştirin, böylece boncuk görüş alanının merkezinde ve odaktadır.
2. Örnek hazırlama ve veri toplama
- Göz fiksasyonu ve diseksiyonu
- Aynı C57/BL6J arka plan üzerinde vahşi tip fareleri ve Magp1-null hayvanları koruyun. 1 aylık veya 1 yaşındaki fareleri CO2 soluma ile ötenazi.
- Gözleri ince torptiklerle çıkarın ve enükle edilmiş küreleri gece boyunca %4 paraformaldehit/fosfat tamponlu salinle sabitlayın (PBS, pH 7.4). Tarif ettiği gibi, fiksasyon işlemi sırasında gözde 15-20 mmHg pozitif basınç sağlayın6.
NOT: Oküler kürenin boyutunda cinsiyetle ilgili olası farklılıkları kontrol etmek için erkek fareler üzerinde deneyler yapılır. Pozitif basınç, lens ile göz duvarı arasındaki boşluğu zonular lifler tarafından yayılan koruyarak dünyanın şişirilmiş kalmasını sağlar. - PBS'de gözleri 10 dakika yıkayın. Oftalmik cerrahi makas kullanarak ve stereomikroskop altında çalışarak, optik sinir kafasının yakınındaki göz duvarında tam kalınlıkta bir kesi yapın.
- Kesiği ekvatora doğru uzatın ve ardından gözün ekvatoral çevresinin etrafına doğru uzatın. Hassas silier işlemleri ve ilişkili zonular lifleri ayırmaya özenin.
- Lensin arka yüzeyini açığa çıkararak kürenin arkasını çıkarın.
- Parçalanmış bir gözü tampon çözeltisinden çıkarmak için forsepsleri kullanın ve kornea aşağı bakacak şekilde kuru bir görev mendiline yerleştirin. Korneayı kurutmak için silecek yüzeyinin üzerine hafifçe sürükleyin.
- Petri kabına gözü yerleştirilecek platform kuyularına 3 μL anında tutkal ekleyin.
- Kabı stereomikroskopun sahne plakasına yerleştirin, böylece tutkallı kuyu görüntülenir.
- Gözü mendilden tutkal içeren kuyunun kenarına aktarın. Ardından, gözü dikkatlice kuyuya sürükleyin ve lensin arkası en üst olacak şekilde yönünü hızla ayarlayın.
- Lensin açıkta kalan tarafını kuru bir silmenin köşesiyle hafifçe şişirerek kurulayın.
- 50 mm Petri kabının dibine bir dab anında tutkal uygulayın ve platformu ona çimentolayın.
- Zonular viskoelastik yanıtın ölçümü
- Ölçeği açın, ölçek günlüğü programını ve kamera yazılımını başlatın. Bazı denemeler bu kadar uzun sürebileceği için günlük programının 30 dakika boyunca veri alabildiğine emin olun.
- Servo motor kumandasını çalıştırın ve bilgisayarda denetleyici uygulamasını başlatın. 1.2.2 adımında NOT'ta belirtilenlere benzer hareket parametreleri kullanılarak denetleyicinin 50 μm'lik artışlarla hareket etmeye ayarlı olduğundan emin olun.
- 1.1.1 adımında açıklandığı gibi kılcal çubukta 90° büküm oluşturun.
- Bükülmüş kılcal damarı kılcal prob tutucusuna kaydırın ve sabitleme vidalarını sıkın.
NOT: Numune dehidrasyonunu en aza indirmek için, 1-4 arası adımların göz diseksiyonu öncesinde veya sırasında tamamlanmasını öneririz. - Kılcal damarın ucuna küçük (~1 mm) UV kürleme tutkallı bir boncuk ekleyin.
- Manipülatördeki manuel ayarlamaları kullanarak, kılcal probun ucunu doğrudan lensin ortasında olacak şekilde hareket ettirİn. UV tutkalının alt kısmının önden (görsel incelemeyle) ve yandan (mikroskop kamerasıyla) bakıldığında lensin üstünde ortalanmış görünüp görünmediğini kontrol edin.
- Kameradan bakarken, UV tutkal lensle temas edene ve üst yüzeyinin üçte birini veya yarısını kaplayana kadar prob ucunu küt küt küt atlayın.
- Tutkalını iyileştirmek için düşük yoğunluklu (~ 1 mW), yönlü, görünüre yakın UV (380-400 nm) ışık kaynağı kullanın.
NOT: Bu özellikler, protein çapraz bağlamayı teşvik etme potansiyelini en aza indirirken tutkalın birkaç saniye içinde tedavisi için yeterlidir. Ticari UV tutkal kalemleri ile birlikte verilen UV ışık kaynakları bu özellikleri karşılar. - Göz sıvı ile kaplanana kadar yemeğe en az 2 mm derinliğe kadar PBS çözeltisi ekleyin.
- Silindirik lensi muayene mikroskobu önüne ve petri kabına dokunmadan mümkün olduğunca yakın yerleştirin.
- Aynı anda günlük programını ve bir zamanlayıcı programını başlatın. Kamerayı kullanarak gözün/probun fotoğrafını çekin.
- 60 s'den sonra, 50 μm daha yer değiştirme başlatın ve deney tamamlanana kadar, yani tüm lifler kırılana kadar her 60 s.'de bir. Deneme sırasında arabellek buharlaşması nedeniyle sinyalin taban çizgisi düzeylerine dönmeyeceğini unutmayın. 2.2.14 adımında örneklenerek, veri analizi sırasında okumalarda meydana gelen sürüklenmeyi düzeltin.
- Bir çalıştırma tamamlandıktan sonra, ölçek günlüğü verilerini kaydedin ve elektronik tabloyla uyumlu bir biçime(örneğin, .csv bir biçime dışa aktarın. Çalıştırma sırasında toplanan lens resimlerini kaydedin.
- Verileri elektronik tabloya alma. Buharlaşma nedeniyle zaman içinde arka plan okumasında sürüklenmeyi enterpolasyona tabi etmek için ilk ve son ölçek okumasını kullanın (bkz. Şekil 3). Enterpolasyonlu okumayı her zaman noktasında okumadan çıkarın.
NOT: Elektronik tablo kullanıyorsanız, enterpolasyon, = B2 - $B$2 + ($B$2 - @INDIRECT("B"&COUNTA(B:B)))/(COUNTA(B:B)-2) * A2 ilk ölçek okumasının sağındaki hücrede, daha sonra imleci hücrenin sağ-alt köşesine taşıyarak ve son veri değerine sürükleyerek otomatik olarak gerçekleştirilebilir. Formül, verilerin B2 hücresinde görünen ilk veri noktasıyla bir sütunda düzenlendiğini varsayar. İstenirse, 2.2.14 adımında işlenen veriler, ortak yazarlardan biri olan Dr. Matthew Riley4 tarafından geliştirilen yarı elastik viskoelastik modelle analiz edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan barfiks tekniği, farelerdeki zonular liflerin viskoelastik özelliklerini belirlemek için basit bir yaklaşım sağlar. Kısacası, fare gözü ilk olarak fizyolojik göz içi basıncında bir fiksatif enjeksiyonu ile korunur. Bu yaklaşım gözün doğal enflasyonuni korur ve lifleri düzgün bir şekilde önceden gergin tutar (ön deneyler liflerin elastikiyetini veya gücünü önemli ölçüde değiştirmediğini gösterdikten sonra fiksasyon kabul edilebilir görülmüştür). Fare gözünün arkası daha sonra lensi ve onu askıya alan zonular lifleri açığa çıkarmak için diseksiyon ile çıkarılır. Gözün önü bir platforma yapıştırılmış ve dijital ölçekte yer alan bir Petri kabının içine yerleştirilmiştir. Daha sonra, bir mikromanipülatöre bağlı bir cam kılcal damar lensin arka yüzeyine çimentolanır. Ölçek üzerindeki kuvvet kaydedilirken lens daha sonra 50 μm'lik artışlarla yükseltilir. Preparatın görünür ağırlığındaki bir azalma, lifleri geren kuvvetler hakkında bilgi sağlar. Her yer değiştirmeyi, yer değiştirmenin neden olduğu stresin gevşemesini gözlemlemek için yaklaşık 1 dakika süren bir denge dönemi izler. Son olarak, sonuçlar, fare zonular liflerinin geometrisi ve test için çekme yönü için özel olarak tasarlanmış yarı doğrusal viskoelastik bir model kullanılarak analiz edilir4.
Yöntemimizle elde edilen tipik viskoelastik veriler Şekil 3'te gösterilmiştir. Lensteki kaldırma kuvveti, tartıdaki çanak/platform/göz tertibatının ağırlığını eşdeğer bir miktar azalttığından eğri ters (negatif) görünür. Yanıt, lensin 50 μm dikey deplasmanlarının her biri sırasında anlık kuvvet ani artışlarını ve ardından 10 sn'lik bir ömür boyu bir gevşeme fazını içerir. Sığır zonular lifleri için de benzer bir stres gevşemesi gözlenmiştir12. Anlık ve rahat kuvvetlerin büyüklüğü, yaklaşık 1000 s'ye (~800 μm toplam yer değiştirme) kadar her adımda artar ve lifler arızalanmaya başladıkça düşmeye başlar. Zonule hatası 1.500 s zaman noktası (~1,25 mm toplam yer değiştirme) ile tamamlanır. Deney boyunca tamponun buharlaşması nedeniyle, lens gözden kurtulduktan sonra eğrinin ilk okumaya dönmediğini unutmayın.
Şekil 4 , Bir Magp-1 nakavt faresi (kırmızı eğri) ve yaşla eşleşen vahşi tip hayvan (mavi eğri) için elde edilen yanıtları karşılaştırır. Bu eğriler buharlaşma için düzeltilmiştir, ters çevrilmiştir ve kütlenin ham ölçümleri (bkz. Şekil 3) artık kuvvet olarak ifade edilmiştir (mN birimleri ile). Magp-1 tükenmiş zonulenin (zaman 0-600 s) ilk viskoelastik yanıtı, vahşi tipe çok benzer, bu da zonulün viskoelastik özelliklerinin Magp-1'in yokluğuyla önemli ölçüde değiştirilmediğini göstermektedir. Bununla birlikte, lifler vahşi tip meslektaşlarına kıyasla çok daha düşük bir gerilimde yırtılmış gibi görünmektedir.
Yöntemin güvenilirliğini göstermek için, lifleri yırtılmadan önce gözlere uygulanan maksimum anlık kuvvet hakkında birden fazla hayvandan veri topladık. Sonuçlar Şekil 5'te gösterilmiştir. 1 aylık farelerin verileri, kullanılan örnek sayısının nispeten düşüklüğüne rağmen (n = 5 veya 6) ortalamanın (SEM) standart hatası için çok küçük değerler gösterir ve bu da yüksek tekrarlanabilirlik gösterir. Sonuçlar liflerin gücünün iki genotip arasında önemli ölçüde farklılık gösterdiğini göstermektedir (p-değeri = 2.4 x 10-6). Rakamlarda gösterilmeyen sonuçlar, vahşi tip hayvanlar için yaşla birlikte kırılma kuvvet gücünde ince ama istatistiksel olarak anlamlı bir artış olduğunu da göstermektedir (p-değeri = 0.024).
Barfiks yöntemi ayrıca zamansal yanıtlarda gözlenen varyasyonları hesaba katan viskoelastik parametrelerin nicel tahminlerini de oluşturabilir. Tablo 1 , daha önce açıklanan yarı doğrusal viskoelastik modelle elde edilen MAGP-1 verilerimize en uygun parametreleri özetlemektedir4. Sonuçlar, hem MAGP-1 silme hem de yaşlanmanın zonular liflerin bazı mekanik özellikleri üzerinde oldukça önemli etkileri olabileceğini göstermektedir.
Şekil 1: Barfiks yönteminin görsel bir özeti. (A) Lensi ve onu askıya alan zonular lifleri gösteren omurgalı bir gözün kesitsel görünümü. (B) Lensi yukarı doğru (korneadan uzakta) yerinden sürerek zonular liflerde viskoelastik davranışı belirlemek için genel bir yaklaşım. (C) Bir mikromanipülatöre bağlı bir cam prob tarafından lensi yukarı doğru çekilen bir platforma yapıştırılan parçalanmış bir gözün gerçek görünümü. (D) Tüm cihazın şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Çeşitli parçaların imalatı. (A) Cam probun imalatı. Bir cam kılcal damar bir açıyla tutulur ve bir uçtan yaklaşık 2 cm uzaklıkta bir noktada bir alev uygulanır. Birkaç saniye içinde kılcal damarların ucu düşmeye başlar. Kılcal damarın ucu yaklaşık 90° büküldüğünde alev çıkarılır. (B) Göz platformunun imalatı. Parça 3D stereolitografi (SLA) yazıcı ile üretilmiştir. 30 x 30 x 5 mm ölçülerindedir ve içine çeşitli boyutlarda parçalanmış gözlerin yapıştırıldığı 2.0, 2.5 ve 3.0 mm çaplarına sahip üç yarım küre girinti içerir. (C) Prob tutucunun imalatı. Bu parça da bir 3D SLA yazıcı ile imal edildi. İki ortogonal, 7.3 mm çapında çubuklardan oluşur. Alt çubuk, kılcal probu yerinde sabitleyen metal vidaları yerleştirmek için dış yüzeydeki deliklerden 1,5 mm delik ve iki adet 2,5 mm delik içerir. (D) Negatif lens montajı. Yan mikroskop tarafından yakalanan görüntüler, Petri kabının eğriliği ve tampon çözeltisi nedeniyle astigmatik bir bozulma içerir. Lens tertibatı, yan mikroskobun keskin netlemede görüntü yakalamasını sağlayan bozulmayı telafi etmek için tasarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Tahlil ile elde edilen tipik ham veriler. Gösterilen grafik, dijital ölçekten verileri 0,01 g doğrulukla kaydeden günlük yazılımı ile kaydedildi. Grafiğin sol kenarı (zaman 0), kaldırma kuvveti olmadan numunenin ağırlığını yansıtır. y ekseni kütleyi g olarak gösterir. Lens daha sonra tüm zonular lifler kırılana ve Petri kabı tekrar tartıya tamamen dayanana kadar 50 μm adımda kaldırılır. Son okumanın ilk okumadan uzak olduğunu unutmayın. Uzaklık, deneme sırasında arabellek çözeltisinin kademeli olarak buharlaşmasından kaynaklanır ve adım 2.2.14'te belirtildiği gibi veri analizi sırasında hesaba katılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Vahşi tip ve MAGP-1 eksikliği olan fareler için temsili zonular kuvvet-yer değiştirme eğrileri. Grafik, lensin denge konumundan ayrık yer değiştirmelerinden sonra elde edilen viskoelastik yanıtı karşılaştırır. Bir MAGP-1 nakavt (KO) faresinden gelen bir gözün yanıtı, yaşla eşleşen vahşi tip bir hayvanın, nakavt fareslerindeki liflerin zamanından önce kırıldığı noktaya kadar izler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Magp-1 KO için vahşi tip farelere karşı ve iki yaşta barfiks yöntemi ile elde edilen zonular lif kırma kuvvetleri. Gösterilen tüm ölçümler n = 5 veya 6 göze dayanır ve ortalamanın standart hatasını (SEM) temsil eden hata çubukları vardır. Kısaltmalar: WT = vahşi tip; KO = MAGP-1 nakavt. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Genotip/yaş | G0 (Pa) | G∞ (Pa) | Ʈ (sn) | σ f (Pa) | |
| WT 1 aylık | DEMEK | 2.34E+05 | 9.33E+04 | 16.3 | 9.61E+05 |
| SD | 2.83E+04 | 2.94E+04 | 3.4 | 1.25E+05 | |
| %95 Cl | 5.55E+04 | 5.76E+04 | 6.7 | 2.45E+05 | |
| KO 1 aylık | DEMEK | 2.73E+05 | 6.74E+04 | 17.6 | 4.44E+05 |
| SD | 6.30E+04 | 2.06E+04 | 3.8 | 7.85E+04 | |
| %95 Cl | 1.23E+05 | 4.03E+04 | 7.5 | 1.54E+05 | |
| p değerleri | 0.25 | 0.12 | 0.58 | 0.000022 | |
| WT 1 yıllık | DEMEK | 1.98E+05 | 7.42E+04 | 17 | 1.41E+06 |
| SD | 1.17E+05 | 2.39E+04 | 9.1 | 2.44E+05 | |
| %95 Cl | 2.29E+05 | 4.69E+04 | 17.9 | 4.79E+05 | |
| KO 1 Yıllık | DEMEK | 1.70E+04 | 2.46E+04 | 12.9 | 5.05E+05 |
| SD | 9.06E+03 | 8.04E+03 | 7.4 | 1.48E+05 | |
| %95 Cl | 1.78E+04 | 1.58E+04 | 14.4 | 2.91E+05 | |
| p değerleri | 0.0063 | 0.001 | 0.41 | 0.000014 | |
| p değerleri, yaş | WT | 0.46 | 0.23 | 0.85 | 0.002 |
| KO | 0.0007 | 0.0068 | 0.26 | 0.44 | |
Tablo 1: Yarı doğrusal viskoelastik (QLV) model ile elde edilen viskoelastik özellikler. Şekil 4'te gösterilenler gibi veri taramaları, barfiks tahlilleri ve fare zonule için özel olarak geliştirilen bir QLV modeli ile analiz edildi. Anlık (G0) ve denge (G∞) sertlikleri, gevşeme süresi sabiti (φ) ve nihai gerilme mukavemeti (σ f) için en uygun parametreler gösterilir. Kısaltmalar: SD = standart sapma; CI = güven aralığı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zonule, liflerin simetrik olarak düzenlendiği ve optik eksen boyunca göz merceği yerinden edilerek aynı şekilde manipüle edilebilen alışılmadık bir ECM sistemidir. Alan ayrıca hücresel bozulma olmadan kolayca erişilebilir ve liflerin kendi yerel durumlarına yakın bir ortamda incelenmesini sağlar. Barfiks tekniği, genetik olarak çekişli bir sistem olan farelerden gelen hassas lifleri manipüle etmek ve mekanik özelliklerini doğru bir şekilde ölçmek için bu ECM sunumundan yararlanır. Bu, anahtar ECM proteinlerinin (fibrilin-118, LTBP-24 ve MAGP-1 burada bildirilmiştir) zonular liflerin biyomekanik özelliklerine katkısını incelememizi sağlamıştır. Fibrilinin-1 eksikliği olan fareler üzerinde yaptığımız analizler, fibrilinin-1'den yoksun zonular liflerin yaşla zayıfladığını ve sonunda yırtılmasıyla göz içindeki merceğin yer değiştirmesine yol açtı (insanlarda ektopia lentis olarak bilinen bir durum). Önemli ölçüde, lens çıkığı, FBN1 gen20'deki mutasyonların neden olduğu bir hastalık olan Marfan sendromu olan hastalarda da sık görülen bir durumdur. Böylece, barfiks tahlil farelerde insan bağ dokusu hastalığının yönlerini modellemek için bir fırsat sunar. LTPB-2'den (mikrofibrillerin oluşumunda rol aldığı düşünülen bir protein) yoksun farelerde, zonular liflerin bu proteinin yokluğunda üretildiğini, ancak önemli ölçüde daha düşük streslerde yırtıldığını ve sonunda yaş4 ile parçalandığını gösterebildik. Bu sonuçlar LTBP-2'nin liflerin sentezinden ziyade uzun ömürlü olmasına katkıda bulunduğunu göstermektedir. Mevcut çalışmada, MAGP-1 eksikliği olan liflerin vahşi tip liflerle benzer viskoelastik özelliklere sahip olduğunu, ancak yaşa bağlı daha fazla bozulma belirtisi olmadan daha düşük gerilmelerde yırtıldığını belirledik. Bu, MAGP-1'den yoksun liflerin geliştikleri anda özünde daha zayıf olduğu bir modelle tutarlı olacaktır.
Tablo 1'de listelenen nihai gerilme güçlü yönlerinin, liflerin orta açıklıkta bir yerde kırılır varsayımı altında tahmin olduğunu not ediyoruz. Bununla birlikte, lif arızasının lens yüzeyindeki veya silier gövdedeki ankraj noktalarından kopmasından kaynaklandığı olasılığını göz ardı edemeyiz. Bu durumda, lifin kırılma gerilme mukavemeti Tablo 1'de listelenen değerlerden daha yüksek olabilir. Bu olasılıklar arasında ayrım yapmak için mikroskobik analiz yapılması gerekecektir. Bu tür analizler önemsiz olmaktan uzaktır, çünkü ilgili lifler çok incedir (~0.5-0.6 μm genişliğinde) ve neredeyse indeksle suyla eşleşir, bu da onları esasen görünmez kılar. Bu ek bilgilerin yokluğunda, yalnızca Tablo 1'de listelenen nihai gerilme güçlü yönlerinin alt sınırlarını temsil ettiğini belirtebiliriz. Ayrıca, prensip olarak, kuvvet ölçümlerinin lensin hangi yöne çekildiğine bağlı olarak farklılık gösterip farklılık göstermeyeceğini kontrol etmek de ilginç olacaktır. Bununla birlikte, pratikte, lensi ön taraftan çekmek, hemen altında yatan zonular liflere zarar vermeden irisin çıkarılmasını gerektirecektir. Bu tür hassas diseksiyon, şu anda fare gözüyle başarabileceğimizin ötesindedir.
Yöntemin göreceli basitliği ve sonuçlarının yüksek tekrarlanabilirliği, ECM mekanik özelliklerinin karşılaştırmalı çalışmaları için arzu edilen niteliklerdir. Ek olarak, burada gösterildiği gibi, viskoelastik bir model varsayarak ve zaman eğrilerini ona uydurarak viskoelastik parametrelerin mutlak değerlerini elde etmek için barfiks testini kullanmak da mümkündür. Örneğin, standart bir yarı doğrusal viskoelastik (QLV) modeli kullanarak, anlık (G0) ve denge (G∞) sertlikleri, gevşeme süresi sabiti (φ) ve vahşi tip farelerden zonular liflerin nihai gerilme mukavemeti (σ f) ve LTBP-24 veya MAGP-1'den yoksun olanlar için değerler çıkarabildik. Her iki çalışmada da vahşi tip hayvanlar için elde edilen G0 ve G∞ değerleri 6,7 x 104 Pa ila 2,3 x 105 Pa arasında değişmektedir. insan, sığır ve porcine zonules (1.8 x 105-1.5 x 106 Pa)12,13 türetilen çok daha büyük liflerde bulunanlarla geniş ölçüde karşılaştırılabilir bir aralık, 14,15,16. Türler arasındaki bu anlaşma, bunların bu liflerin evrensel özellikleri olduğunu göstermektedir ve anlamlı viskoelastik parametrelerin yöntemimizle çıkarabileceğine dair bize güven vermektedir.
Kaliteli viskoelastik yanıtlar elde etmek için kritik bir adım, platforma yapıştırılmış parçalanmış gözün yönüdür (adım 2.1.9). Küçük eğim (10°'den az) sonuçları önemli ölçüde etkilemez. Bu sınırın dışında gerçekleştirilen denemeler , Şekil 4'te gösterilenlerden sapan şekillerle eğriler oluşturabilir. Örneğin, bu eğrilerden bazıları bir yerine iki geniş tepeye sahip olabilir.
İdeal olarak, bu makalede özetlenen prosedür, taze zonular liflerin gerçek viskoelastik parametrelerini değerlendirme yeteneğimizi sınırlayan gözlerin sabitlenmesi olmadan gerçekleştirilmesi gerekirdi. Bununla birlikte, ön deneylerimiz paraformaldehit sabit ve taze numuneler arasında önemli bir fark göstermedikten sonra, birkaç avantaj sağladığı için fiksasyonu benimsemeye karar verdik. Protokolde belirtildiği gibi, sabit dokuların kullanımı, barfiks deneyleri için liflerin doğal streçlerinin korunmasına yardımcı olur. Ek olarak, fiksasyonun UV tutkalının göz kapsülüne daha fazla yapışmasını teşvik ettiğini, böylece taze örneklerde yaygın olarak yaşandığı gibi, barfiks eylemi sırasında probun lensten kopma olasılığını azalttığını bulduk (prob müfrezesi, kuvvetin ani bir şekilde taban çizgisi seviyesine dönüşü olarak kolayca tanınabilir). Fiksasyon ayrıca göz duvarının çekme yönünde bükülmesini de önledi. Bu sınırlamaya rağmen, yöntemimiz protein bileşenlerinin zonular liflerin viskoelastik özelliklerine göreceli katkısını belirlemek için sağlam bir yaklaşım sağlar.
Bugüne kadarki çalışmalarımız belirli proteinlerin katkısına odaklanmış olsa da, yöntem liflere dış etkenlerin mekanik özellikleri üzerindeki etkisini incelemek için kolayca uyarlanabilir. Bu faktörler arasında sıcaklık, pH, kalsiyum konsantrasyonu ve çapraz bağlama enzimlerinin varlığı veya yokluğu bulunur. Yüksek hassasiyetli ölçümler, yöntemimizi diferansiyel modda kullanarak, yani zonular lifleri ilk stres / gerinim ile önceden gererek ve daha sonra dış koşullar değiştirildiğinde ortaya çıkan gerilim farkını okuyarak elde edilebilir. Bu müdahalelerden bazıları zonuleyi çevreleyen dokuların elastikiyetini etkileyebilir ve bu nedenle zonulede üretilenlerle rekabet eden gerginlikte değişikliklere neden olabilir. Önerilen deneylerle alakalarını değerlendirmek için izole dokularla kontrol ölçümlerine ihtiyaç duyulana ihtiyaç duyulana gerek vardır. Yan kamera ile yapılan gözlemlere dayanarak, bu tür etkilerin ihmal edilebilir olmasını bekliyoruz, bitişik dokuların zonular lifler tamamen gerildiğinde bile esasen hiçbir deformasyona uğramayan son derece sert malzemeler gibi davrandığını gösteren gözlemlere dayanarak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH R01 EY029130 (S.B.) ve P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 ve Ines Mandl Araştırma Vakfı (R.P.M.), Marfan Vakfı tarafından desteklenmiş ve Washington Üniversitesi Oftalmoloji ve Görsel Bilimler Bölümü'ne Araştırmadan Körlüğü Önlemeye Yönelik Sınırsız Bir Hibe ile desteklenmiştir. J.R. ayrıca bu projeye destek olarak Sağlık Bilimleri ve Eczacılık Üniversitesi'nden hibe aldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4-20 hex screws 3/4 inch long | Thorlabs | SH25S075 | |
| 1/4-20 nut | Hardware store | ||
| 3D SLA printer | Anycubic | Photon | |
| 4-40 screws 3/8 inch long, 2 | Hardware store | ||
| Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament | WPI | 1B120-3 | |
| Cyanoacrylate (super) glue | Loctite | ||
| Digital Scale accurate to 0.01 g | Vernier | OHAUS Scout 220 | |
| Excel | Microsoft | Spreadsheet | |
| Gas cigarette lighter | |||
| Inspection/dissection microscope | Amscope | SKU: SM-4NTP | Working distance ~ 15 cm |
| Micromanipulator, Economy 4-axis | WPI | Kite-L | |
| Motorized micrometer | Thorlabs | Z812B | |
| Negative cylindrical lens | Thorlabs | LK1431L1 | -75 mm focal length |
| Petri dishes, 50 mm | |||
| Post holder, 3 inches | Thorlabs | PH3 | |
| Post, 4 inches | Thorlabs | TR4 | |
| Scale logging software | Vernier | LoggePro | |
| Servo motor controller | Thorlabs | KDC101 | |
| Servo motor controller software | Thorlabs | APT | |
| Slotted base, 1 | Thorlabs | BA1S | |
| Slotted bases, 2 | Thorlabs | BA2 | |
| Stand for micromanipular | WPI | M-10 | |
| USB-camera for microscope | Amscope | SKU: MD500 | |
| UV activated glue with UV source | Amazon |
References
- Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: structural determinants of eye lens transparency. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
- Bassnett, S.
- Dureau, P.
- Shi, Y., et al. Latent-transforming growth factor beta-binding protein-2 (LTBP-2) is required for longevity but not for development of zonular fibers. Matrix Biology. 95, 15-31 (2021).
- Ushiki, T. Collagen fibers, reticular fibers and elastic fibers. A comprehensive understanding from a morphological viewpoint. Archives of Histology and Cytology. 65 (2), 109-126 (2002).
- Bassnett, S. A method for preserving and visualizing the three-dimensional structure of the mouse zonule. Experimental Eye Research. 185, 107685 (2019).
- Todorovic, V., Rifkin, D. B. LTBPs, more than just an escort service. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (2), 410-418 (2012).
- Mecham, R. P., Gibson, M. A. The microfibril-associated glycoproteins (MAGPs) and the microfibrillar niche. Matrix Biology. 47, 13-33 (2015).
- Hubmacher, D., Reinhardt, D. P., Plesec, T., Schenke-Layland, K., Apte, S. S. Human eye development is characterized by coordinated expression of fibrillin isoforms. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (12), 7934-7944 (2014).
- Inoue, T., et al. Latent TGF-β binding protein-2 is essential for the development of ciliary zonule microfibrils. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5672-5682 (2014).
- De Maria, A., Wilmarth, P. A., David, L. L., Bassnett, S. Proteomic analysis of the bovine and human ciliary zonule. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 573-585 (2017).
- Wright, D. M., Duance, V. C., Wess, T. J., Kielty, C. M., Purslow, P. P. The supramolecular organization of fibrillin-rich microfibrils determines the mechanical properties of bovine zonular filaments. Journal of Experimental Biology. 202 (21), 3011-3020 (1999).
- Bocskai, Z. I., Sandor, G. L., Kiss, Z., Bojtar, I., Nagy, Z. Z. Evaluation of the mechanical behaviour and estimation of the elastic properties of porcine zonular fibres. Journal of Biomechanics. 47 (13), 3264-3271 (2014).
- Fisher, R. F.
- Michael, R., et al. Elastic properties of human lens zonules as a function of age in presbyopes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (10), 6109-6114 (2012).
- van Alphen, G. W., Graebel, W. P.
- Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).
- Jones, W., Rodriguez, J., Bassnett, S. Targeted deletion of fibrillin-1 in the mouse eye results in ectopia lentis and other ocular phenotypes associated with Marfan syndrome. Disease Models & Mechanisms. 12 (1), 037283 (2019).
- Weinbaum, J. S., et al. Deficiency in microfibril-associated glycoprotein-1 leads to complex phenotypes in multiple organ systems. Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25533-25543 (2008).
- Comeglio, P., Evans, A. L., Brice, G., Cooling, R. J., Child, A. H. Identification of FBN1 gene mutations in patients with ectopia lentis and marfanoid habitus. British Journal of Ophthalmology. 86 (12), 1359-1362 (2002).
