Summary
ישנם מספר הבדלים בין החדרים הימניים והשמאליים. עם זאת, הפתופיזיולוגיה של אוטם החדר הימני (RVI) לא הובהרה. בפרוטוקול הנוכחי, מוצגת שיטה ניתנת לשחזור ליצירת מודל עכבר RVI, אשר עשויה לספק אמצעי להסביר את המנגנון של RVI.
Abstract
אוטם חדר ימין (RVI) הוא מצגת נפוצה בפרקטיקה הקלינית. RVI חמור יכול להוביל לתפקוד המודינמי קטלני והפרעות קצב. בניגוד למודל אוטם שריר הלב של העכבר (MI) הנפוץ שנוצר על ידי קשירת עורקים כליליים שמאליים, מודל העכבר RVI משמש לעתים רחוקות בשל הקושי הקשור ליצירת מודל. מחקר על המנגנונים והטיפול בשיפוץ RV ותפקוד לקוי המושרה על ידי RVI דורש מודלים של בעלי חיים כדי לחקות את הפתופיזיולוגיה של RVI בחולים. מחקר זה מציג הליך אפשרי ליצירת מודל RVI בעכברי C57BL/6J. יתר על כן, מודל זה אופיין על סמך הדברים הבאים: הערכת גודל אוטם ב 24 שעות לאחר MI, הערכה של שיפוץ לב ותפקוד עם אקוקרדיוגרפיה, הערכת המודינמיקה RV, והיסטולוגיה של אזור האוטם ב 4 שבועות לאחר RVI. בנוסף, בוצע יציקת כלי דם כלילית כדי לבחון את סידור העורקים הכליליים ב- RV. מודל עכבר זה של RVI יקל על המחקר על מנגנונים של אי ספיקת לב נכונה ויחפש מטרות טיפוליות חדשות של שיפוץ קרוואנים.
Introduction
החדר הימני (RV), שנחשב במשך זמן רב לצינור פשוט המחובר לעורק הריאתי, הוזנח שלא כדין במשך שנים רבות1. עם זאת, לאחרונה חלה התעניינות גוברת בתפקוד הקרוואנים מכיוון שהיא ממלאת תפקיד חיוני בהפרעות המודינמיות 2,3 ועשויה לשמש כמנבאת סיכון עצמאית למחלות לב וכלי דם 4,5,6,7. מחלות RV כוללות אוטם RV (RVI), יתר לחץ דם בעורקים ריאתיים ומחלה וולוולרית8. בניגוד לעניין העצום ביתר לחץ דם בעורקים ריאתיים, RVI נותר מוזנח 7,9.
RVI, המלווה בדרך כלל באוטם שריר הלב נחות-אחורי10,11, נגרם על ידי חסימת עורק כלילי ימני (RCA). על פי מחקרים קליניים, RVI חמור ככל הנראה גורם להפרעות המודינמיות והפרעות קצב, כגון לחץ דם, ברדיקרדיה וגוש אטריו-חדרי, הקשורים לתחלואה גבוהה יותר בבית החולים ולתמותהשל 12,13,14. תפקוד RV יכול להתאושש באופן ספונטני במידה מסוימת גם בהיעדר רפרפוזיה15,16. קיימים מספר הבדלים מורפולוגיים ותפקודיים בין החדר השמאלי (LV) לבין RV17. RV הוא האמין להיות עמיד יותר איסכמיה מאשר LV8, בין היתר בשל היווצרות סירקולציה בטחונית נרחבת יותר לאחר RVI. הבהרת ההבדלים בין אוטם LV (LVI) ל-RVI וזיהוי המנגנונים הבסיסיים יספקו מטרות טיפוליות חדשות להתחדשות לב ואי ספיקת לב איסכמית. עם זאת, בשל הקושי הקשור ליצירת מודל עכבר RVI, המחקר הבסיסי על RVI מוגבל בעיקר.
מודל חייתי גדול של RVI נוצר על ידי קשירת RCA בחזיר18, אשר קל יותר לתפעול בגלל RCA גלוי. בהשוואה למודל החיות הגדול, למודל העכבר יש את היתרונות הבאים: נגישות רבה יותר במניפולציה גנטית, עלות כלכלית נמוכה יותר ותקופת ניסוי קצרה יותר19,20. למרות שמודל RVI של עכבר המתמקד בהשפעת RVI על פונקציית LV דווח בעבר, השלבים המפורטים של ההליך, הקשיים ונקודות המפתח של הפעולה, ומאפייני המודל כגון שינויים המודינמיים לא הוכנסו במלואם 9,21.
מאמר זה מספק הליכים כירורגיים מפורטים ליצירת מודל עכבר של RVI. יתר על כן, מודל זה התאפיין במדידה אקוקרדיוגרפית, הערכה המודינמית פולשנית וניתוח היסטולוגי. יתר על כן, בוצע יציקת כלי דם כלילית כדי לבחון את סידור העורקים הכליליים ב-RV. הטכניקה שהוצגה במאמר זה תסייע למתחילים לתפוס במהירות את הדור של מודל RVI העכבר עם תמותת פעולה מקובלת וגישות הערכה אמינות. מודל העכבר של RVI יעזור לחקור את המנגנונים של אי ספיקת לב נכונה ולחפש מטרות טיפוליות חדשות של שיפוץ קרוואנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בוצעו על פי המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה שפורסם על ידי המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב (פרסום NIH מס '85-23, תוקן בשנת 1996) ואושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של בית החולים ננפאנג, האוניברסיטה הרפואית הדרומית (גואנגג'ואו, סין). עכברי C57BL/6J זכרים בריאים (בני 8-10 שבועות; משקל גוף, 25-30 גרם) התקבלו ממרכז החיות של האוניברסיטה הדרומית לרפואה. ניתן גם להשתמש בעכברות נקבות, אך ערבוב שני המינים אינו מומלץ בשל ההשפעות הפוטנציאליות של הבדלי המין. לאחר הגעתם, העכברים שוכנו תחת מחזור כהה/אור של 12 שעות/12 שעות (3-4 עכברים לכל כלוב), עם מזון ומים של ad libitum.
1. הכנה לניתוח
- לעקר כלי ניתוח על ידי אוטוקלאב לפני הניתוח. כוונו את משטח החימום ל-37 מעלות צלזיוס.
- מרדימים את העכברים על ידי הזרקה תוך-צפקית של 50 מ"ג/ק"ג פנטוברביטל (ראו טבלת חומרים) כדי להקל על כאבים כירורגיים. מניחים את העכברים בקופסאות נפרדות לצורך אינדוקציה של הרדמה. ודא את עומק ההרדמה על ידי היעדר תגובה לגמילה מהבוהן.
הערה: מומלץ גם להשתמש ב-1.5% איזופלורן להרדמה בשאיפה מכיוון שהיא טובה יותר לשיכוך כאבים. - מניחים את העכברים על הפד על ידי תיקון החותכים שלהם עם תפר ומשתקים את איבריהם בנייר דבק. ודא שוב את עומק ההרדמה על ידי בדיקת הרפלקס.
- מוציאים את השיער מהצוואר ל-xiphoid עם קרם דפילטורי. יש לחטא את האזור הכירורגי 3 פעמים עם קרצוף חיטוי לסירוגין ו-75% אלכוהול ולאחר מכן לעטוף את שדה הניתוח.
- בצע אינטובציה בהתאם לשלבים הבאים.
- התאם את תדירות הנשימה של החיה באמצעות מכונת הנשמה קטנה (ראה טבלת חומרים) ל-150/min ואת נפח הגאות והשפל ל-300 μL.
הערה: אין צורך להשתמש במצב לחץ חיובי של סוף תפוגה. - משכו מעט את הלשון עם פינצטה, הרימו את המנדיבל עם מדכא לשון כדי לחשוף את הגלוטי, ובצעו אינטובציה תוך-קנה הנשימה על ידי החדרת צינורית 22 גרם לתוך הגלוטיס.
- הפעילו את מאוורר המיני וחברו את צינורית קנה הנשימה למכונת ההנשמה. התופעה של גלי החזה ההופכים להיות שווים לתדירות ההנשמה מצביעה על אינטובציה מוצלחת. תקן את הצינורית עם סרט כדי למנוע החלקה במהלך הפעולה.
- התאם את תדירות הנשימה של החיה באמצעות מכונת הנשמה קטנה (ראה טבלת חומרים) ל-150/min ואת נפח הגאות והשפל ל-300 μL.
2. קשירת קבע של העורק הכלילי הימני
- חברו את האלקטרודות האלקטרוקרדיוגרפיה (א.ק.ג.) (ראו טבלת חומרים) לגפי העכבר בצורה נכונה ותעדו את האק"ג.
הערה: אחת מההובלות II, III או AVF נבחרת כהפניית ניטור; עופרת III מתאימה יותר. - פתח את החזה.
- בצע חתך באורך 1 ס"מ בעור במקביל לצלע הימנית השלישית עם מספריים עיניים. קבעו שוב את האינטרקוסטאל השלישי והבטיחו מקום הולם בהתאם לזווית עצם החזה.
הערה: כיוון חתך העור נעשה מזווית עצם החזה לקו בית השחי הקדמי הימני. - מפרידים וחותכים את שרירי הפקטורליס מז'ור והפקטורליס המינוריים עם מספריים ומלקחיים זעירים מעל החלל האינטרקוסטלי השלישי. לאחר מכן, באופן בוטה להפריד את השריר intercostal עם מלקחיים מרפק כדי לחשוף את שדה הניתוח.
הערה: רק חלק קטן משרירי החזה צריך להיחתך, ולאחר מכן מומלץ הפרדה קהה כדי לחשוף את הלב. - להסית את קרום הלב. הרימו את האטריום הימני עם כותנה סטרילית והעבירו את ה-RCA עם 8-0 סטרילי חוט ניילון עם טווח קשירת קשירה של 3-5 מ"מ. לאחר קשירת ה-RCA, א.ק.ג. הניטור (עופרת III) מראה גובה מקטע ST.
הערה: מכיוון שהעכבר RCA אינו נראה, יש לאשר בזהירות את מיקומו האנטומי. שריר הלב של ה- RV דק בהרבה מזה של ה- LV. לכן, קשה לתפוס את עומק המחט שהוכנסה. קל לגרום לסינוס ברדיקרדיה ולחסימה אטריו-חדרית אם עומק המחט המוחדרת עמוק מדי וטווח הקשירה גדול מדי.
- בצע חתך באורך 1 ס"מ בעור במקביל לצלע הימנית השלישית עם מספריים עיניים. קבעו שוב את האינטרקוסטאל השלישי והבטיחו מקום הולם בהתאם לזווית עצם החזה.
- הסר את שרירי הכותנה והתפר הסטרילית ואת העור עם חוט ניילון סטרילי 5-0 כדי לסגור את החתך הבין-כוכבי. יש לחטא שוב את העור ב-75% אלכוהול ולאכלס את העכבר לאחר הניתוח.
הערה: השריר התפור היטב חשוב למניעת אווירותורקס. צינור ניקוז סטרילי ממוקם בחלל החזה עד להשלמת סגירת החזה, ואז חלל החזה מפונה על ידי מזרק הזרקה המחבר את צינור הניקוז.
הערה: לאחר הניתוח, העכברים מונחים על כרית חימום. משככי כאבים כגון בופרנורפין (משקל גוף של 0.1 מ"ג/ק"ג, הזרקה תת עורית) נדרשים כדי להפחית את כאבי בעלי החיים לאחר הניתוח. הסיבוכים הצפויים הם סינוסים ברדיקרדיה וגוש אטריו-חדרי, ושיעור התמותה לאחר הניתוח הוא 10-20%.
3. הערכה אקוקרדיוגרפית של תפקוד ה-RV לאחר הניתוח
הערה: עבור אקוקרדיוגרפיה, השתמש בבדיקת MS400D עם תדר מרכזי של 30 MHz, המחוברת למערכת הדמיית אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה (ראה טבלת חומרים). בדיקת האקוקרדיוגרפיה מבוצעת 4 שבועות לאחר הניתוח.
- הרדמה את העכבר עם 3% איזופלורן באמצעות שאיפה.
- מקם את העכבר במצב שכיבה על פלטפורמה קולית לקיבוע בעלי חיים ופעולה קולית. הצמידו את ציפורניו לאלקטרודה כדי לקבל הקלטת א.ק.ג באמצעות מערכת המחוברת למכונה האולטרה-קולית.
- עקוב אחר הדופק באמצעות אק"ג ושמור עליו בין 450-550 פעימות לדקה על ידי התאמת ריכוז ההרדמה בין 1.5% ל-3%.
- יש להסיר את השיער מהחזה של העכבר עם קרם depilatory ולהחיל ג'ל אולטרסאונד על העור של החזה.
- הגדר את הפלטפורמה למצב האופקי. כוון את המתמר במקביל לרגל שמאל וקבל את תמונת הציר הארוך בחדר השמאלי. סובב את הגשושית 90° בכיוון השעון כדי לקבל את תצוגת הציר הקצר של LV. לחץ על לחצן חנות Cine כדי לשמור את התמונות.
הערה: השמאלית העליונה של הפלטפורמה מוטה בנקודה הנמוכה ביותר. זווית הסיבוב של LV עם ציר קצר של המתמר נשמרת בעוד שהמתמר מכוון לכיוון הכתף הימנית של העכבר. - לנוע במורד המתמר אנכית, תוך שמירה על מיקומו מעל הבטן העליונה ומתחת לסרעפת העכבר במצב B. התאימו מעט את מיקום הפלטפורמה על ידי סיבוב צירי ה-x וה-y שלה עד שה-RV, האטריום הימני (RA), האטריום השמאלי (LA) וה-LV ייראו בבירור על המסך. שמור תמונות אפיות בעלות ארבעה תאים על-ידי לחיצה על לחצן חנות Cine או על לחצן חנות Frame .
הערה: מצב B משמש להצגת התצוגה הדו-ממדית (2D) של הלב. - לחץ על מצב M; לאחר הופעת קו החיווי 2x, אתר את קו המחוון בפתח השסתום הטריקוספידי כדי לקבל את התנועה של המישור הטבעתי הטריקוספידי. לחץ על לחצן חנות Cine או על אחסון מסגרות כדי לשמור נתונים ותמונות.
הערה: מצב M פירושו מצב תנועה, החושף את תנועת הלב או הכלי בצורה עקומה. - לחץ על לחצן מדידה כדי להיכנס למצב מדידה. לחץ על כפתור מדידת שטח לאזור לתוך RV ו- LV. חשב את השטח של RV ו- LV כדי לקבל את יחס השטח של RV ל- LV.
- לחץ על כפתור ציר הזמן וצור שני קווי בסיס כדי להגדיר את טווח התנועה של המישור הטבעתי הטריקוספידי במהלך התקופות הסיסטולית והדיסטולית. לחץ על כפתור המרחק ומדוד את המרחק בין שני קווי בסיס כדי לקבל טיול סיסטולי במישור הטבעתי טריקוספידי (TAPSE).
- הטה את הצד השמאלי של הרציף בנקודה הנמוכה ביותר. שמור את הגשושית בזווית של 30° על הציר האופקי לאורך קו בית השחי הקדמי הימני. סובב את צירי ה-x וה-y של הפלטפורמה כדי להציג את ה-RV.
- לחץ על לחצן מצב M ואתר את קו המחוון בנקודה ההיפר-כואית של המחיצה כדי לקבל את תמונת מצב M של ממשק ה- RV. לחץ על לחצן חנות Cine כדי לשמור את התמונה.
- פתח את התמונה במצב M של ממשק ה- RV, לחץ על לחצן מדידה כדי להיכנס למצב מדידה. מדוד את המרחק הפנימי של RV בקצה הדיאסטולה (RVIDd), שבר פליטת ה-RV (RVEF) וקיצור שבר ה-RV (RVFS) באמצעות כלי המדידה המובנה של המערכת האקו-לב.
- הפסיקו לתת איזופלורן והניחו את העכבר על משטח החימום למשך 3-5 דקות עד שהוא חוזר להכרה. לאחר מכן, החזירו את העכבר לכלוב שלו עם מחזור אור/חושך של 12 שעות.
4. מדידות פולשניות של המודינמיקה של RV
הערה: המודינמיקה של RV מוערכת באמצעות צנתור לב ימין 4 שבועות לאחר RVI. צנתר 1.0 F יחד עם מערכת ניטור מוחל.
- להרדים את העכבר בזריקה תוך-צפקית של 50 מ"ג/ק"ג נתרן פנטוברביטל (ראו טבלת חומרים).
- לאחר אישור היעלמותו של רפלקס נסיגת הדוושה, שמור את העכבר במצב שכיבה ושתק אותו עם סרט דבק.
- גילחו את שיער החזה מזווית החזה אל ה-xiphoid. יש לחטא את אזור הניתוח ב-75% אלכוהול.
- בצע אינטובציה של קנה הנשימה והגדר את הפרמטר של מכונת ההנשמה של בעלי החיים כמתואר בשלבים 1.5.2-1.5.3.
- בצע חתך דו-צדדי של 1 ס"מ על העור מעל תהליך ה- xiphoid והעביר את הסרעפת והצלע עם מספריים עיניים כדי לחשוף את הלב.
- נקבו את הקיר החופשי בחדר הימני עם מחט 32 גרם. מוציאים את המחט ולוחצים על הפצע בכותנה כדי לדמם.
- הכנס את קצה הצנתר לחדר הימני דרך אתר הניקוב ודחף את הצנתר קדימה באיטיות. התאם את מיקום הקצה כדי לקבל צורת גל טיפוסית של לחץ RV המוצגת בצג ובמערכת הקלטה.
הערה: וריד ג'וגולרי ימני הוא גם מסלול מתאים למדידה המודינמית. - לאחר 10 דקות של ייצוב, רשמו את הנתונים של לחץ דם סיסטולי של RV (RVSBP), לחץ אנד-דיאסטולי של RV (RVEDP) ו-RV dP/dt. לחץ על בחר כפתור כדי לבחור מחזורי לב לחישוב ולאחר מכן לחץ על לחצן נתח כדי לחשב את הערכים הממוצעים של המחזורים שנבחרו.
- הסר את הצנתר לאחר השלמת ההקלטה ולאחר מכן הנח אותו בתוך תמיסת מלח רגילה.
- להרדים את העכבר בזריקה תוך-צפקית של נתרן פנטוברביטלי מינון יתר (150 מ"ג/ק"ג) ולאחר מכן להקריב אותו על ידי נקע צוואר הרחם.
- לאסוף את הלב ואת השוקה לניתוח היסטולוגי.
5. יציקת כלי דם כלילית באמצעות חומר יציקה וסקולרי
- הפריניזציה של העכבר בזריקה תוך-צפקית של 200 IU/mL של נתרן הפרין ב-2000 IU/kg (ראו טבלת חומרים).
- להרדים את העכבר בזריקה תוך-צפקית של 50 מ"ג/ק"ג נתרן פנטוברביטל.
- מניחים את הנחת החיה על הפד ואינטובציה לאוורור מלאכותי לאחר שלבים 1.5.2-1.5.3.
- פתח את החזה עם מספריים כירורגיים כמתואר בשלב 4.5 וחשוף את הלב.
- הכינו חריץ 3 מ"מ עם מספריים עיניים על האטריה הימנית והכניסו את הלב ל-5 מ"ל של מי מלח תקינים דרך פסגת הלב עם מזרק.
- חוסמים את הדם מאבי העורקים עם מהדק אבי העורקים ומכניסים 0.1 מ"ל של ניטרוגליצרין (1 מ"ג/מ"ל) דרך פסגת הלב עם מזרק להרחבת העורק הכלילי.
- מכינים את הריאגנט יצוק על ידי ערבוב המרכיבים בערכה בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים).
הערה: מומלץ להכין את המגיב הייציק ואת הזלוף עם מלח רגיל וניטרוגליצרין בו זמנית כדי למנוע סגירה מיקרו-וסקולרית. - מכניסים את הלב ל-1 מ"ל של ריאגנט יצוק דרך פסגת הלב ומחכים 2-3 שעות.
- לשחוק את הלב עם 50% נתרן הידרוקסיד במשך 2-3 ימים ולהסיר את רקמת השריר או רקמת החיבור על ידי שטיפה עם מלח רגיל.
- צלם תמונות מתחת למצלמה.
אזהרה: המגיב יצוק מזיק לעיניים, לעור ולדרכי הנשימה. נתרן הידרוקסיד הוא קורוזיבי. יש ללבוש כפפות מגן, משקפי מגן ומעיל מעבדה. יש להכין את המגיב יצוק במכסה אדים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקר זה, עכברים הוקצו באופן אקראי לקבוצת RVI (n = 11) או פעולת ה-sham (n = 11). הגבס הכלילי בשני לבבות עכברים רגילים מוצג באיור 1A. בתגובה לקשירת RCA, גובה מקטע ST נצפה בעופרת III של האק"ג (איור 1B). יתר על כן, צביעה של 2,3,5,5 טריפניל טטרזוליום כלוריד (TTC) הראתה שאזור האוטם מהווה 45% מהקיר נטול הקרוואנים ב-24 שעות לאחר הניתוח (איור 1C,D). הנתונים לעיל הצביעו על הדור המוצלח של מודל העכבר RVI.
הקלטות של תצוגת ה-apex בעלת 4 התאים (איור 2A) ותצוגת 2-תאים בציר הקצר של LV ושל מדידות האקוקרדיוגרפיה המתאימה של מצב M (איור 2B) בוצעו ב-4 שבועות לאחר הניתוח כדי להעריך את שיפוץ ה-RV ותפקודו. בהשוואה לזה שבקבוצת ה-sham, הממד הפנימי של ה-RV בסוף הדיאסטולה (RVIDd) עלה בקבוצת ה-RVI (איור 2C), והוא היה יותר מפי 2 בקבוצת ה-sham (איור 2A). שבר פליטת RV (RVEF), קיצור שבר RV (RVFS) וטיול סיסטולי במישור הטבעתי הטריקוספידי (TAPSE) היו קטנים משמעותית בקבוצת RVI מאשר בקבוצת ה-sham (איור 2D-F). יחס השטח של RV/LV עלה בכ-50% ביחס לקבוצת ה-sham (איור 2G).
העכברים היו נתונים למדידה המודינמית של RV 4 שבועות לאחר הניתוח. בקבוצת RVI, RVSBP, dp/dt max, dp/dt min והתכווצות RV היו קטנים משמעותית. יחד עם זאת, מדדי RVEDP ו-τ (tau) היו משמעותיים בהרבה מאלה שבקבוצת ה-sham (איור 3A-E).
ארבעה שבועות לאחר הניתוח הוקרבו העכברים. מפרצת קרוואנים נראתה באזור האוטם (איור 4A). יחס משקל הלב למשקל הגוף (HW/BW) ויחס משקל הלב לאורך השוקה (HW/TL) בקבוצת RVI היו מעט גדולים יותר (ללא מובהקות סטטיסטית) מאלה שבקבוצת ה-sham (איור 4B,C). צביעת מאסון22 הצביעה על פיברוזיס משמעותי בדופן נטולת הקרוואנים, ורק לעתים רחוקות פיברוזיס התרחש במחיצה בקבוצת RVI (איור 4D,E). לעומת זאת, כמה קרדיומיוציטים ששרדו היו באזור האוטם (איור 4F).
איור 1: אלקטרוקרדיוגרפיה (א.ק.ג.) משתנה וגודל האוטם לאחר קשירת העורק הכלילי הימני (RCA). (A) תמונות מייצגות של יציקת כלי דם כלילית של עכברים. סרגל קנה מידה = 4 מ"מ. (B) שינוי א.ק.ג. עופרת III בתגובה לקשירת RCA. (C) תמונות מייצגות של צביעת 2,3,5-טריפניל טטרזוליום כלוריד (TTC) (לבן מציין אזור אוטם, אדום מציין רקמה בת קיימא). סרגל קנה מידה = 4 מ"מ. (D) כמות גודל אוטם שריר הלב של עכברי RVI. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM, *P < 0.01 לעומת. קבוצת sham, n = 6 לכל קבוצה (שתי בדיקות t מדגם בלתי תלויות). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: הערכה אקוקרדיוגרפית של שיפוץ החדר הימני (RV) ותפקודו בעכברים הנתונים לקשירת RCA. (A) תמונות במצב B מייצג בתצוגת ארבעה תאים 4 שבועות לאחר קשירת RCA; סרגל קנה מידה = 2 מ"מ. (B) תמונות אופייניות של מצב B בממשק החדר הימני (למעלה) ומצב M המתאים (למטה) המציגות גם LV וגם RV ב-4 שבועות לאחר קשירת RCA; סרגל קנה מידה = 2 מ"מ. (C) RV ממד פנימי בסוף דיאסטולה (RVIDd). (D) קיצור שבר RV (RVFS). (E) שבר פליטת RV (RVEF). (F) טיול סיסטולי במישור טבעתי טריקוספידי (TAPSE). (G) יחס שטח RV/LV. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. *P < 0.01 לעומת. קבוצת sham, n = 6 לכל קבוצה (שתי בדיקות t מדגם בלתי תלויות). LV, החדר השמאלי; RVI, אוטם חדר ימין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: המודינמיקה של החדר הימני (RV) ב-4 שבועות לאחר קשירת עורקים כליליים ימניים. (B) לחץ דם סיסטולי בחדר ימין (RVSBP) ולחץ דיאסטולי קצה-חדרי ימני (RVEDP). (C) קצב העלייה המרבי והמינימום של לחץ RV (dp/dt max, dp/dt min). (ד) התכווצות קרוואנים. (E) קבוע הזמן האקספוננציאלי של הרפיית RV (τ). *P < 0.01 לעומת קבוצת sham, n = 6 לכל קבוצה (שתי בדיקות t מדגם בלתי תלויות). הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. RVI, אוטם החדר הימני; RVP, לחץ חדר ימין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: תוצאות היסטולוגיות ב-4 שבועות אחרי RVI. (A) תמונות של לב ייצוגי שלם מקבוצת sham ו-RVI (עיגול אדום מציין דופן אוטם; סרגל קנה מידה = 3 מ"מ). (B) יחס משקל לב למשקל גוף (HW/BW), P = 0.0536 בין RVI לקבוצת sham. (C) יחס אורך HW לטיביה (HW/TL), P = 0.1682 בין RVI לקבוצת sham. (D) מייצגים תמונות של צביעת המטוקסילין-אאוזין וצביעת מאסון של חלקי לב (סרגל קנה מידה = 3 מ"מ). (E) תוצאות כמותיות של פיברוזיס שריר הלב. (F) תמונות צביעה מייצגות של מאסון המציגות קרדיומיוציטים הישרדותיים באזור האוטם (התמונה הימנית (סרגל קנה המידה = 100 μm) היא הגדלה של הרקמה בתיבה השמאלית (סרגל קנה מידה = 1 מ"מ). *P < 0.01 לעומת קבוצת sham, n = 6 לכל קבוצה (שתי דגימות בלתי תלויות t-test). הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. RVI, אוטם החדר הימני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
סיקארד ועמיתיו מצרפת דיווחו לראשונה על מודל עכבר של RVI בשנת 2019, שתיאר את התהליך הכירורגי והתמקד באינטראקציה בין LV ל- RV לאחר RVI9. עם זאת, עד כה, אף מחקר לא דיווח על שימוש במודל זה למחקרים נוספים. הליך מפורט יותר יעזור לחוקרים להשתמש במודל העכבר של RVI לחקירה. בניגוד לדו"ח של Sicard et al.9, סיפקנו מידע שלב אחר שלב ליצירת מודלים ואסטרטגיה לבקרת איכות והערכנו עוד יותר את ההתפלגות האנטומית של RCA, המודינמיקה של RV והישרדותם של קרדיומיוציטים באזור האוטם. דו"ח שפורסם לאחרונה הראה כי קרדיומיוציטים באזור האוטם ממלאים תפקיד חיוני בהתחדשות שריר הלב23. תפקוד ה-RV בחולים עם RVI יתאושש באופן ספונטני תוך 3-12 חודשים, גם ללא רפרפוזיהשל 16,24. ממצאים אלה מצביעים על כך שמודל ה-RVI של העכברים יעזור לחפש מטרות טיפוליות פוטנציאליות לאי ספיקת לב נכונה או להתחדשות הלב. לכן, יש צורך לפופולריזציה של המודל.
בשל חוסר הנראות של RCA והשונות של התפלגות RCA, יהיה קשה למפעילים הזוטרים ליצור דגמי RVI עם גדלי אוטם יציבים. כדי להתגבר על מגבלה זו, מומלץ לשלוט ברמת הקשירה ובטווח ולהבטיח גובה מספיק של מקטע ST בהובלה II או III של אק"ג. הצעד הקריטי ביותר ליצירת מודל RVI של עכבר בהצלחה הוא לאתר את המבנה האנטומי של RCA. כפי שמוצג באיור 1A, RCA של עכבר עשוי להכיל עורק ראשי או כמה עורקים מקבילים; לפיכך, גודל האוטם תלוי בכמה עורקים חסומים. לכן, תוך ניתוחי, ניתן לאשר את המיקום של RCA על פי המאפיינים האנטומיים של השכן האטריום הימני והווריד הנראה לעין. עכברי RVI בדרך כלל מפגינים אוטם שריר הלב בקיר החופשי של RV. ובכל זאת, המחיצה יכולה להיות מעורבת רק לעתים רחוקות אם עורק המחיצה מקורו ב-RCA, כפי שמוצג באיור 4D. ניתן להשקות את המחיצה בעכברים על ידי ענף עורקים כליליים מחיצות משלה25 או ענף של RCA או LCA26,27. לאחר קשירת ה-RCA, שינוי האק"ג הקלאסי של גובה מקטע ST בהפניות EEG II או III הוא תקן הזהב כדי לשפוט את ההצלחה של RVI.
מכיוון שהתרחבות RV המושרה על ידי קשירת RCA תגביר את הלחץ התוך-פריקרדיאלי ולאחר מכן תרסן את מילוי הלב, מה שיגרום להחמרה של הפרעה המודינמית 9,10, יש לקרוע את קרום הלב לגזרים במהלך הניתוח. בניגוד לשכיחות הגבוהה של קרע לבבי בעכברים עם קשירת LCA, לא נצפה קרע לבבי בעכברי RVI. עם זאת, תמותה כירורגית עקב דימום וחסימה אטריו-חדרית יכולה להיות גבוהה עד 50% למתחילים, אשר ניתן להימנע ממנה על ידי הקטנת עומק הפירסינג של תפר המחט וטווח שריר הלב של קשירת תפר, הורדת תנוחת הקשירה ומניפולציה עדינה. טכנאים מנוסים במעבדה שלנו יכולים להשלים את יצירתו של מודל עכבר RVI תוך כ-30 דקות עם שיעור הצלחה של 80%-90% המחושב על ידי שיעור ההישרדות של עכברים עם גודל אוטם משמעותי. הצלחת הניתוח נשפטה על ידי העלאה מיידית של מקטע ST בעופרת II או III של א.ק.ג. לאחר קשירת RCA, צביעה שלילית של TTC של שריר הלבב-1 st 24 שעות לאחר הניתוח, והרחבת RV שנמדדה על ידי אקוקרדיוגרפיה ב-3 ימים או שבוע לאחר הניתוח. עלייה ST במובילים א.ק.ג של דופן נחותה והתרחבות אקו-לב של RV ב-3 ימים לאחר הניתוח עשויה לשמש כקריטריון ההכללה למחקרים באמצעות מודל RVI של עכבר.
במהלך תקופת המעקב בת 4 השבועות, לא מעט קרדיומיוציטים ששרדו נצפו באזור האוטם של עכברי RVI, מה שעשוי להיות בסיס סביר למחקר רגנרטיבי. שיפוץ קרוואנים והתאוששות מתפקוד לקוי לאחר 4 שבועות לא צוינו לאחר RVI במודל זה, מה שמרמז על כך שמודל זה אפשרי גם למחקר בסיסי על שיפוץ לב ימין וכישלון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82073851 לשמש) ומהקרן הלאומית למדע הבתר-דוקטורט של סין (2021M690074 ללין).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride | Sigma | T8877 | For TTC staining |
| Animal Mini Ventilator | Havard | Type 845 | For artificial ventilation |
| Animal ultrasound system VEVO2100 | Visual Sonic | VEVO2100 | Measurement for Doppler flow velocity and AS plaque |
| Batson’s #17 Anatomical Corrosion Kit | Polyscience Inc | 7349 | For vasculature casting |
| buprenorphine | Isoreag | 1134630-70-8 | For reduce the pain of mice after surgery |
| C57BL/6J mice + D29A1A2:D27 | Animal Center of South Medical University | - | For the generation of mouse RVI model |
| Camera | Sangnond | For taking photograph | |
| Cold light illuminator | Olympus | ILD-2 | Light for operation |
| electrocardiograph | ADI Instrument | ADAS1000 | For recording electrocardiogram |
| hair removal cream | Reckitt Benchiser | RQ/B 33 Type 2 | Remove mouse hair |
| Heat pad- thermostatic surgical system (ALC-HTP-S1) | SHANGHAI ALCOTT BIOTECH CO | ALC-HTP-S1 | Heating |
| Hematoxylin-eosin dye | Leagene | DH0003 | Hematoxylin-eosin staining |
| Heparin sodium salt | Macklin | H837056 | For heparization |
| Isoflurane | RWD life science | R510-22 | Inhalant anaesthesia |
| Lab made spatula | Work as a laryngoscope | ||
| Lab made tracheal cannula | For intubation | ||
| Matrx VIP 3000 Isofurane Vaporizer | Midmark Corporation | VIP 3000 | Anesthetization |
| Medical nylon suture (5-0) | Ningbo Medical Needle Co. | 5-0 | For chest close |
| Microsurgical elbow tweezers | RWD life science | F11021-11 | For surgery |
| Microsurgical scissors | NAPOX | MB-54-1 | For arteriotomy |
| Millar Catheter | AD Instruments, Shanghai | 1.0F | Measurement of pressure gradient |
| MS400D ultrasonic probe | Visual Sonic | MS400D | Measurement for Doppler flow velocity and AS plaque |
| needle forceps | Visual Sonic | F31006-12 | For surgery |
| nitroglycerin | BEIJING YIMIN MEDICINE Co | For dilating coronary artery | |
| Ophthalmic scissors | RWD life science | S11022-14 | For surgery |
| Pentobarbital sodium salt | Merck | 25MG | Anesthetization |
| PowerLab Multi-Directional Physiological Recording System | AD Instruments, Shanghai | 4/35 | Pressure recording |
| Precision electronic balance | Denver Instrument | TB-114 | Weighing scale |
| Silk suture (8-0) | Ningbo Medical Needle Co. | 6-0 | coronary artery ligation |
| Small animal microsurgery equipment | Napox | MA-65 | Surgical instruments |
| tissue forceps | Visual Sonic | F-12007-10 | For surgery |
| tissue scissor | Visual Sonic | S13052-12 | Open chest for hemodynamic measurement |
| Transmission Gel | Guang Gong pai | 250ML | preparation for Echocardiography measurement |
| Vascular Clamps | Visual Sonic | R31005-06 | For blocking blood from aorta |
References
- Rallidis, L. S., Makavos, G., Nihoyannopoulos, P. Right ventricular involvement in coronary artery disease: role of echocardiography for diagnosis and prognosis. Journal of the American Society of Echocardiography: Official Publication of the American Society of Echocardiography. 27 (3), 223-229 (2014).
- Frangogiannis, N. G. Fibroblasts and the extracellular matrix in right ventricular disease. Cardiovascular Research. 113 (12), 1453-1464 (2017).
- Ondrus, T., et al. Right ventricular myocardial infarction: From pathophysiology to prognosis. Experimental & Clinical Cardiology. 18 (1), 27-30 (2013).
- Badagliacca, R., et al. Right ventricular concentric hypertrophy and clinical worsening in idiopathic pulmonary arterial hypertension. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (11), 1321-1329 (2016).
- Verhaert, D., et al. Right ventricular response to intensive medical therapy in advanced decompensated heart failure. Circulation: Heart Failure. 3 (3), 340-346 (2010).
- Chen, K., et al. RNA interactions in right ventricular dysfunction induced type II cardiorenal syndrome. Aging (Albany NY). 13 (3), 4215-4241 (2021).
- Wang, Q., et al. Induction of right ventricular failure by pulmonary artery constriction and evaluation of right ventricular function in mice. Journal of Visualized Experiments. (147), e59431 (2019).
- Harjola, V. P., et al. Contemporary management of acute right ventricular failure: A statement from the heart failure association and the working group on pulmonary circulation and right ventricular function of the European society of cardiology. European Journal of Heart Failure. 18 (3), 226-241 (2016).
- Sicard, P., et al. Right coronary artery ligation in mice: a novel method to investigate right ventricular dysfunction and biventricular interaction. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 316 (3), 684-692 (2019).
- Goldstein, J. A. Pathophysiology and management of right heart ischemia. Journal of the American College of Cardiology. 40 (5), 841-853 (2002).
- Stiermaier, T., et al. Frequency and prognostic impact of right ventricular involvement in acute myocardial infarction. Heart. 0, 1-8 (2020).
- Zehender, M., et al. Right ventricular infarction as an independent predictor of prognosis after acute inferior myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 328 (14), 981-988 (1993).
- Brodie, B. R., et al. Comparison of late survival in patients with cardiogenic shock due to right ventricular infarction versus left ventricular pump failure following primary percutaneous coronary intervention for ST-elevation acute myocardial infarction. The American Journal of Cardiology. 99 (4), 431-435 (2007).
- Konstam, M. A., et al. Evaluation and management of right-sided heart failure: A scientific statement from the american heart association. Circulation. 137 (20), 578-622 (2018).
- Leferovich, J. M., et al. Heart regeneration in adult MRL mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9830-9835 (2001).
- Dell'Italia, L. J., et al. Hemodynamically important right ventricular infarction: Follow-up evaluation of right ventricular systolic function at rest and during exercise with radionuclide ventriculography and respiratory gas exchange. Circulation. 75 (5), 996-1003 (1987).
- Friedberg, M. K., Redington, A. N. Right versus left ventricular failure: differences, similarities, and interactions. Circulation. 129 (9), 1033-1044 (2014).
- Haraldsen, P., Lindstedt, S., Metzsch, C., Algotsson, L., Ingemansson, R. A porcine model for acute ischaemic right ventricular dysfunction. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 18 (1), 43-48 (2014).
- Ren, L., Colafella, K. M. M., Bovée, D. M., Uijl, E., Danser, A. H. J. Targeting angiotensinogen with RNA-based therapeutics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 29 (2), 180-189 (2020).
- Hacker, T. A. Animal models and cardiac extracellular matrix research. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1098, 45-58 (2018).
- Chien, T. M., et al. Double right coronary artery and its clinical implications. Cardiology in the Young. 24 (1), 5-12 (2014).
- Zhu, Y., et al. Characterizing a long-term chronic heart failure model by transcriptomic alterations and monitoring of cardiac remodeling. Aging (Albany NY). 13 (10), 13585-13614 (2021).
- Cui, M., et al. Nrf1 promotes heart regeneration and repair by regulating proteostasis and redox balance. Nature Communications. 12 (1), 5270 (2021).
- Meyer, P., et al. Effects of right ventricular ejection fraction on outcomes in chronic systolic heart failure. Circulation. 121 (2), 252-258 (2010).
- Dunmore-Buyze, P. J., et al. Three-dimensional imaging of the mouse heart and vasculature using micro-CT and whole-body perfusion of iodine or phosphotungstic acid. Contrast Media & Molecular Imaging. 9 (5), 383-390 (2014).
- Fernández, B., et al. The coronary arteries of the C57BL/6 mouse strains: Implications for comparison with mutant models. Journal of Anatomy. 212 (1), 12-18 (2008).
- Zhang, H., Faber, J. E. De-novo collateral formation following acute myocardial infarction: Dependence on CCR2+ bone marrow cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 87, 4-16 (2015).
