Summary
Ci sono diverse differenze tra i ventricoli destro e sinistro. Tuttavia, la fisiopatologia dell'infarto ventricolare destro (RVI) non è stata chiarita. Nel presente protocollo viene introdotto un metodo riproducibile per la generazione di modelli murini RVI, che può fornire un mezzo per spiegare il meccanismo di RVI.
Abstract
L'infarto ventricolare destro (RVI) è una presentazione comune nella pratica clinica. La RVI grave può portare a disfunzione emodinamica fatale e aritmia. In contrasto con il modello di infarto miocardico di topo (MI) ampiamente utilizzato generato dalla legatura dell'arteria coronaria sinistra, il modello murino RVI è raramente impiegato a causa della difficoltà associata alla generazione del modello. La ricerca sui meccanismi e il trattamento del rimodellamento e della disfunzione del camper indotto da RVI richiede modelli animali per imitare la fisiopatologia della RVI nei pazienti. Questo studio introduce una procedura fattibile per la generazione di modelli RVI in topi C57BL/ 6J. Inoltre, questo modello è stato caratterizzato sulla base di quanto segue: valutazione delle dimensioni dell'infarto a 24 ore dopo l'infarto, valutazione del rimodellamento cardiaco e della funzione con ecocardiografia, valutazione dell'emodinamica del camper e istologia della zona dell'infarto a 4 settimane dopo RVI. Inoltre, è stato eseguito un calco vascolare coronarico per osservare la disposizione arteriosa coronaria in RV. Questo modello murino di RVI faciliterebbe la ricerca sui meccanismi dell'insufficienza cardiaca destra e cercherebbe nuovi bersagli terapeutici del rimodellamento del camper.
Introduction
Il ventricolo destro (RV), a lungo pensato per essere un semplice tubo collegato all'arteria polmonare, è stato erroneamente trascurato per molti anni1. Tuttavia, recentemente c'è stato un crescente interesse per la funzione RV poiché svolge un ruolo essenziale nei disturbi emodinamici 2,3 e può servire come predittore di rischio indipendente di malattie cardiovascolari 4,5,6,7. Le malattie RV includono infarto RV (RVI), ipertensione arteriosa polmonare e malattia valvolare8. In contrasto con l'immenso interesse per l'ipertensione dell'arteria polmonare, RVI è rimasto trascurato 7,9.
La RVI, di solito accompagnata da infarto miocardico inferiore-posteriore10,11, è causata dall'occlusione dell'arteria coronaria destra (RCA). Secondo le indagini cliniche, la RVI grave probabilmente induce disturbi emodinamici e aritmie, come ipotensione, bradicardia e blocco atrioventricolare, associati a una maggiore morbilità e mortalità ospedaliera 12,13,14. La funzione RV potrebbe recuperare spontaneamente in una certa misura anche in assenza di riperfusione15,16. Esistono diverse differenze morfologiche e funzionali tra il ventricolo sinistro (LV) e RV17. Si ritiene che il camper sia più resistente all'ischemia rispetto al LV8, in parte a causa della più ampia formazione di circolazione collaterale dopo RVI. Chiarire le differenze tra infarto LV (LVI) e RVI e identificare i meccanismi sottostanti fornirebbe nuovi bersagli terapeutici per la rigenerazione cardiaca e l'insufficienza cardiaca ischemica. Tuttavia, a causa della difficoltà associata alla generazione di modelli murini RVI, la ricerca di base su RVI è principalmente limitata.
Un grande modello animale di RVI è stato generato legando RCA in suini18, che è più facile da usare a causa del RCA visibile. Rispetto al modello animale di grandi dimensioni, il modello murino presenta i seguenti vantaggi: maggiore accessibilità nella manipolazione genica, costi economici inferiori e periodo sperimentale più breve19,20. Sebbene in precedenza fosse stato riportato un modello RVI murino incentrato sull'influenza di RVI sulla funzione LV, le fasi dettagliate della procedura, le difficoltà e i punti chiave di funzionamento e le caratteristiche del modello come i cambiamenti emodinamici non sono stati completamente introdotti 9,21.
Questo articolo fornisce procedure chirurgiche dettagliate per la generazione di un modello murino di RVI. Inoltre, questo modello è stato caratterizzato da misurazione ecocardiografica, valutazione emodinamica invasiva e analisi istologica. Inoltre, è stato eseguito un calco vascolare coronarico per osservare la disposizione arteriosa coronarica in RV. La tecnica introdotta in questo documento aiuterebbe i principianti a cogliere rapidamente la generazione del modello RVI del topo con mortalità operativa accettabile e approcci di valutazione affidabili. Il modello murino di RVI aiuterebbe a ricercare i meccanismi dell'insufficienza cardiaca destra e a cercare nuovi bersagli terapeutici del rimodellamento del camper.
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Protocol
Tutte le procedure sono state eseguite secondo la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio pubblicata dal National Institutes of Health degli Stati Uniti (pubblicazione NIH n. 85-23, rivista nel 1996) e sono state approvate dal Comitato etico animale dell'ospedale Nanfang, Southern Medical University (Guangzhou, Cina). Topi maschi sani C57BL / 6J (8-10 settimane; peso corporeo, 25-30 g) sono stati ottenuti dall'Animal Center della Southern Medical University. Possono essere utilizzati anche topi femmina, ma non è consigliabile mescolare entrambi i sessi a causa delle potenziali influenze delle differenze sessuali. Dopo l'arrivo, i topi sono stati alloggiati sotto un ciclo buio / luce di 12 ore / 12 ore (3-4 topi per gabbia), con cibo e acqua ad libitum.
1. Preparazione per la chirurgia
- Sterilizzare gli strumenti chirurgici mediante autoclave prima dell'intervento. Regolare la piastra riscaldante a 37 °C.
- Anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di 50 mg/kg di pentobarbital (vedi Tabella dei materiali) per alleviare il dolore chirurgico. Posizionare i topi in scatole separate per l'induzione dell'anestesia. Garantire la profondità dell'anestesia dall'assenza di una risposta di astinenza da punta.
NOTA: Si consiglia inoltre di utilizzare l'1,5% di isoflurano per l'anestesia per inalazione perché è meglio per l'analgesia. - Posiziona i topi supini sul pad fissando i loro incisivi con una sutura e immobilizzando i loro arti con nastro adesivo. Garantire nuovamente la profondità dell'anestesia controllando il riflesso.
- Rimuovere i peli dal collo allo xifoide con una crema depilatoria. Disinfettare l'area chirurgica 3 volte con scrub antisettico alternato e alcool al 75% e quindi drappeggiare il campo chirurgico.
- Eseguire l'intubazione seguendo i passaggi seguenti.
- Regolare la frequenza respiratoria dell'animale con un mini ventilatore (vedi Tabella dei materiali) a 150/min e il volume di marea a 300 μL.
NOTA: non è necessario utilizzare la modalità di pressione positiva di fine espirazione. - Estrarre leggermente la lingua con una pinzetta, sollevare la mandibola con un depressore della lingua per esporre la glottide ed eseguire l'intubazione intra-tracheale inserendo una cannula da 22 G nella glottide.
- Accendere il mini ventilatore e collegare la cannula tracheale al ventilatore. Il fenomeno dell'ondulazione toracica che diventa uguale alla frequenza del ventilatore indica un successo dell'intubazione. Fissare la cannula con del nastro adesivo per evitare che scivoli durante l'operazione.
- Regolare la frequenza respiratoria dell'animale con un mini ventilatore (vedi Tabella dei materiali) a 150/min e il volume di marea a 300 μL.
2. Legatura permanente dell'arteria coronaria destra
- Collegare correttamente gli elettrodi per elettrocardiografia (ECG) (vedere Tabella dei materiali) agli arti del topo e registrare l'ECG.
NOTA: uno dei lead II, III o AVF viene selezionato come lead di monitoraggio; Lead III è più appropriato. - Apri il petto.
- Fai un'incisione lunga 1 cm nella pelle parallela alla terza costola destra con forbici oftalmiche. Determinare nuovamente il terzo intercostale e garantire uno spazio adeguato in base all'angolo dello sterno.
NOTA: La direzione dell'incisione cutanea è fatta dall'angolo dello sterno alla linea ascellare anteriore destra. - Separare e tagliare i muscoli pettorali maggiori e pettorali minori con forbici e micro pinze sopra il terzo spazio intercostale. Successivamente, separare senza mezzi termini il muscolo intercostale con una pinza del gomito per esporre il campo chirurgico.
NOTA: Solo una piccola parte dei muscoli pettorali deve essere tagliata, e quindi si consiglia una separazione smussata per esporre il cuore. - Incidere il pericardio. Sollevare l'atrio destro con cotone sterile e legare l'RCA con uno sterile 8-0 filo di nylon con un intervallo di legatura di 3-5 mm. Dopo aver legato l'RCA, l'ECG di monitoraggio (piombo III) mostra l'elevazione del segmento ST.
NOTA: poiché l'RCA del mouse è invisibile, la sua posizione anatomica deve essere attentamente confermata. Il miocardio del camper è molto più sottile di quello del LV. Pertanto, è difficile afferrare la profondità dell'ago inserito. È facile indurre bradicardia sinusale e blocco atrioventricolare se la profondità dell'ago inserito è troppo profonda e l'intervallo di legatura è troppo ampio.
- Fai un'incisione lunga 1 cm nella pelle parallela alla terza costola destra con forbici oftalmiche. Determinare nuovamente il terzo intercostale e garantire uno spazio adeguato in base all'angolo dello sterno.
- Rimuovere il cotone sterile e suturare i muscoli e la pelle con un filo di nylon sterile 5-0 per chiudere l'incisione intercostale. Disinfettare nuovamente la pelle con alcol al 75% e utilizzare il topo dopo l'intervento chirurgico.
NOTA: Il muscolo ben suturato è importante per evitare l'aerotorace. Un tubo di drenaggio sterile viene posizionato nella cavità toracica fino al completamento della chiusura del torace, quindi la cavità toracica viene evacuata da una siringa per iniezione che collega il tubo di drenaggio.
NOTA: Dopo l'intervento chirurgico, i topi vengono posizionati su una piastra riscaldante. Analgesici come la buprenorfina (0,1 mg / kg di peso corporeo, iniezione sottocutanea) sono necessari per ridurre il dolore degli animali dopo l'intervento chirurgico. Le complicanze attese sono bradicardia sinusale e blocco atrioventricolare e il tasso di mortalità post-operatorio è del 10-20%.
3. Valutazione ecocardiografica della funzione RV dopo l'intervento chirurgico
NOTA: per l'ecocardiografia, utilizzare una sonda MS400D con una frequenza centrale di 30 MHz, collegata a un sistema di imaging ad ultrasuoni ad alta risoluzione (vedere Tabella dei materiali). L'esame ecocardiografico viene eseguito 4 settimane dopo l'intervento chirurgico.
- Anestetizzare il mouse con il 3% di isoflurano per inalazione.
- Posizionare il mouse in posizione supina su una piattaforma ad ultrasuoni per la fissazione degli animali e il funzionamento ad ultrasuoni. Fissare i suoi artigli all'elettrodo per ottenere una registrazione ECG attraverso un sistema collegato alla macchina ad ultrasuoni.
- Monitorare la frequenza cardiaca attraverso l'ECG e mantenerla tra 450-550 battiti / min regolando la concentrazione di anestetico tra l'1,5% e il 3%.
- Rimuovere i capelli dal petto del topo con una crema depilatoria e applicare il gel ad ultrasuoni sulla pelle del torace.
- Impostare la piattaforma in posizione orizzontale. Orientare il trasduttore parallelamente alla gamba sinistra e ottenere l'immagine dell'asse lungo ventricolare sinistro. Ruotare la sonda di 90° in senso orario per ottenere la vista LV a breve asse. Premere il pulsante Cine store per salvare le immagini.
NOTA: l'angolo superiore sinistro della piattaforma è inclinato nel punto più basso. L'angolo di rotazione LV a breve asse del trasduttore viene mantenuto mentre il trasduttore è orientato verso la spalla destra del mouse. - Spostarsi verso il basso verticalmente del trasduttore, mantenendo la sua posizione sopra l'addome superiore e sotto il diaframma del mouse in modalità B. Regola leggermente la posizione della piattaforma ruotando gli assi x e y fino a quando il camper, l'atrio destro (RA), l'atrio sinistro (LA) e il LV sono chiaramente visibili sullo schermo. Salva le immagini apicali a quattro camere premendo il pulsante Cine store o Frame store .
NOTA: la modalità B viene utilizzata per visualizzare la vista bidimensionale (2D) del cuore. - Premere la modalità M; dopo aver visualizzato la linea dell'indicatore 2x, individuare la linea dell'indicatore sull'orifizio della valvola tricuspide per ottenere il movimento del piano anulare tricuspide. Premere il pulsante Cine store o Frame store per salvare dati e immagini.
NOTA: modalità M indica la modalità di movimento, che rivela il movimento del cuore o del vaso in forma curva. - Premere il pulsante Misura per accedere alla modalità di misurazione. Fare clic sul pulsante Misurazione area per zonare in RV e LV. Calcolare l'area di RV e LV per ottenere il rapporto di area tra RV e LV.
- Fare clic sul pulsante Timeline e creare due linee di base per definire l'intervallo di movimento del piano anulare tricuspide durante i periodi sistolico e diastolico. Fare clic sul pulsante Distanza e misurare la distanza tra due linee di base per ottenere un'escursione sistolica del piano anulare tricuspide (TAPSE).
- Inclina il lato sinistro della piattaforma nel punto più basso. Mantenere la sonda con un angolo di 30° rispetto all'asse orizzontale lungo la linea ascellare anteriore destra. Ruotare gli assi x e y della piattaforma per visualizzare il camper.
- Premere il pulsante M-mode e individuare la linea dell'indicatore nel punto iperecoico del setto per ottenere l'immagine in modalità M dell'interfaccia RV. Premere il pulsante Cine Store per salvare l'immagine.
- Aprire l'immagine in modalità M dell'interfaccia RV, premere il pulsante Misura per accedere alla modalità di misurazione. Misurare la distanza interna del camper alla fine della diastole (RVIDd), della frazione di eiezione RV (RVEF) e dell'accorciamento della frazione RV (RVFS) utilizzando lo strumento di misurazione integrato del sistema ecocardiografico.
- Smettere di somministrare isoflurano e posizionare il mouse sulla piastra riscaldante per 3-5 minuti fino a quando non riprende conoscenza. Successivamente, riportare il mouse nella sua gabbia con un ciclo di luce / buio di 12 ore.
4. Misure invasive di RV emodinamica
NOTA: L'emodinamica RV viene valutata attraverso il cateterismo cardiaco destro 4 settimane dopo RVI. Viene applicato un catetere da 1,0 F insieme a un sistema di monitoraggio.
- Anestetizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di 50 mg/kg di pentobarbital di sodio (vedere Tabella dei materiali).
- Dopo aver confermato la scomparsa del riflesso di astinenza del pedale, tenere il mouse in posizione supina e immobilizzarlo con del nastro adesivo.
- Radere i peli del torace dall'angolo sternale allo xifoide. Disinfettare l'area operativa con alcool al 75%.
- Eseguire l'intubazione tracheale e impostare il parametro del ventilatore animale come descritto nei passaggi 1.5.2-1.5.3.
- Fai un'incisione bilaterale di 1 cm sulla pelle sopra il processo xifoide e trascorri il diaframma e la costola con forbici oftalmiche per esporre il cuore.
- Forare la parete libera ventricolare destra con un ago da 32 G. Rimuovere l'ago e premere la ferita con il cotone per fermare il sanguinamento.
- Inserire la punta del catetere nel ventricolo destro attraverso il sito di puntura e spingere lentamente il catetere in avanti. Regolare la posizione della punta per ottenere una tipica forma d'onda di pressione RV mostrata su un monitor e un sistema di registrazione.
NOTA: La vena giugulare destra è anche una via appropriata per la misurazione emodinamica. - Dopo 10 minuti di stabilizzazione, registrare i dati della pressione arteriosa sistolica RV (RVSBP), della pressione diastolica finale RV (RVEDP) e RV dP / dt. Fare clic sul pulsante Seleziona per selezionare i cicli cardiaci per il calcolo e quindi fare clic sul pulsante Analizza per calcolare i valori medi dei cicli selezionati.
- Rimuovere il catetere dopo il completamento della registrazione e quindi posizionarlo all'interno della normale soluzione salina.
- Eutanasizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di sovradosaggio di pentobarbital sodico (150 mg/kg) e poi sacrificarlo per lussazione cervicale.
- Raccogliere il cuore e la tibia per l'analisi istologica.
5. Cast vascolare coronarico utilizzando un agente di colata vascolare
- Eparinoilizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di 200 UI/mL di eparina sodica a 2000 UI/kg (vedere Tabella dei materiali).
- Anestetizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di 50 mg/kg di pentobarbital di sodio.
- Posizionare l'animale supino sul tampone e intubare per la ventilazione artificiale seguendo i passaggi 1.5.2-1.5.3.
- Aprire il torace con le forbici chirurgiche come descritto nel passaggio 4.5 ed esporre il cuore.
- Fai una tacca di 3 mm con forbici oftalmiche sugli atri destro e perfondi il cuore con 5 ml di soluzione salina normale attraverso l'apice cardiaco con un iniettore.
- Bloccare il sangue dall'aorta con un morsetto aortico e perfondere 0,1 ml di nitroglicerina (1 mg / mL) attraverso l'apice cardiaco con un iniettore per dilatare l'arteria coronaria.
- Preparare il reagente fuso mescolando gli ingredienti nel kit secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: Si raccomanda di preparare contemporaneamente il reagente fuso e la perfusione con soluzione salina e nitroglicerina normali per prevenire la chiusura microvascolare. - Perfondere il cuore con 1 mL di reagente fuso attraverso l'apice cardiaco e attendere 2-3 ore.
- Erodere il cuore con idrossido di sodio al 50% per 2-3 giorni e rimuovere il tessuto muscolare o il tessuto connettivo risciacquando con soluzione salina normale.
- Scatta foto sotto una fotocamera.
ATTENZIONE: Il reagente cast è dannoso per gli occhi, la pelle e le vie respiratorie. L'idrossido di sodio è corrosivo. È necessario indossare guanti protettivi, occhiali e un cappotto da laboratorio. Il reagente fuso deve essere preparato in una cappa aspirante.
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Representative Results
In questo studio, i topi sono stati assegnati in modo casuale al gruppo RVI (n = 11) o all'operazione fittizia (n = 11). Il cast coronarico in 2 cuori di topo normali è mostrato nella Figura 1A. In risposta alla legatura RCA, l'elevazione del segmento ST è stata osservata nel piombo III dell'ECG (Figura 1B). Inoltre, la colorazione del cloruro di tetrazolio 2,3,5-trifenil tetrazolio (TTC) ha mostrato che l'area dell'infarto rappresenta il 45% della parete libera da RV a 24 ore dopo l'intervento (Figura 1C,D). I dati di cui sopra indicavano la generazione riuscita del modello di mouse RVI.
Le registrazioni della vista apice a 4 camere (Figura 2A) e della vista a 2 camere ad asse corto BT e le corrispondenti misurazioni dell'ecocardiografia in modalità M (Figura 2B) sono state eseguite a 4 settimane dopo l'intervento chirurgico per valutare il rimodellamento e la funzione del camper. Rispetto a quella del gruppo sham, la dimensione interna del RV alla fine della diastole (RVIDd) è aumentata nel gruppo RVI (Figura 2C), ed è stata più di 2 volte nel gruppo sham (Figura 2A). La frazione di eiezione RV (RVEF), l'accorciamento della frazione RV (RVFS) e l'escursione sistolica del piano anulare tricuspide (TAPSE) erano significativamente più piccole nel gruppo RVI rispetto al gruppo sham (Figura 2D-F). Il rapporto area RV/BT è aumentato di circa il 50% rispetto al gruppo sham (Figura 2G).
I topi sono stati sottoposti a misurazione emodinamica RV 4 settimane dopo l'intervento chirurgico. Nel gruppo RVI, la contrattilità RVSBP, dp/dt max, dp/dt min e RV era significativamente più piccola. Allo stesso tempo, l'indice RVEDP e τ (tau) erano considerevolmente più significativi di quelli del gruppo sham (Figura 3A-E).
Quattro settimane dopo l'intervento, i topi sono stati sacrificati. Un aneurisma RV era visibile nell'area infartuata (Figura 4A). Il rapporto peso cardiaco/peso corporeo (HW/BW) e il rapporto peso cardiaco/lunghezza tibiale (HW/TL) nel gruppo RVI erano leggermente più grandi (senza significatività statistica) rispetto a quelli del gruppo sham (Figura 4B,C). La colorazione di Masson22 ha indicato una fibrosi significativa nella parete priva di RV e raramente la fibrosi si è verificata nel setto nel gruppo RVI (Figura 4D, E). Al contrario, alcuni cardiomiociti sopravvissuti erano nell'area dell'infarto (Figura 4F).
Figura 1: Cambiamenti dell'elettrocardiografia (ECG) e dimensioni dell'infarto dopo la legatura dell'arteria coronaria destra (RCA). (A) Immagini rappresentative del cast vascolare coronarico del topo. Barra della scala = 4 mm. (B) Variazione dell'ECG di piombo III in risposta alla legatura RCA. (C) Immagini rappresentative della colorazione di cloruro di tetrazolio 2,3,5-trifenil tetrazolio (TTC) (il bianco indica l'area dell'infarto, il rosso indica il tessuto vitale). Barra della scala = 4 mm. (D) Quantificazione della dimensione dell'infarto miocardico dei topi RVI. I dati sono presentati come ± medi SEM, *P < 0,01 vs. gruppo sham, n = 6 per gruppo (due t-test di campionamento indipendenti). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Valutazione ecocardiografica del rimodellamento e della funzione del ventricolo destro (RV) in topi sottoposti a legatura RCA. (A) Immagini rappresentative in modalità B in vista a quattro camere 4 settimane dopo la legatura RCA; barra della scala = 2 mm. (B) Immagini tipiche del B-Mode all'interfaccia del ventricolo destro (superiore) e del corrispondente M-Mode (inferiore) che mostrano sia LV che RV a 4 settimane dopo la legatura RCA; barra della scala = 2 mm. (C) Dimensione interna del camper all'estremità della diastole (RVIDd). (D) Accorciamento della frazione RV (RVFS). (E) Frazione di eiezione RV (RVEF). (F) Escursione sistolica del piano anulare tricuspide (TAPSE). (G) Rapporto area RV/BT. I dati sono presentati come ± SEM. *P < 0,01 vs. gruppo sham, n = 6 per gruppo (due t-test di campionamento indipendenti). LV, ventricolo sinistro; RVI, infarto ventricolare destro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Emodinamica ventricolare destra (RV) a 4 settimane dopo la legatura dell'arteria coronaria destra. (A) Curve di pressione rappresentative sono state ottenute con un catetere di pressione. (B) Pressione arterilica sistolica ventricolare destra (RVSBP) e pressione diastolica terminale ventricolare destra (RVEDP). (C) La velocità di aumento massima e minima della pressione RV (dp/dt max, dp/dt min). (D) Contrattilità del camper. (E) La costante di tempo esponenziale del rilassamento RV (τ). *P < 0,01 vs. gruppo sham, n = 6 per gruppo (due t-test di campionamento indipendenti). I dati sono presentati come ± SEM. RVI, infarto ventricolare destro; RVP, pressione ventricolare destra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Risultati istologici a 4 settimane dopo RVI. (A) Immagini di tutto il cuore rappresentativo del gruppo sham e RVI (cerchio rosso indica parete infartuale; barra della scala = 3 mm). (B) Rapporto peso cardiaco/peso corporeo (HW/BW), P = 0,0536 tra RVI e gruppo fittizio. (C) Rapporto lunghezza HW/tibia (HW/TL), P = 0,1682 tra RVI e gruppo sham. (D) Rappresentano immagini di colorazione ematossilina-eosina e colorazione masson di sezioni cardiache (barra della scala = 3 mm). (E) Risultati quantitativi della fibrosi miocardica. (F) Immagini rappresentative di colorazione di Masson che mostrano cardiomiociti di sopravvivenza nell'area dell'infarto (l'immagine a destra (barra della scala = 100 μm) è un ingrandimento del tessuto nella casella di sinistra (barra della scala = 1 mm). *P < 0,01 vs gruppo sham, n = 6 per gruppo (due t-test di campionamento indipendenti). I dati sono presentati come ± SEM. RVI, infarto ventricolare destro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Sicard e colleghi francesi hanno riportato per la prima volta un modello murino di RVI nel 2019, che descriveva il processo chirurgico e si concentrava sull'interazione tra LV e RV dopo RVI9. Tuttavia, ad oggi, nessuno studio ha riportato l'utilizzo di questo modello per ulteriori studi. Una procedura più dettagliata sarebbe utile per i ricercatori per utilizzare il modello murino di RVI per l'indagine. In contrasto con il rapporto di Sicard et al.9, abbiamo fornito informazioni dettagliate per la generazione del modello e la strategia per il controllo della qualità e valutato ulteriormente la distribuzione anatomica di RCA, emodinamica RV e la sopravvivenza dei cardiomiociti nell'area dell'infarto. Un recente rapporto ha dimostrato che i cardiomiociti nell'area dell'infarto svolgono un ruolo essenziale nella rigenerazione miocardica23. La funzione RV nei pazienti con RVI si riprenderebbe spontaneamente entro 3-12 mesi, anche senza riperfusione16,24. Questi risultati suggeriscono che il modello RVI murino aiuterebbe a cercare potenziali bersagli terapeutici per l'insufficienza cardiaca destra o la rigenerazione cardiaca. Pertanto, è necessario divulgare il modello.
A causa dell'invisibilità della RCA e della variazione della distribuzione RCA, sarebbe difficile per gli operatori junior generare modelli RVI con dimensioni stabili dell'infarto. Per superare questa limitazione, si raccomanda di controllare il livello e l'intervallo di legatura e di garantire un'elevazione sufficiente del segmento ST nel II o III piombo dell'ECG. Il passo più critico per generare con successo un modello RVI murino è individuare la struttura anatomica di RCA. Come mostrato nella Figura 1A, l'RCA del topo può contenere una o più arterie parallele primarie; quindi, la dimensione dell'infarto dipende da quante arterie sono bloccate. Pertanto, intraoperatoriamente, la posizione dell'RCA può essere confermata in base alle caratteristiche anatomiche del vicino atrio destro e della vena visibile. I topi RVI di solito mostrano infarto miocardico nella parete libera di RV. Tuttavia, il setto può anche essere raramente coinvolto se l'arteria del setto proviene dalla RCA, come mostrato nella Figura 4D. Il setto può essere irrigato nei topi dal proprio ramo coronarico settale25 o da un ramo di RCA o LCA 26,27. Dopo aver legato l'RCA, il classico cambiamento ECG dell'elevazione del segmento ST nei lead EEG II o III è il gold standard per giudicare il successo di RVI.
Poiché la dilatazione RV indotta dalla legatura RCA aumenterebbe la pressione intrapericardica e quindi frenerebbe il riempimento cardiaco, che comporterebbe l'aggravamento del disturbo emodinamico 9,10, il pericardio deve essere strappato durante l'operazione. In contrasto con l'alta incidenza di rottura cardiaca nei topi con legatura LCA, non è stata osservata alcuna rottura cardiaca nei topi RVI. Tuttavia, la mortalità chirurgica dovuta a sanguinamento e blocco atrioventricolare potrebbe arrivare fino al 50% per i principianti, che può essere evitata diminuendo la profondità di piercing del punto dell'ago e la gamma miocardica di legatura della sutura, abbassando la posizione di legatura e la manipolazione delicata. I tecnici esperti del nostro laboratorio possono completare la generazione di un modello murino RVI in circa 30 minuti con un tasso di successo dell'80% -90% calcolato dalla percentuale di sopravvivenza dei topi con dimensioni significative dell'infarto. Il successo dell'operazione è stato giudicato dall'elevazione istantanea del segmento ST in Lead II o III di ECG dopo legatura RCA, colorazione negativa TTC del miocardio nel 1° 24 h dopo l'intervento chirurgico e dilatazione RV misurata mediante ecocardiografia a 3 giorni o 1 settimana dopo l'intervento chirurgico. L'elevazione ST nei cavi ECG della parete inferiore e la dilatazione ecocardiografica del camper a 3 giorni dopo l'intervento chirurgico possono essere utilizzati come criteri di inclusione per gli studi che utilizzano il modello RVI murino.
Durante il periodo di follow-up di 4 settimane, sono stati osservati alcuni cardiomiociti sopravvissuti nell'area infartuale dei topi RVI, che può essere una base ragionevole per la ricerca rigenerativa. Il rimodellamento del camper e il recupero della disfunzione a 4 settimane non sono stati notati dopo RVI in questo modello, suggerendo che questo modello è anche fattibile per la ricerca di base sul rimodellamento e il fallimento del cuore destro.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (82073851 to Sun) e della National China Postdoctoral Science Foundation (2021M690074 a Lin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride | Sigma | T8877 | For TTC staining |
| Animal Mini Ventilator | Havard | Type 845 | For artificial ventilation |
| Animal ultrasound system VEVO2100 | Visual Sonic | VEVO2100 | Measurement for Doppler flow velocity and AS plaque |
| Batson’s #17 Anatomical Corrosion Kit | Polyscience Inc | 7349 | For vasculature casting |
| buprenorphine | Isoreag | 1134630-70-8 | For reduce the pain of mice after surgery |
| C57BL/6J mice + D29A1A2:D27 | Animal Center of South Medical University | - | For the generation of mouse RVI model |
| Camera | Sangnond | For taking photograph | |
| Cold light illuminator | Olympus | ILD-2 | Light for operation |
| electrocardiograph | ADI Instrument | ADAS1000 | For recording electrocardiogram |
| hair removal cream | Reckitt Benchiser | RQ/B 33 Type 2 | Remove mouse hair |
| Heat pad- thermostatic surgical system (ALC-HTP-S1) | SHANGHAI ALCOTT BIOTECH CO | ALC-HTP-S1 | Heating |
| Hematoxylin-eosin dye | Leagene | DH0003 | Hematoxylin-eosin staining |
| Heparin sodium salt | Macklin | H837056 | For heparization |
| Isoflurane | RWD life science | R510-22 | Inhalant anaesthesia |
| Lab made spatula | Work as a laryngoscope | ||
| Lab made tracheal cannula | For intubation | ||
| Matrx VIP 3000 Isofurane Vaporizer | Midmark Corporation | VIP 3000 | Anesthetization |
| Medical nylon suture (5-0) | Ningbo Medical Needle Co. | 5-0 | For chest close |
| Microsurgical elbow tweezers | RWD life science | F11021-11 | For surgery |
| Microsurgical scissors | NAPOX | MB-54-1 | For arteriotomy |
| Millar Catheter | AD Instruments, Shanghai | 1.0F | Measurement of pressure gradient |
| MS400D ultrasonic probe | Visual Sonic | MS400D | Measurement for Doppler flow velocity and AS plaque |
| needle forceps | Visual Sonic | F31006-12 | For surgery |
| nitroglycerin | BEIJING YIMIN MEDICINE Co | For dilating coronary artery | |
| Ophthalmic scissors | RWD life science | S11022-14 | For surgery |
| Pentobarbital sodium salt | Merck | 25MG | Anesthetization |
| PowerLab Multi-Directional Physiological Recording System | AD Instruments, Shanghai | 4/35 | Pressure recording |
| Precision electronic balance | Denver Instrument | TB-114 | Weighing scale |
| Silk suture (8-0) | Ningbo Medical Needle Co. | 6-0 | coronary artery ligation |
| Small animal microsurgery equipment | Napox | MA-65 | Surgical instruments |
| tissue forceps | Visual Sonic | F-12007-10 | For surgery |
| tissue scissor | Visual Sonic | S13052-12 | Open chest for hemodynamic measurement |
| Transmission Gel | Guang Gong pai | 250ML | preparation for Echocardiography measurement |
| Vascular Clamps | Visual Sonic | R31005-06 | For blocking blood from aorta |
References
- Rallidis, L. S., Makavos, G., Nihoyannopoulos, P. Right ventricular involvement in coronary artery disease: role of echocardiography for diagnosis and prognosis. Journal of the American Society of Echocardiography: Official Publication of the American Society of Echocardiography. 27 (3), 223-229 (2014).
- Frangogiannis, N. G. Fibroblasts and the extracellular matrix in right ventricular disease. Cardiovascular Research. 113 (12), 1453-1464 (2017).
- Ondrus, T., et al. Right ventricular myocardial infarction: From pathophysiology to prognosis. Experimental & Clinical Cardiology. 18 (1), 27-30 (2013).
- Badagliacca, R., et al. Right ventricular concentric hypertrophy and clinical worsening in idiopathic pulmonary arterial hypertension. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (11), 1321-1329 (2016).
- Verhaert, D., et al. Right ventricular response to intensive medical therapy in advanced decompensated heart failure. Circulation: Heart Failure. 3 (3), 340-346 (2010).
- Chen, K., et al. RNA interactions in right ventricular dysfunction induced type II cardiorenal syndrome. Aging (Albany NY). 13 (3), 4215-4241 (2021).
- Wang, Q., et al. Induction of right ventricular failure by pulmonary artery constriction and evaluation of right ventricular function in mice. Journal of Visualized Experiments. (147), e59431 (2019).
- Harjola, V. P., et al. Contemporary management of acute right ventricular failure: A statement from the heart failure association and the working group on pulmonary circulation and right ventricular function of the European society of cardiology. European Journal of Heart Failure. 18 (3), 226-241 (2016).
- Sicard, P., et al. Right coronary artery ligation in mice: a novel method to investigate right ventricular dysfunction and biventricular interaction. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 316 (3), 684-692 (2019).
- Goldstein, J. A. Pathophysiology and management of right heart ischemia. Journal of the American College of Cardiology. 40 (5), 841-853 (2002).
- Stiermaier, T., et al. Frequency and prognostic impact of right ventricular involvement in acute myocardial infarction. Heart. 0, 1-8 (2020).
- Zehender, M., et al. Right ventricular infarction as an independent predictor of prognosis after acute inferior myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 328 (14), 981-988 (1993).
- Brodie, B. R., et al. Comparison of late survival in patients with cardiogenic shock due to right ventricular infarction versus left ventricular pump failure following primary percutaneous coronary intervention for ST-elevation acute myocardial infarction. The American Journal of Cardiology. 99 (4), 431-435 (2007).
- Konstam, M. A., et al. Evaluation and management of right-sided heart failure: A scientific statement from the american heart association. Circulation. 137 (20), 578-622 (2018).
- Leferovich, J. M., et al. Heart regeneration in adult MRL mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9830-9835 (2001).
- Dell'Italia, L. J., et al. Hemodynamically important right ventricular infarction: Follow-up evaluation of right ventricular systolic function at rest and during exercise with radionuclide ventriculography and respiratory gas exchange. Circulation. 75 (5), 996-1003 (1987).
- Friedberg, M. K., Redington, A. N. Right versus left ventricular failure: differences, similarities, and interactions. Circulation. 129 (9), 1033-1044 (2014).
- Haraldsen, P., Lindstedt, S., Metzsch, C., Algotsson, L., Ingemansson, R. A porcine model for acute ischaemic right ventricular dysfunction. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 18 (1), 43-48 (2014).
- Ren, L., Colafella, K. M. M., Bovée, D. M., Uijl, E., Danser, A. H. J. Targeting angiotensinogen with RNA-based therapeutics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 29 (2), 180-189 (2020).
- Hacker, T. A. Animal models and cardiac extracellular matrix research. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1098, 45-58 (2018).
- Chien, T. M., et al. Double right coronary artery and its clinical implications. Cardiology in the Young. 24 (1), 5-12 (2014).
- Zhu, Y., et al. Characterizing a long-term chronic heart failure model by transcriptomic alterations and monitoring of cardiac remodeling. Aging (Albany NY). 13 (10), 13585-13614 (2021).
- Cui, M., et al. Nrf1 promotes heart regeneration and repair by regulating proteostasis and redox balance. Nature Communications. 12 (1), 5270 (2021).
- Meyer, P., et al. Effects of right ventricular ejection fraction on outcomes in chronic systolic heart failure. Circulation. 121 (2), 252-258 (2010).
- Dunmore-Buyze, P. J., et al. Three-dimensional imaging of the mouse heart and vasculature using micro-CT and whole-body perfusion of iodine or phosphotungstic acid. Contrast Media & Molecular Imaging. 9 (5), 383-390 (2014).
- Fernández, B., et al. The coronary arteries of the C57BL/6 mouse strains: Implications for comparison with mutant models. Journal of Anatomy. 212 (1), 12-18 (2008).
- Zhang, H., Faber, J. E. De-novo collateral formation following acute myocardial infarction: Dependence on CCR2+ bone marrow cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 87, 4-16 (2015).
