Génération et caractérisation de l’infarctus du myocarde ventriculaire droit induit par la ligature permanente de l’artère coronaire droite chez la souris

Summary

Il existe plusieurs différences entre les ventricules droit et gauche. Cependant, la physiopathologie de l’infarctus du ventriculaire droit (IRV) n’a pas été clarifiée. Dans le présent protocole, une méthode reproductible pour la génération de modèles de souris RVI est introduite, ce qui peut fournir un moyen d’expliquer le mécanisme de RVI.

Abstract

L’infarctus ventriculaire droit (IRV) est une présentation courante dans la pratique clinique. Un RVI sévère peut entraîner un dysfonctionnement hémodynamique mortel et une arythmie. Contrairement au modèle d’infarctus du myocarde (IM) de souris largement utilisé généré par la ligature de l’artère coronaire gauche, le modèle murin RVI est rarement utilisé en raison de la difficulté associée à la génération du modèle. La recherche sur les mécanismes et le traitement du remodelage et du dysfonctionnement du VR induit par l’IRV nécessite des modèles animaux pour imiter la physiopathologie de l’IRV chez les patients. Cette étude introduit une procédure réalisable pour la génération de modèles RVI chez les souris C57BL/6J. De plus, ce modèle a été caractérisé sur la base des éléments suivants : évaluation de la taille de l’infarctus à 24 h après l’IM, évaluation du remodelage et de la fonction cardiaques avec échocardiographie, évaluation de l’hémodynamique du VR et histologie de la zone de l’infarctus à 4 semaines après l’IRV. De plus, un moulage de la vascularisation coronaire a été effectué pour observer la disposition artérielle coronaire en VR. Ce modèle murin de RVI faciliterait la recherche sur les mécanismes de l’insuffisance cardiaque droite et chercherait de nouvelles cibles thérapeutiques pour le remodelage du VR.

Introduction

Le ventricule droit (VR), longtemps considéré comme un simple tube relié à l’artère pulmonaire, a été négligé à tort pendant de nombreuses années¹. Cependant, il y a eu un intérêt croissant pour la fonction RV récemment, car elle joue un rôle essentiel dans les troubles hémodynamiques ^2,3 et peut servir de prédicteur de risque indépendant de maladie cardiovasculaire ^4,5,6,7. Les maladies du VR comprennent l’infarctus du VR (RVI), l’hypertension artérielle pulmonaire et la valvulopathie⁸. Contrairement à l’immense intérêt pour l’hypertension artérielle pulmonaire, le RVI est resté négligé ^7,9.

L’IRV, habituellement accompagné d’un infarctus du myocarde inférieur-postérieur^10,11, est causé par une occlusion de l’artère coronaire droite (ACR). Selon les investigations cliniques, l’IRV sévère induit probablement des perturbations hémodynamiques et des arythmies, telles que l’hypotension, la bradycardie et le blocage auriculo-ventriculaire, associées à une morbidité et une mortalité hospitalières plus élevées 12,13,14. La fonction RV pourrait se rétablir spontanément dans une certaine mesure même en l’absence de reperfusion^15,16. Plusieurs différences morphologiques et fonctionnelles existent entre le ventricule gauche (LV) et le RV¹⁷. On pense que le VR est plus résistant à l’ischémie que le LV⁸, en partie en raison de la formation de circulation collatérale plus étendue après le RVI. Clarifier les différences entre l’infarctus LV (LVI) et l’IRV et identifier les mécanismes sous-jacents fournirait de nouvelles cibles thérapeutiques pour la régénération cardiaque et l’insuffisance cardiaque ischémique. Cependant, en raison de la difficulté associée à la génération de modèles de souris RVI, la recherche fondamentale sur les RVI est principalement limitée.

Un grand modèle animal de RVI a été généré en ligaturant rca chez le porc¹⁸, qui est plus facile à utiliser en raison de l’RCA visible. Par rapport au modèle de gros animaux, le modèle murin présente les avantages suivants: plus d’accessibilité dans la manipulation des gènes, coût économique inférieur et période expérimentale plus courte^19,20. Bien qu’un modèle RVI de souris axé sur l’influence du RVI sur la fonction LV ait été signalé précédemment, les étapes détaillées de la procédure, les difficultés et les points clés de fonctionnement, ainsi que les caractéristiques du modèle telles que les changements hémodynamiques n’ont pas été entièrement^{introduits 9,21}.

Cet article fournit des procédures chirurgicales détaillées pour générer un modèle murin de RVI. De plus, ce modèle a été caractérisé par une mesure échocardiographique, une évaluation hémodynamique invasive et une analyse histologique. De plus, un moulage de la vascularisation coronaire a été effectué pour observer la disposition artérielle coronaire dans le VR. La technique présentée dans cet article aiderait les débutants à saisir rapidement la génération du modèle RVI de souris avec une mortalité opérationnelle acceptable et des approches d’évaluation fiables. Le modèle murin de RVI aiderait à étudier les mécanismes de l’insuffisance cardiaque droite et à rechercher de nouvelles cibles thérapeutiques pour le remodelage du VR.

Protocol

Toutes les procédures ont été effectuées conformément au Guide pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire publié par les National Institutes of Health des États-Unis (publication des NIH n° 85-23, révisée en 1996) et ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’hôpital Nanfang, Southern Medical University (Guangzhou, Chine). Des souris mâles C57BL / 6J en bonne santé (âgées de 8 à 10 semaines; poids corporel, 25 à 30 g) ont été obtenues au Centre animalier de la Southern Medical University. Des souris femelles peuvent également être utilisées, mais le mélange des deux sexes n’est pas recommandé en raison des influences potentielles des différences entre les sexes. Après leur arrivée, les souris ont été logées sous un cycle sombre/clair de 12 h/12 h (3 à 4 souris par cage), avec de la nourriture et de l’eau ad libitum.

1. Préparation à la chirurgie

1. Stériliser les instruments chirurgicaux en autoclavant avant la chirurgie. Réglez le coussin chauffant à 37 °C.
2. Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale de 50 mg/kg de pentobarbital (voir tableau des matériaux) pour soulager la douleur chirurgicale. Placez les souris dans des boîtes séparées pour l’induction de l’anesthésie. Assurer la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réponse de retrait des orteils.
   REMARQUE: Il est également recommandé d’utiliser 1,5% d’isoflurane pour l’anesthésie par inhalation, car il est préférable pour l’analgésie.
3. Placez les souris en décubitus dorsal sur le coussinet en fixant leurs incisives avec une suture et en immobilisant leurs membres avec du ruban adhésif. Assurez-vous à nouveau de la profondeur de l’anesthésie en vérifiant le réflexe.
4. Enlevez les poils du cou au xiphoïde avec une crème dépilatoire. Désinfectez la zone chirurgicale 3 fois avec un gommage antiseptique alterné et 75% d’alcool, puis drapez le champ chirurgical.
5. Effectuez l’intubation en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Ajuster la fréquence respiratoire de l’animal à l’aide d’un mini ventilateur (voir tableau des matériaux) à 150/min et le volume courant à 300 μL.
      REMARQUE: Il n’est pas nécessaire d’utiliser le mode de pression expiratoire positive.
   2. Retirez légèrement la langue avec une pince à épiler, soulevez la mandibule avec un dépresseur de langue pour exposer la glotte et effectuez une intubation intra-trachéale en insérant une canule de 22 G dans la glotte.
   3. Allumez le mini ventilateur et connectez la canule trachéale au ventilateur. Le phénomène d’ondulation thoracique devenant égal à la fréquence du ventilateur indique une intubation réussie. Fixez la canule avec du ruban adhésif pour éviter de glisser pendant l’opération.

2. Ligature permanente de l’artère coronaire droite

1. Connectez correctement les électrodes d’électrocardiographie (ECG) (voir Tableau des matériaux) aux membres de la souris et enregistrez l’ECG.
   REMARQUE : L’un des chefs de file II, III ou AVF est choisi comme responsable de la surveillance; Le plomb III est plus approprié.
2. Ouvrez la poitrine.
   1. Faites une incision de 1 cm de long dans la peau parallèlement à la troisième côte droite avec des ciseaux ophtalmiques. Déterminez à nouveau le troisième intercostal et assurez-vous un espace suffisant en fonction de l’angle du sternum.
      REMARQUE: La direction de l’incision cutanée est faite de l’angle du sternum à la ligne axillaire antérieure droite.
   2. Séparez et coupez les muscles pectoraux majeurs et pectoraux mineurs avec des ciseaux et des micro-pinces au-dessus du troisième espace intercostal. Après cela, séparez carrément le muscle intercostal avec une pince du coude pour exposer le champ chirurgical.
      REMARQUE: Seule une petite partie des muscles pectoraux doit être coupée, puis une séparation contondante est recommandée pour exposer le cœur.
   3. Inciser le péricarde. Soulevez l’oreillette droite avec du coton stérile et ligaturez le RCA avec un 8-0 stérile fil de nylon avec une plage de ligature de 3-5 mm. Après ligature de l’ARC, l’ECG de surveillance (plomb III) montre une élévation du segment ST.
      REMARQUE: Étant donné que le RCA de la souris est invisible, son emplacement anatomique doit être soigneusement confirmé. Le myocarde du VR est beaucoup plus mince que celui du VTL. Par conséquent, il est difficile de saisir la profondeur de l’aiguille insérée. Il est facile d’induire une bradycardie sinusale et un blocage auriculo-ventriculaire si la profondeur de l’aiguille insérée est trop profonde et que la plage de ligature est trop grande.
3. Retirez le coton stérile et suturez les muscles et la peau avec un fil de nylon stérile 5-0 pour fermer l’incision intercostale. Désinfectez à nouveau la peau avec 75% d’alcool et hébergez la souris après la chirurgie.
   REMARQUE: Le muscle bien suturé est important pour éviter l’aérothorax. Un tube de drainage stérile est placé dans la cavité thoracique jusqu’à la fin de la fermeture de la poitrine, puis la cavité thoracique est évacuée par une seringue d’injection reliant le tube de drainage.
   REMARQUE: Après la chirurgie, les souris sont placées sur un coussin chauffant. Des analgésiques tels que la buprénorphine (0,1 mg / kg de poids corporel, injection sous-cutanée) sont nécessaires pour réduire la douleur des animaux après la chirurgie. Les complications attendues sont la bradycardie sinusale et le bloc auriculo-ventriculaire, et le taux de mortalité après la chirurgie est de 10 à 20%.

3. Évaluation échocardiographique de la fonction RV après la chirurgie

REMARQUE: Pour l’échocardiographie, utilisez une sonde MS400D avec une fréquence centrale de 30 MHz, connectée à un système d’imagerie par ultrasons haute résolution (voir tableau des matériaux). L’examen d’échocardiographie est effectué 4 semaines après la chirurgie.

1. Anesthésier la souris avec 3% d’isoflurane par inhalation.
2. Placez la souris en position couchée sur une plate-forme à ultrasons pour la fixation des animaux et le fonctionnement par ultrasons. Collez ses griffes à l’électrode pour obtenir un enregistrement ECG grâce à un système attaché à la machine à ultrasons.
3. Surveillez la fréquence cardiaque grâce à l’ECG et maintenez-la entre 450 et 550 battements / min en ajustant la concentration anesthésique entre 1,5% et 3%.
4. Retirez les poils de la poitrine de la souris avec une crème dépilatoire et appliquez un gel à ultrasons sur la peau de la poitrine.
5. Réglez la plate-forme sur la position horizontale. Orientez le transducteur parallèlement à la jambe gauche et obtenez l’image ventriculaire gauche à long axe. Faites pivoter la sonde de 90° dans le sens des aiguilles d’une montre pour obtenir la vue LV sur l’axe court. Appuyez sur le bouton Cine store pour enregistrer les images.
   REMARQUE: Le coin supérieur gauche de la plate-forme est incliné au point le plus bas. L’angle de rotation LV à axe court du transducteur est maintenu tandis que le transducteur est orienté vers l’épaule droite de la souris.
6. Descendez le transducteur verticalement, en maintenant sa position sur le haut de l’abdomen et sous le diaphragme de la souris en mode B. Ajustez légèrement la position de la plate-forme en faisant pivoter ses axes x et y jusqu’à ce que le VR, l’oreillette droite (RA), l’oreillette gauche (LA) et le LV soient clairement visibles à l’écran. Enregistrez les images apicales à quatre chambres en appuyant sur le bouton Magasin de cinés ou Magasin de cadres .
   REMARQUE: Le mode B est utilisé pour afficher la vue en deux dimensions (2D) du cœur.
7. Appuyez sur le mode M; une fois que la ligne d’indicateur 2x apparaît, localisez la ligne d’indicateur à l’orifice de la valve tricuspide pour obtenir le mouvement du plan annulaire tricuspide. Appuyez sur le bouton Magasin de cinés ou Magasin de cadres pour enregistrer des données et des images.
   REMARQUE: Le mode M signifie le mode de mouvement, qui révèle le mouvement du cœur ou du vaisseau sous forme de courbe.
8. Appuyez sur le bouton Mesurer pour passer en mode de mesure. Cliquez sur le bouton mesure de zone pour zoner en VR et LV. Calculez la surface de RV et LV pour obtenir le rapport de surface de RV à LV.
   1. Cliquez sur le bouton Timeline et créez deux lignes de base pour définir la plage de mouvement du plan annulaire tricuspide pendant les périodes systolique et diastolique. Cliquez sur le bouton Distance et mesurez la distance entre deux lignes de base pour obtenir une excursion systolique du plan annulaire tricuspide (TAPSE).
9. Inclinez le côté gauche de la plate-forme au point le plus bas. Maintenez la sonde à un angle de 30° par rapport à l’axe horizontal le long de la ligne axillaire antérieure droite. Faites pivoter les axes x et y de la plate-forme pour afficher le VR.
   1. Appuyez sur le bouton du mode M et localisez la ligne de l’indicateur au point hyperéchoïque du septum pour obtenir l’image en mode M de l’interface RV. Appuyez sur le bouton Cine Store pour enregistrer l’image.
10. Ouvrez l’image en mode M de l’interface RV, appuyez sur le bouton Mesurer pour passer en mode de mesure. Mesurez la distance interne du VR à l’extrémité de la diastole (RVIDd), de la fraction d’éjection du VR (RVEF) et du raccourcissement de la fraction du VR (RVFS) à l’aide de l’outil de mesure intégré du système échocardiographique.
11. Arrêtez d’administrer de l’isoflurane et placez la souris sur le coussin chauffant pendant 3 à 5 minutes jusqu’à ce qu’elle reprenne conscience. Après cela, retournez la souris dans sa cage avec un cycle lumière/obscurité de 12 h.

4. Mesures invasives de l’hémodynamique du VR

REMARQUE: L’hémodynamique rv est évaluée par cathétérisme cardiaque droit 4 semaines après l’IRV. Un cathéter de 1,0 F associé à un système de surveillance est appliqué.

1. Anesthésier la souris avec une injection intrapéritonéale de 50 mg/kg de pentobarbital de sodium (voir tableau des matériaux).
2. Après avoir confirmé la disparition du réflexe de retrait de la pédale, maintenez la souris en position couchée et immobilisez-la avec du ruban adhésif.
3. Rasez les poils de la poitrine de l’angle sternal au xiphoïde. Désinfectez la zone d’opération avec 75% d’alcool.
4. Effectuer l’intubation trachéale et régler le paramètre du ventilateur pour animaux comme décrit aux étapes 1.5.2-1.5.3.
5. Faites une incision bilatérale de 1 cm sur la peau au-dessus du processus xiphoïde et transectez le diaphragme et la côte avec des ciseaux ophtalmiques pour exposer le cœur.
6. Perforez la paroi libre ventriculaire droite avec une aiguille de 32 G. Retirez l’aiguille et appuyez sur la plaie avec du coton pour arrêter le saignement.
7. Insérez l’extrémité du cathéter dans le ventricule droit à travers le site de ponction et poussez le cathéter vers l’avant lentement. Ajustez la position de la pointe pour obtenir une forme d’onde de pression de VR typique affichée sur un moniteur et un système d’enregistrement.
   REMARQUE: La veine jugulaire droite est également une voie appropriée pour la mesure hémodynamique.
8. Après 10 minutes de stabilisation, enregistrez les données de la pression artérielle systolique RV (RVSBP), de la pression diastolique terminale RV (RVEDP) et rv dP / dt. Cliquez sur le bouton Sélectionner pour sélectionner les cycles cardiaques à calculer, puis cliquez sur le bouton Analyser pour calculer les valeurs moyennes des cycles sélectionnés.
9. Retirez le cathéter après la fin de l’enregistrement, puis placez-le dans une solution saline normale.
10. Euthanasier la souris avec une injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique de surdosage (150 mg/kg) puis la sacrifier par luxation cervicale.
11. Recueillir le cœur et le tibia pour une analyse histologique.

5. Coulée vasculaire coronaire à l’aide d’un agent de coulée vasculaire

1. Hépariniser la souris avec une injection intrapéritonéale de 200 UI/mL d’héparine sodique à 2000 UI/kg (voir tableau des matériaux).
2. Anesthésier la souris avec une injection intrapéritonéale de 50 mg/kg de pentobarbital de sodium.
3. Placer l’animal en décubitus dorsal sur le coussinet et l’intuber pour la ventilation artificielle en suivant les étapes 1.5.2-1.5.3.
4. Ouvrez la poitrine avec des ciseaux chirurgicaux comme décrit à l’étape 4.5 et exposez le cœur.
5. Faites une encoche de 3 mm avec des ciseaux ophtalmiques sur les oreillettes droites et perfuser le cœur avec 5 mL de solution saline normale à travers l’apex cardiaque avec un injecteur.
6. Bloquez le sang de l’aorte avec une pince aortique et perfuser 0,1 mL de nitroglycérine (1 mg / mL) à travers l’apex cardiaque avec un injecteur pour dilater l’artère coronaire.
7. Préparez le réactif coulé en mélangeant les ingrédients dans le kit conformément aux instructions du fabricant (voir tableau des matériaux).
   REMARQUE: Il est recommandé de préparer simultanément le réactif coulé et la perfusion avec une solution saline normale et de la nitroglycérine pour éviter la fermeture microvasculaire.
8. Perfuser le cœur avec 1 mL de réactif coulé à travers l’apex cardiaque et attendre 2-3 h.
9. Éroder le cœur avec de l’hydroxyde de sodium à 50% pendant 2-3 jours et enlever le tissu musculaire ou le tissu conjonctif en rinçant avec une solution saline normale.
10. Prenez des photos sous un appareil photo.
    ATTENTION : Le réactif moulé est nocif pour les yeux, la peau et les voies respiratoires. L’hydroxyde de sodium est corrosif. Le port de gants de protection, de lunettes et d’une blouse de laboratoire est requis. Le réactif coulé doit être préparé dans une hotte.

Results

Dans cette étude, les souris ont été assignées au hasard au groupe RVI (n = 11) ou opération simulée (n = 11). La coulée coronaire dans 2 cœurs de souris normaux est illustrée à la figure 1A. En réponse à la ligature RCA, une élévation du segment ST a été observée dans le plomb III de l’ECG (Figure 1B). De plus, la coloration au chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC) a montré que la zone d’infarctus représente 45 % de la paroi libre du VR à 24 heures après...

Discussion

Sicard et ses collègues français ont d’abord rapporté un modèle murin de RVI en 2019, qui décrivait le processus chirurgical et se concentrait sur l’interaction entre LV et RV après RVI⁹. Cependant, à ce jour, aucune étude n’a rapporté utiliser ce modèle pour d’autres études. Une procédure plus détaillée serait utile pour les chercheurs afin d’utiliser le modèle murin de RVI pour l’investigation. Contrairement au rapport de Sicard et ^al.9, nous avons fourni des informations...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium	Sigma	T8877	Pour la coloration TTC
Animal Mini Ventilator	Havard	Type 845	Pour la ventilation artificielle
Système d’échographie animale VEVO2100	Visual Sonic		VEVO2100 Mesure de la vitesse d’écoulement Doppler et de la plaque AS
Batson' s #17 Kit de corrosion anatomique	Polyscience Inc	7349	Pour la coulée
de la buprénorphine	Isoreag	1134630-70-8	Pour réduire la douleur des souris après la chirurgie
Souris C57BL / 6J + D29A1A2 : D27	Centre animalier de l’Université de médecine du	Sud-Pour	la génération de souris RVI modèle
Appareil photo	Sangnond		Pour prendre des photos
Lumière froide illuminateur	Olympus	ILD-2	Lumière pour le fonctionnement
électrocardiographe	ADI Instrument	ADAS1000	Pour l’enregistrement électrocardiogramme
crème dépilatoire	Reckitt Benchiser	RQ/B 33 Type 2	Enlever les poils de souris
Coussin chauffant - système chirurgical thermostatique (ALC-HTP-S1)	SHANGHAI ALCOTT BIOTECH CO	ALC-HTP-S1	Chauffage
Hématoxyline-éosine colorant	Leagene	DH0003	Coloration à l’hématoxyline-éosine Sel sodique
	Macklin	H837056	Pour l’héparisation
Isoflurane	RWD sciences de la vie	R510-22	Anesthésie par inhalation
Spatule			en laboratoire Fonctionne comme un laryngoscope
Canule			en laboratoire Pour l’intubation
Matrx VIP 3000 Vaporisateur Isofurane	Midmark Corporation	VIP 3000	Anesthésie
Suture médicale en nylon (5-0)	Ningbo Medical Needle Co.	5-0	Pour la poitrine Pince
épiler microchirurgicale	RWD sciences de la vie	F11021-11	Pour la chirurgie
Ciseaux microchirurgicaux	NAPOX	MB-54-1	Pour l’artériotomie
Cathéter Millar	AD Instruments, Shanghai	1.0F	Mesure du gradient de pression
Sonde à ultrasons Visual	Sonic	MS400D	Mesure pour l’écoulement Doppler vitesse et AS plaque
aiguille pince	Visual Sonic	F31006-12	Pour la chirurgie
nitroglycérine	BEIJING YIMIN MEDICINE Co		Pour la dilatation de l’artère coronaire
Ciseaux ophtalmiques	RWD sciences de la vie	S11022-14	Pour la chirurgie
Pentobarbital sel de sodium	Merck	25MG	Anesthésie
PowerLab Multi-Directionnel Système d’enregistrement physiologique	AD Instruments, Shanghai	4/35	Enregistrement de la pression
Balance électronique de précision	Denver Instrument	TB-114	Balance
Suture en soie (8-0)	Ningbo Medical Needle Co.	6-0	ligature de l’artère coronaire Matériel
microchirurgie des petits animaux	Napox	MA-65	Instruments chirurgicaux
pince à tissus	Visual Sonic	F-12007-10	Pour la chirurgie
ciseaux tissulaires	Visual Sonic	S13052-12	Poitrine ouverte pour la mesure hémodynamique
Transmission Gel	Guang Gong pai	250ML	préparation pour Mesure par échocardiographie
Pinces vasculaires	Visual Sonic	R31005-06	Pour bloquer le sang de l’aorte