Summary
Questo studio fornisce una procedura sistematicamente ottimizzata di costruzione basata sulla ribonucleasi CRISPR / Cas9 di mutanti di locuste omozigoti, nonché un metodo dettagliato per la crioconservazione e la rianimazione delle uova di locuste.
Abstract
La locusta migratrice, Locusta migratoria, non è solo una delle locuste della peste in tutto il mondo che ha causato enormi perdite economiche agli esseri umani, ma anche un importante modello di ricerca per la metamorfosi degli insetti. Il sistema CRISPR / Cas9 può localizzare con precisione un locus specifico del DNA e fendere all'interno del sito bersaglio, introducendo in modo efficiente rotture a doppio filamento per indurre il knockout del gene bersaglio o integrare nuovi frammenti di geni nel locus specifico. L'editing del genoma mediato da CRISPR / Cas9 è un potente strumento per affrontare le domande incontrate nella ricerca sulle locuste e una tecnologia promettente per il controllo delle locuste. Questo studio fornisce un protocollo sistematico per il knockout genico mediato da CRISPR / Cas9 con il complesso della proteina Cas9 e RNA guida singola (sgRNA) nelle locuste migratorie. La selezione dei siti target e la progettazione degli sgRNA sono descritte in dettaglio, seguite dalla sintesi in vitro e dalla verifica degli sgRNA. Le procedure successive includono la raccolta della zattera delle uova e la separazione delle uova conciate per ottenere una microiniezione di successo con basso tasso di mortalità, coltura delle uova, stima preliminare del tasso di mutazione, allevamento delle locuste, nonché rilevamento, conservazione e passaggio dei mutanti per garantire la stabilità della popolazione delle locuste modificate. Questo metodo può essere utilizzato come riferimento per applicazioni di editing genetico basate su CRISPR / Cas9 nelle locuste migratorie e in altri insetti.
Introduction
Le tecnologie di modifica genetica potrebbero essere utilizzate per introdurre inserzioni o delezioni in uno specifico locus del genoma per modificare artificialmente il gene bersaglio sullo scopo1. Negli ultimi anni, la tecnologia CRISPR / Cas9 si è sviluppata rapidamente e ha un crescente ambito di applicazioni in vari campi delle scienze della vita 2,3,4,5,6. Il sistema CRISPR / Cas9 è stato scoperto nel 19877 e ampiamente trovato in batteri e archei. Ulteriori ricerche hanno indicato che si trattava di un sistema immunitario adattativo procariotico che dipende dalla nucleasi guidata dall'RNA Cas9 per combattere i fagi8. Il sistema CRISPR/Cas9 modificato artificialmente consiste principalmente di due componenti, un singolo RNA guida (sgRNA) e la proteina Cas9. Lo sgRNA è costituito da un RNA CRISPR (crRNA) complementare alla sequenza bersaglio e da un crRNA transattivante ausiliario (tracrRNA), che è relativamente conservato. Quando il sistema CRISPR/Cas9 viene attivato, l'sgRNA forma una ribonucleoproteina (RNP) con la proteina Cas9 e guida Cas9 al suo sito bersaglio attraverso l'accoppiamento di basi delle interazioni RNA-DNA. Quindi, il DNA a doppio filamento può essere scisso dalla proteina Cas9 e, di conseguenza, la rottura del doppio filamento (DSB) emerge vicino al motivo adiacente del protospaziatore (PAM) del sito bersaglio 9,10,11,12. Per mitigare il danno causato dalle DSB, le cellule attiverebbero risposte complete al danno del DNA per rilevare in modo efficiente i danni genomici e avviare la procedura di riparazione. Ci sono due distinti meccanismi di riparazione nella cellula: non-homologous end joining (NHEJ) e homology-directed repair (HDR). NHEJ è la via di riparazione più comune che può riparare rapidamente le rotture del doppio filamento del DNA e prevenire l'apoptosi cellulare. Tuttavia, è soggetto a errori a causa del fatto che lascia piccoli frammenti di inserzioni e delezioni (indel) vicino ai DSB, che di solito si traduce in uno spostamento del frame di lettura aperto e quindi può portare al knock-out genico. Al contrario, la riparazione omologa è un evento piuttosto raro. A condizione che ci sia un modello di riparazione con sequenze omologhe al contesto del DSB, le cellule occasionalmente riparano la rottura genomica secondo il modello vicino. Il risultato dell'HDR è che il DSB viene riparato con precisione. In particolare, se c'è una sequenza aggiuntiva tra le sequenze omologhe nel modello, verrebbero integrate nel genoma tramite HDR, e in questo modo, le inserzioni geniche specifiche potrebbero essere realizzate13.
Con l'ottimizzazione e lo sviluppo delle strutture sgRNA e delle varianti proteiche Cas9, il sistema di editing genetico basato su CRISPR / Cas9 è stato applicato con successo anche nella ricerca di insetti, inclusi ma non limitati a Drosophila melanogaster, Aedes aegypti, Bombyx mori, Helicoverpa Armigera, Plutella xylostella e Locusta migratoria 14,15,16,17,18 ,19. Per quanto a conoscenza degli autori, sebbene RNP costituiti dalla proteina Cas9 e sgRNA trascritti in vitro siano stati utilizzati per l'editing del genoma delle locuste20,21,22, manca ancora un protocollo sistematico e dettagliato per la costruzione mediata dalla ribonucleasi CRISPR / Cas9 di mutanti omozigoti della locusta migratoria.
La locusta migratrice è un importante parassita agricolo che ha una distribuzione globale e pone minacce sostanziali alla produzione alimentare, essendo particolarmente dannoso per le piante graminose, come grano, mais, riso e miglio23. L'analisi della funzione genica basata su tecnologie di modifica del genoma può fornire nuovi obiettivi e nuove strategie per il controllo delle locuste migratorie. Questo studio propone un metodo dettagliato per eliminare i geni delle locuste migratorie attraverso il sistema CRISPR / Cas9, compresa la selezione dei siti bersaglio e la progettazione di sgRNA, la sintesi in vitro e la verifica degli sgRNA, la microiniezione e la coltura di uova, la stima del tasso di mutazione allo stadio embrionale, l'individuazione dei mutanti e il passaggio e la conservazione dei mutanti. Questo protocollo potrebbe essere usato come riferimento basale per la manipolazione della stragrande maggioranza dei geni delle locuste e può fornire preziosi riferimenti per l'editing del genoma di altri insetti.
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Protocol
1. Selezione del sito target e progettazione degli sgRNA
- Raccogliere quante più informazioni possibili sulla sequenza per il gene di interesse attraverso la ricerca della letteratura e / o la ricerca dell'mRNA o della sequenza di DNA codificante (CDS) del gene presso NCBI e database di locuste24.
- Confrontare la sequenza del gene interessato con la sua sequenza di DNA genomico per distinguere le regioni dell'esone e dell'introne.
- Selezionare una regione candidata per la progettazione del sito di destinazione in base allo scopo della ricerca. Progettare coppie di primer per amplificare il frammento della regione candidata e verificare la sua sequenza wild-type mediante l'analisi sequenziale del prodotto PCR.
NOTA: Esistono diverse strategie per la selezione della regione target candidata. Ad esempio, nella maggior parte delle ricerche sulla funzione genica / proteina, utilizzare il frammento di esone vicino al suo codone iniziale come regione candidata per garantire che l'intera funzione proteina / RNA venga persa dopo l'editing del genoma (cioè il knock-out del gene). Mentre per l'analisi delle funzioni di un dominio specifico, selezionare la regione candidata all'inizio (o entrambe le estremità) del dominio. - Utilizza risorse online come E-CRISP Design25 per cercare potenziali siti target nella regione di destinazione candidata.
- Seleziona "Drosophila melanogaster BDGP6" (o qualsiasi altro insetto) nell'elenco a discesa dei genomi di riferimento e scegli "Input is FASTA sequence" seguito incollando la sequenza della regione target nella casella di testo (in formato FASTA).
- Avviare l'applicazione premendo "Start sgRNA search" con "medium" e "single design" per ottenere i possibili siti target. Selezionare 1-3 potenziali bersagli dai risultati in base ai loro punteggi previsti e progettare gli sgRNA corrispondenti di conseguenza.
NOTA: Ci sono molte altre piattaforme online per la progettazione CRISPR, come CRISPOR, CHOPCHOP, CRISPRdirect, ZiFiT e così via (vedi Tabella dei materiali). Alcuni di essi hanno la funzione di controllo della specificità per le specie i cui dati di sequenza genomica sono nei loro database. Tuttavia, la sequenza genomica delle locuste non è stata trovata su nessun sito web online. È meglio usare più di uno strumento online per il design CRISPR nelle locuste. In modo completo, considerare i risultati di diversi siti Web e selezionare l'sgRNA dai risultati in base al principio della massima specificità, massima efficienza e minor tasso di mancata corrispondenza (Figura 1A, B).
2. Sintesi e verifica dello sgRNA in vitro
- Sintetizzare l'sgRNA utilizzando kit di sintesi di sgRNA secondo il manuale del produttore (Table of Materials). Questa procedura di solito include tre fasi: amplificazione del modello di DNA, trascrizione in vitro e purificazione dell'sgRNA21. Diluire lo sgRNA sintetizzato con acqua priva di nucleasi a una concentrazione di stoccaggio di 300 ng/μL per un ulteriore utilizzo.
- Amplificare e purificare il frammento di gene bersaglio per fungere da substrato del test di scissione in vitro del sistema CRISPR / Cas9. Eseguire questi passaggi seguendo le istruzioni del produttore.
- Diluire la proteina Cas9 acquistata a 300 ng/μL con acqua priva di nucleasi. Incubare 1 μL di sgRNA (300 ng/μL) e 1 μL di proteina Cas9 (300 ng/μL) con 200 ng di frammento bersaglio purificato nel tampone di scissione a 37 °C per 1 ora (10 μL del volume totale; vedere Tabella 1). Stimare l'efficienza della scissione Cas9 indotta da sgRNA mediante elettroforesi su gel di agarosio (Figura 1C). Selezionare gli sgRNA ad alta attività per la successiva microiniezione.
NOTA: I risultati dell'elettroforesi su gel di agarosio possono essere convertiti in immagini in scala di grigi con software di elaborazione delle immagini e l'efficienza di scissione è stimata in base alla scala di grigi delle bande di dimensioni ipotizzate.
3. Microiniezione e coltura delle uova
- Preparare gli aghi per iniezione tirando capillari di vetro con un estrattore di micropipette (Tabella dei materiali). Impostate i parametri come segue: Calore su 588, Tira su 90, Velocità su 60 e Tempo su 40. Macinare la punta dell'ago per iniezione con una micro smerigliatrice (Tabella dei materiali).
NOTA: Le punte ideali degli aghi sono aperte e affilate (Figura 2A). Si raccomanda vivamente di preparare aghi aggiuntivi per gli esperimenti perché a volte gli aghi sono bloccati o accidentalmente rotti durante le iniezioni. - Mescolare 1 μL di proteina Cas9 (300 ng/μL) con 1 μL di sgRNA verificato (300 ng/μL) insieme per ottenere gli RNP per iniezione. Aggiungere 8 μL di acqua sterile priva di RNasi per portare il volume finale della miscela a 10 μL. Mescolare accuratamente la soluzione e tenerla in ghiaccio.
NOTA: Le concentrazioni finali della proteina Cas9 e degli sgRNA possono essere ottimizzate in base ai risultati dell'editing. Evitare il congelamento e lo scongelamento ripetuti della soluzione di RNP preparata e si raccomanda l'uso immediato. - Allevare insieme le locuste adulte maschio e femmina a 30 °C con un fotoperiodo di 16 (chiaro):8 (scuro) e fornire loro sufficienti piantine di grano fresco come cibo. Osserva queste locuste ogni giorno e metti un vaso di ovodeposizione (un vaso di plastica o una tazza piena di sabbia sterile bagnata) nella gabbia di allevamento per la deposizione delle uova una volta che le locuste si sono accoppiate.
NOTA: Di solito, 100 coppie di locuste adulte allevate in una gabbia di allevamento (40 cm x 40 cm x 40 cm) sono sufficienti per generare uova per eliminare un singolo gene. Colture ulteriori coppie di locuste se sono necessarie più uova. - Raccogliere i baccelli appena deposti dalla pentola di deposizione delle uova e attendere circa 30 minuti per la concia delle uova. Isolare delicatamente le uova dai baccelli in acqua usando un pennello fine e lavarle con acqua sterile tre volte. Conservare le uova in una capsula di Petri e aggiungere acqua sterile per mantenerle umide.
NOTA: La concia delle uova appena deposte può migliorare significativamente l'efficienza mutante21. - Riempire un ago per iniezione con la soluzione di RNP preparata e caricarlo sul micromanipolatore (Tabella dei materiali).
- Impostare i parametri di microiniezione come segue: 300 hPa della pressione di iniezione (pi), 0,5 s del tempo di iniezione (ti) e 25 hPa della pressione di compensazione (pc).
- Premere il pedale per valutare il volume della soluzione iniettata. Regolare la pressione di iniezione e il tempo di iniezione per assicurarsi che il volume di iniezione sia di circa 50-100 nL.
NOTA: Scaricare l'aria residua nell'ago per rendere la soluzione di iniezione continua e controllabile il più possibile. La connessione dell'ago e del micromanipolatore deve essere stretta.
- Disporre regolarmente le uova sterili sul tampone di iniezione (Figura 2B,C) e posizionare il tampone sul tavolo degli oggetti del microscopio (Figura 3A). Regolare l'ingrandimento del microscopio fino a quando non si osservano le uova. Regolare l'ago per microiniezione al microscopio fino a quando non è visibile la punta dell'iniezione e posizionarlo vicino all'uovo da iniettare.
- Iniziare l'iniezione ad un'altezza adeguata e con un angolo di 30-45 gradi. Inserire la punta nell'uovo con attenzione vicino ai micropili dell'uovo (Figura 3B) e premere il pedale per effettuare l'iniezione. Ritrarre rapidamente l'ago e spostare il tampone di iniezione per l'iniezione dell'uovo successivo.
NOTA: Deve essere osservata una leggera espansione dell'uovo durante la microiniezione. Una piccola quantità di perdita citoplasmatica al foro stenopeico è accettabile. Sostituire l'ago per iniezione con uno nuovo o regolare l'angolo di iniezione se il deflusso del fluido è eccessivo. - Trasferire le uova iniettate in un piatto di coltura (una capsula di Petri con un pezzo di carta da filtro umida) e metterle in un'incubatrice a 30 °C.
NOTA: Ci vorranno circa 13-14 giorni prima che le ninfe si schiudano da queste uova iniettate (a condizione che la mutazione del gene bersaglio non influenzi lo sviluppo degli embrioni) (Figura 3C). Iniettare almeno 100 uova per garantire una quantità sufficiente di schiusa ed eclosione per eliminare un gene specifico.
4. Stima del tasso di mutazione e screening dei mutanti
- Controllare lo sviluppo delle uova iniettate ogni giorno dopo l'iniezione. Trasferire le uova iniettate in un nuovo piatto di coltura ogni 24 ore nei primi 5 giorni.
- Il 6° giorno (o più tardi) dopo l'iniezione, prelevare e trasferire a caso 10 uova in un tubo e macinare adeguatamente le uova con due sfere di acciaio a 60 Hz per 6 minuti usando un macinino (vedi Tabella dei materiali). Risospendere i detriti con 1 mL di PBS. Trasferire 5 μL della miscela in 45 μL di 50 mM NaOH e lisare a 95 °C per 5 minuti. Aggiungere 5 μL di 1 M Tris-HCl (pH=8,0) nel sistema di lisi per terminare la reazione di lisi alcalina.
NOTA: Le uova possono essere selezionate per la lisi alcalina in qualsiasi giorno dopo l'ultimo trasferimento e più uova possono essere utilizzate come un campione a seconda della loro situazione di sviluppo (ad esempio, cinque embrioni di 6 giorni possono essere utilizzati come un campione e due embrioni di 10 giorni possono essere utilizzati come un campione). A volte, non è possibile ottenere il DNA genomico delle uova usando il metodo di lisi alcalina. I kit di estrazione del DNA genomico commerciale possono essere utilizzati come metodo alternativo per isolare il DNA genomico dalle uova. - Prendere 1 μL del prodotto di lisi come modello PCR per amplificare il frammento del gene bersaglio (Tabella 2 e Tabella 3) e inviare i prodotti PCR per il sequenziamento. Confrontare i risultati del sequenziamento con la sequenza wild-type per valutare preliminarmente se il sistema CRISPR / Cas9 ha scisso il gene bersaglio in vivo (Figura 4A). Consentire il resto delle uova per lo sviluppo successivo a condizione che gli indels vengano rilevati nella fase embrionale.
NOTA: In questo modo, il tasso di mutazione può essere preventivamente stimato allo stadio embrionale. Se non si trovano indels in questa fase, preparare alcuni nuovi sgRNA per il gene bersaglio e ripetere il protocollo knock-out dal punto 2.1. - Trasferire le ninfe tratteggiate in una gabbia di allevamento e coltivarle come descritto al punto 3.3. Quando le ninfe si sono sviluppate fino al quinto stadio instar, separarle con bicchieri di coltura di plastica (1 ninfa / tazza).
NOTA: Di solito ci vogliono circa 25-35 giorni perché le ninfe si sviluppino fino al loro quinto stadio e il fenotipo più evidente è che le gemme alari si estendono fino al quarto o quinto segmento addominale. Inoltre, si raccomanda di registrare i fenotipi delle ninfe morte per prevedere la relazione tra il gene bersaglio e i fenotipi in ulteriori ricerche. - Tagliare circa 2 mm di lunghezza delle antenne con le forbici da dissezione e lisarlo con il metodo della lisi alcalina (fase 4.2). Analizzare la sequenza di frammenti di gene bersaglio di queste ninfe come descritto sopra (passo 4.3) per identificare i mutanti G0 (Figura 4B).
NOTA: Le antenne tagliate per la lisi possono essere un po 'più lunghe e macinare o tritare le antenne è utile per la lisi anche se le antenne possono essere direttamente digerite. Gli individui con picchi multipli vicino al sito bersaglio nel risultato del sequenziamento vengono identificati come mutanti positivi e consentiti per il successivo sviluppo e accoppiamento.
5. Istituzione e passaggio delle linee mutanti
- Eseguire incroci utilizzando i mutanti G0 e le locuste wild-type (Figura 4B). Raccogliere le oocisti e incubarle separatamente a 30 °C. Utilizzare 3-6 uova sviluppate in ciascuna oocisti per rilevare le mutazioni descritte nei punti 4.2 e 4.3. Mantenere le oocisti positive alla mutazione per lo sviluppo successivo e abbandonare le oocisti negative alla mutazione.
NOTA: La stima del tasso di mutazione allo stadio embrionale può accelerare notevolmente lo screening dei mutanti G1 . Di solito, 3-6 uova sviluppate possono essere mescolate come un campione per la genotipizzazione mediata dalla PCR come descritto sopra. - Sollevare le ninfe G1 come descritto al punto 4.4. Tagliare circa 2 mm di lunghezza delle antenne per eseguire la genotipizzazione basata sulla PCR come descritto nella fase 4.5 per rilevare gli eterozigoti G1 . Eseguire la clonazione di TA secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali) per identificare le loro mutazioni. Eseguire in-cross utilizzando eterozigoti G1 con le stesse mutazioni per ottenere ninfe G2 .
NOTA: Il sequenziamento con metodo Sanger dei prodotti PCR può fornire solo informazioni per scoprire gli eterozigoti, ma non informazioni sufficienti per identificare le mutazioni esatte. Pertanto, la clonazione di TA utilizzando i prodotti PCR è necessaria per identificare chiaramente le mutazioni e può promuovere la creazione di linee mutanti stabili. - Alleva le ninfe G2 fino al loro quinto instar. Utilizzare la genotipizzazione basata sulla PCR descritta nella fase 5.2 per identificare gli omozigoti e/o gli eterozigoti che sono adatti per ulteriori ricerche e passaggi stabili (Figura 4B).
NOTA: Prestare attenzione ad evitare la mescolanza di omozigoti ed eterozigoti. Si raccomanda di eseguire la genotipizzazione basata sulla PCR in ogni generazione per confermare l'omozigosi e/o l'eterozigosi di ciascuna popolazione. Il numero di locuste utilizzate per questo controllo dipende dalla dimensione della popolazione. Inoltre, la popolazione di locuste può essere ampliata dalla strategia in-cross.
6. Crioconservazione e rianimazione degli ovociti
- Lavare le uova da crioconservare con acqua sterile e incubarle in un piatto di coltura come descritto sopra (fase 3.8) per 5-6 giorni. Raccogli queste uova insieme nel piatto di coltura e coprile con frammenti di carta da filtro. Avvolgere l'intero piatto di cultura con una pellicola di paraffina.
- Conservare il piatto a 25 °C per 2 giorni seguiti da altri 2 giorni ad una temperatura relativamente più bassa (13-16 °C). Quindi, trasferire il piatto in un frigorifero a 6 °C. Aggiungere acqua ogni 2 settimane per fornire un ambiente umido per le uova (Figura 5A).
NOTA: Si ipotizza che gli embrioni siano allo stadio di katatrepsi dopo essere stati sviluppati per 5-6 giorni a 30 °C26. Il raffreddamento a gradiente è utile per la crioconservazione delle uova (Tabella 5). - Per rianimare gli ovuli crioconservati, estrarre la capsula di Petri dal frigorifero e mantenerla a 25 °C per 2 giorni. Porre queste uova in un'incubatrice a 30 °C fino alla schiusa delle ninfe (Figura 5B).
NOTA: È necessario mettere gli ovuli crioconservati a 25 °C prima di trasferirli in un'incubatrice a 30 °C. Gli embrioni possono essere crioconservati per almeno cinque mesi, anche se il tasso di schiusa e il tasso di eclosione possono diminuire a causa della crioconservazione (Tabella 5).
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Representative Results
Questo protocollo contiene i passaggi dettagliati per generare mutanti omozigoti delle locuste migratorie con l'RNP costituito dalla proteina Cas9 e sgRNA sintetizzato in vitro . I seguenti sono alcuni risultati rappresentativi del knockout del gene bersaglio mediato da CRISPR / Cas9 nelle locuste, tra cui selezione del bersaglio, sintesi e verifica dell'sgRNA (Figura 1A), raccolta e iniezione di ovociti, screening mutante e passaggio, crioconservazione e rianimazione delle uova omozigoti.
In questo studio, il sito target per il sistema CRISPR / Cas9 viene selezionato in base ai risultati di tre programmi online (E-CRISP, CRISPOR e ZiFit) e situato nel primo esone (Figura 1B). Secondo il test di clivaggio Cas9 in vitro (Tabella 1), l'RNP CRISPR / Cas9 potrebbe digerire il frammento PCR (contenente il sito target) con un tasso di scissione di circa il 55% (Figura 1C). Quindi, questo RNP è stato microiniettato in 120 uova fecondate nella loro fase unicellulare utilizzando il sistema di microiniezione standard (Figura 2 e Figura 3). I risultati del sequenziamento per la stima del tasso di mutazione in stadio embrionale hanno suggerito un efficiente editing del genoma nel sito target (Figura 4A). Inoltre, questo studio ha portato a un tasso di schiusa delle ninfe del 52,73% e il 66,7% degli adulti G0 erano mutanti a mosaico (Tabella 4).
Inoltre, le chimere G0 sono state incrociate con locuste wild-type per ottenere individui eterozigoti G 1 e gli eterozigoti G1 con le stesse mutazioni (schermati mediante clonazione TA) sono stati incrociati per generare gli animali G2. La fenotipizzazione basata sulla PCR è stata utilizzata per rilevare i mutanti e gli omozigoti ottenuti sono stati incrociati per stabilire linee mutanti stabili (Figura 4B).
Nel frattempo, le uova omozigoti in eccesso sono state crioconservate per migliorare il tasso di utilizzo degli omozigoti. Sebbene il tasso di schiusa delle uova crioconservate sia stato ridotto con l'estensione del tempo di crioconservazione (Tabella 5), le azioni correttive, tra cui l'applicazione di frammenti di carta da filtro per mantenere le uova bagnate e il recupero di queste uova conservate con un gradiente di aumento della temperatura, sono state entrambe utili per la rianimazione (Figura 5 e Tabella 5). Infine, la popolazione omozigote di mutanti è stata mantenuta con successo per la ricerca successiva.
Figura 1: Progettazione del bersaglio e verifica in vitro dell'sgRNA. (A) Il diagramma di flusso per la selezione del bersaglio, la sintesi di sgRNA e la verifica della bioattività in vitro (incluso ma non limitato alle locuste). (B) Diagramma schematico della struttura genica e del sito bersaglio. Gli esoni di questo gene bersaglio sono mostrati come domini blu e il sito bersaglio è stato selezionato a valle del codone iniziale nell'esone 1. La sequenza di destinazione è evidenziata in rosso. (C) L'elettroforesi su gel di agarosio risulta dal saggio di scissione Cas9 in vitro. Un frammento di DNA che ospita la sequenza bersaglio (circa 400 bp di lunghezza) è stato amplificato e utilizzato come substrato per la digestione Cas9. Le piccole bande previste (circa 100 bp e 300 bp qui, contrassegnate con triangoli rossi) hanno suggerito che lo sgRNA sintetizzato potrebbe indurre un'efficace scissione di Cas9. Il tasso di scissione era di circa il 55% secondo l'analisi della scala di grigi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Preparazione dell'ago e tampone di microiniezione per le uova di carrube. (A) Punta di un ago preparato per la microiniezione di uova di carrube. Barra della scala: 1 mm. (B) Immagine di un tampone di microiniezione con uova (indicate con un triangolo rosso) disposte su di esso. La barra della scala rappresenta 1 cm. (C) La dimensione del tampone di microiniezione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Microiniezioni di uova. (A) Un sistema di microiniezione rappresentativo etichettato con caselle rosse che indicano un microscopio (al centro) e un micromanipolatore (a destra) collegato a un microiniettore (a sinistra). Il computer viene utilizzato per l'archiviazione dei dati e per fornire osservazioni ausiliarie. (B) Iniezione dell'uovo di carrube. Il sito di iniezione è contrassegnato da un triangolo rosso. (C) Una ninfa tratteggiata al microscopio. Le barre della scala rappresentano 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Risultati del sequenziamento degli animali G 0 e strategia di passaggio delle linee mutanti. (A) I risultati tipici del sequenziamento sono nello screening G0. Picchi multipli vicino al sito target (contrassegnati con un rettangolo rosso nella sequenza wild-type) hanno indicato che l'uovo / locusta testato è stato modificato con successo dal sistema CRISPR / Cas9 (come mostrato in G 0-1 e G0-2), mentre l'individuo senza alcun cambiamento nel risultato del sequenziamento è stato considerato come non modificato e abbandonato (ad esempio, G0-3). (B) La strategia di passaggio delle linee mutanti. Gli animali G0 sono stati prima sottoposti a screening mediante genotipizzazione mediata da PCR e quelli con picchi multipli nei loro risultati di sequenziamento sono stati incrociati con locuste selvatiche per generare gli animali G1. La genotipizzazione mediata dalla PCR e la clonazione TA sono state utilizzate per identificare gli eterozigoti G1. Quindi, gli eterozigoti con le stesse mutazioni sono stati incrociati per generare gli animali G2 (omozigoti ed eterozigoti) per ulteriori ricerche e passaggi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Crioconservazione e rianimazione degli ovociti. (A) La procedura di crioconservazione: isolare le uova dai baccelli e incubarle a 30 °C per 5-6 giorni dopo il lavaggio con acqua sterile. Quindi, raccogliere le uova sviluppate insieme nella piastra di Petri e coprirle con piccoli ritagli di carta da filtro umida. Avvolgere l'intera capsula di Petri con una pellicola di paraffina e mantenerla a 25 °C per 2 giorni, seguiti da altri 2 giorni a una temperatura relativamente più bassa (ad esempio, 13-16 °C). Infine, conservare in frigorifero a 6 °C. (B) La procedura di rianimazione: estrarre dal frigorifero le piastre di Petri con uova crioconservate e conservarle a 25 °C per 2 giorni dopo aver rimosso gli avanzi di carta da filtro. Quindi, le uova possono essere coltivate per lo sviluppo successivo a 30 ° C fino alla schiusa delle ninfe. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Reagente | Volume (μL) |
| Proteina Cas9 (300 ng/μL) | 1 |
| sgRNA (300 ng/μL) | 1 |
| Prodotto PCR (200 ng/μL) | 1 |
| 10×NEBuffer r3.1 | 1 |
| Acqua esente da nucleasi | 6 |
Tabella 1: Sistema di digestione in vitro . 200 ng di frammento bersaglio purificato (prodotto PCR) sono stati miscelati con il sistema CRISPR/Cas9 (300 ng di ciascun componente) per testare la bio-attività degli sgRNA sintetizzati. È stato utilizzato un tampone commerciale ed è stata aggiunta acqua priva di nucleasi per portare il volume totale a 10 μL.
| Reagente | Volume (μL) |
| 2xEs Taq MasterMix | 12.5 |
| Primer in avanti | 0.5 |
| Primer inverso | 0.5 |
| Modello (prodotto di lisi) | 1 |
| Acqua esente da nucleasi | 10.5 |
Tabella 2: Sistema PCR per l'amplificazione del frammento genico bersaglio. Per amplificare il frammento genomico del gene bersaglio, è stata utilizzata una miscela Taq commerciale e sono stati aggiunti primer secondo le istruzioni del produttore. 1 μL del prodotto di lisi è stato utilizzato come modello e acqua priva di nucleasi è stata utilizzata per portare il volume totale a 25 μL.
| Temperatura (°C) | Ore | Cicli |
| 95 | 5 minuti | 1 |
| 95 | 30 secondi | 35 |
| 55 | 30 secondi | |
| 72 | 40 secondi | |
| 72 | 10 minuti | 1 |
Tabella 3: Programma PCR per l'amplificazione genica bersaglio. Il programma PCR per l'amplificazione del gene bersaglio era: 95 °C per 5 minuti; 35 cicli di 95 °C per 30 s, 55 °C per 30 s, 72 °C per 40 s; 72 °C per 10 min.
| Elementi | Dati |
| N. di uova iniettate | 120 |
| Embrioni testati | 10 |
| N. di ninfe tratteggiate | 58 |
| Tasso di schiusa | 52.73% |
| Numero di G0 adulti | 12 |
| N. di mutanti G0 | 8 |
| Efficienza mutazionale negli adulti G0 | 66.67% |
Tabella 4: Riepilogo dell'efficienza di editing. Sono state iniettate 120 uova per eliminare il gene bersaglio e 10 uova sono state prelevate per il test durante la fase embrionale. 58 ninfe si sono schiuse dagli altri embrioni (il tasso di schiusa era del 52,73%). Infine, 12 locuste G0 si sono sviluppate fino allo stadio adulto e 8 di esse sono state modificate con successo nel sito target. Il tasso di mutazione negli adulti G0 è stato del 66,67%.
| Gruppo di controllo | Gruppo 1 | Gruppo 2 | Gruppo 3 | Gruppo 4 | |
| N. di uova | 120 | 120 | 120 | 120 | 120 |
| Trattamento termico per lo stoccaggio | 30 °C | 30°C (5-6 d)→6 °C | 30°C (5-6 d)→25°C (2 d)→13-16°C (2 d)→6 °C | 30°C (5-6 d)→25°C (2 d)→13-16°C (2 d)→6 °C | 30°C (5-6 d)→25°C (2 d)→13-16°C (2 d)→6 °C |
| Tempo di conservazione | 14 giorni | 14 giorni | 1 mese | 3 mesi | 5 mesi |
| Trattamento termico per la rianimazione | 30 °C | 6°C→30 °C | 6°C→25°C (2 d)→30 °C | 6°C→25°C (2 d)→30 °C | 6°C→25°C (2 d)→30 °C |
| N. di locuste tratteggiate | 108 | 0 | 96 | 86 | 78 |
| Tasso di schiusa | 90.00% | 0 | 80.00% | 71.67% | 65.00% |
| N. di locuste adulte | 81 | 0 | 60 | 46 | 31 |
| Tasso di chiusura | 75.00% | 0 | 62.50% | 53.49% | 39.74% |
Tabella 5: Riassunto della crioconservazione e della rianimazione degli ovuli. 600 uova sono state divise in cinque gruppi per lo studio di crioconservazione e rianimazione. Il primo gruppo (controllo) di 120 uova è stato sempre incubato a 30 °C e conservato per 14 giorni. Il secondo gruppo (Gruppo 1) di 120 uova è stato trasferito in frigorifero dopo incubazione a 30 °C per 5-6 giorni e conservato a 6 °C per 14 giorni. Quindi, queste uova sono state trasferite a 30 ° C per la rianimazione. Gli altri gruppi (gruppo 2, gruppo 3 e gruppo 4, ogni gruppo conteneva 120 uova) hanno sperimentato un trattamento di raffreddamento a gradiente e recupero della temperatura come descritto nel protocollo (fasi 6.1-6.3) con un tempo di conservazione diverso (1 mese per il gruppo 2, 3 mesi per il gruppo 3 e 5 mesi per il gruppo 4). Alla fine, 108 ninfe si sono schiuse dal gruppo di controllo (con un tasso di schiusa del 90%) e 81 di loro si sono sviluppate allo stadio adulto (75% del tasso di eclosione). Nessuna locusta è nata nel secondo gruppo (Gruppo 1). Il tasso di schiusa e il tasso di eclisione degli altri gruppi erano inferiori rispetto al gruppo di controllo e diminuivano con il tempo di conservazione. 96 ninfe si sono schiuse nel gruppo 2 e 60 di loro si sono sviluppate fino allo stadio adulto. 86 ninfe si sono schiuse nel gruppo 3 e 46 di loro si sono sviluppate fino allo stadio adulto. Nel gruppo 4, 78 ninfe si schiusero e 31 di loro si svilupparono fino allo stadio adulto.
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Discussion
Le locuste sono state tra i parassiti più devastanti per l'agricoltura dalla civiltà degli esseri umani23. La tecnologia di modifica del genoma basata su CRISPR / Cas9 è un potente strumento per fornire una migliore conoscenza dei meccanismi biologici nelle locuste e una promettente strategia di controllo dei parassiti. Pertanto, è di grande beneficio sviluppare un metodo efficiente e facile da usare per la costruzione mediata da CRISPR / Cas9 di mutanti di locuste omozigoti. Sebbene alcuni grandi lavori siano stati riportati e abbiano fornito alcuni flussi di lavoro di base per l'editing del genoma nelle locuste 18,20,21,22, manca ancora un'ottimizzazione sistematica dell'intera procedura. In generale, il mutante omozigote delle locuste generato dall'iniezione embrionale del sistema CRISPR / Cas9 può essere suddiviso in tre fasi principali: a) progettazione, sintesi e screening dello sgRNA in vitro, b) raccolta, preparazione e iniezione di ovociti; e c) screening mutante e mantenimento dell'omozigote. Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro ottimizzato e le fasi di selezione del sito target, screening in vitro dell'sgRNA, microiniezione delle uova e rilevamento dei mutanti sono particolarmente critiche per generare efficacemente locuste mutanti omozigoti con il sistema CRISPR / Cas9.
In primo luogo, il sito bersaglio, la forma del corrispondente sgRNA e la concentrazione di sgRNA sono stati suggeriti come fattori critici dell'efficienza di editing del genoma negli insetti18,27,28. Per risolvere questo problema, si raccomanda di analizzare prima la struttura del gene e progettare più di un sito target sull'esone 1 o vicino al codone iniziale utilizzando le risorse online. Quindi, sintetizzare sgRNA in vitro e mescolarlo con la proteina Cas9 a diverse concentrazioni per ottimizzare l'efficienza di taglio dell'RNP. Questa procedura aiuterà a identificare uno sgRNA con elevata bioattività e ottimizzare la composizione del complesso RNP per il gene bersaglio candidato.
In secondo luogo, raccogliere il maggior numero possibile di uova fresche in un tempo limitato e migliorare il tasso di schiusa e il tasso di mutazione sono anche grandi sfide per le operazioni di modifica del genoma. Le locuste adulte gregarie allevate alla condizione di 16 (luce):8 (scuro) fotoperiodo vengono utilizzate per raccogliere abbastanza uova in un breve periodo durante le 9:00-11:00 del mattino. È importante applicare delicatamente una pressione verso il basso tra le uova usando un pennello o una pinzetta per isolare accuratamente le uova dal baccello. Con abbastanza pratica, più utenti possono separare in modo affidabile le singole uova dal baccello. Dopo che ogni uovo è stato isolato e lavato con acqua sterile, le uova sono allineate sui tamponi di iniezione progettati (Figura 2B, C) per stabilizzare le uova durante la microiniezione. L'uovo viene iniettato con l'RNP ottimizzato vicino ai micropili. Per limitare i danni meccanici e ridurre al minimo l'inquinamento delle uova, le uova fresche possono rimanere nei baccelli per circa 30 minuti per assicurarsi che l'abbronzatura del guscio d'uovo sia ideale per la microiniezione21, grazie alla sua struttura condensata e all'elevata capacità di difesa sull'invasione dopo abbastanza abbronzatura 29,30. Nel frattempo, un rapporto pubblicato ha indicato che la divisione sinciziale31 delle uova di locuste si verifica ad un certo punto tra 0 h e 4 h dopo la deposizione. Con l'attuale protocollo standard di microiniezione, l'iniezione di circa 100 uova può essere effettuata entro 40 minuti. Nel loro insieme, la procedura di concia e microiniezione di 100 uova fecondate può essere completata entro 2 ore. Pertanto, rimangono almeno 2 ore per la scissione mediata da CRISRP / Cas9 e la riparazione dei geni bersaglio per ottenere una mutazione efficiente nelle uova iniettate e nelle future locuste adulte.
Infine, strategie efficaci per il passaging e l'identificazione dei mutanti sono importanti per generare omozigoti nella maggior parte degli animali mutanti. Nelle locuste, per i geni che non sono letali dopo l'editing, la strategia incrociata suggerita qui è che i mutanti G0 si incrociano con locuste di tipo largo e ulteriori in-cross possono essere eseguiti usando gli eterozigoti G1 con le stesse mutazioni per generare mutanti omozigoti nella generazione successiva. Per verificare la mutazione in ciascuna locusta durante il processo di ereditarietà mutante, si raccomanda di utilizzare il metodo della lisi alcalina per digerire un breve segmento di antenne come modello per la genotipizzazione basata sulla PCR. Infine, utilizzare gli adulti omozigoti ottenuti per ulteriori in-cross per espandere la popolazione. Limitate dalle dimensioni della popolazione e dalle differenze di stadio di sviluppo tra le locuste omozigoti, le uova in eccesso sono raccomandate per la crioconservazione a 6 °C e la rianimazione mediante aumento della temperatura del gradiente (Figura 5), che si basa sul principio della diapausa a bassa temperatura e del rilascio di diapausa ad alta temperatura delle uova di locuste migratorie32,33.
In breve, il sistema CRISPR / Cas9 ha dimostrato di essere uno strumento affidabile per facilitare lo studio della genomica funzionale delle locuste migratorie. Questo protocollo dettagliato può essere utilizzato come riferimento per applicazioni di editing genetico basate su CRISPR / Cas9 nelle locuste migratorie e in altri insetti.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (32070502, 31601697, 32072419 e dalla China Postdoctoral Science Foundation (2020M672205).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×NEBuffer r3.1 | New England Biolabs | B7030S | The buffer of in vitro Cas9 cleavage assays |
| 2xEs Taq MasterMix (Dye) | Cwbio | CW0690 | For gene amplification |
| 2xPfu MasterMix (Dye) | Cwbio | CW0686 | For gene amplification |
| CHOPCHOP | Online website for designing sgRNAs, http://chopchop.cbu.uib.no/. | ||
| CRISPOR | Online website for designing sgRNAs, http://crispor.org. | ||
| CRISPRdirect | Online website for designing sgRNAs, http://crispr.dbcls.jp/. | ||
| Electrophoresis power supply | LIUYI BIOLOGY | DYY-6D | Separation of nucleic acid molecules of different sizes |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 30125177 | For sample collection, etc. |
| Fine brushes | Annigoni | 1235 | For cleaning and isolating eggs. Purchased online. |
| Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | For making the microinjection needles |
| Gel Extraction Kit | Cwbio | CW2302 | DNA recovery and purification |
| Gel Imaging Analysis System | OLYMPUS | Gel Doc XR | Observe the electrophoresis results |
| GeneTouch Plus | Bioer | B-48DA | For gene amplification |
| Glass electrode capillary | Gairdner | GD-102 | For making injection needles with a micropipette Puller |
| Incubator | MEMMERT | INplus55 | For migratory locust embryo culture |
| Metal bath | TIANGEN | AJ-800 | For heating the sample |
| Micro autoinjector | Eppendorf | 5253000068 | Microinjection of embryos early in development |
| Micro centrifuge | Allsheng | MTV-1 | Used for mixing reagents |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | To ground the tip of injection needle |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | For loading solutions into the injection needles. |
| Micromanipulation system | Eppendorf | TransferMan 4r | An altinative manipulation system for microinjection |
| Microscope | cnoptec | SZ780 | For microinjection |
| Motor-drive Manipulator | NARISHIGE | MM-94 | For controling the position of the micropipette during the microinjection precedure |
| Multi-Sample Tissue Grinder | jingxin | Tissuelyser-64 | Grind and homogenize the eggs |
| ovipisition pot | ChangShengYuanYi | CS-11 | Filled with wet sterile sand for locust ovipositing in it. The oocysts are collected from this container. Purchased online. |
| Parafilm | ParafilmM | PM996 | For wrapping the petri dishes. |
| pEASY-T3 Cloning Kit | TransGen Biotech | CT301-01 | For TA cloning |
| Petri dish | NEST | 752001 | For culture and preservation of the eggs. |
| Pipettor | Eppendorf | Research plus | For sample loading |
| plastic culture cup | For rearing locusts seperately and any plastic cup big enough (not less than 1000 mL in volume) will do. Purchased online. | ||
| Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Primer Premier | PREMIER Biosoft | Primer Premier 5.00 | For primer design |
| SnapGene | Insightful Science | SnapGene®4.2.4 | For analyzing sequences |
| Steel balls | HuaXinGangQiu | HXGQ60 | For sample grinding.Purchased online. |
| Tips | bioleaf | D781349 | For sample loading |
| Trans DNA Marker II | TransGen Biotech | BM411-01 | Used to determine gene size |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo | A36496 | Cas9 protein |
| UniversalGen DNA Kit | Cwbio | CWY004 | For genomic DNA extraction |
| VANNAS Scissors | Electron Microscopy Sciences | 72932-01 | For cutting off the antennae |
| Wheat | To generate wheat seedlings as the food for locusts. Bought from local farmers. | ||
| ZiFiT | Online website for designing sgRNAs, http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx. |
References
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