Construction de mutants homozygotes du criquet migrateur à l’aide de la technologie CRISPR/Cas9

Qiang Yan; Yingying He; Yang Yue; Luyao Jie; Tingmei Wen; Yumiao Zhao; Min Zhang; Tingting Zhang

doi:10.3791/63629

Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Construction de mutants homozygotes du criquet migrateur à l’aide de la technologie CRISPR/Cas9

3K vues

⸱

DOI :

10.3791/63629

⸱

16 mars 2022

Qiang Yan^*¹ , Yingying He^*²^,³ , Yang Yue²^,³ , Luyao Jie¹ , Tingmei Wen²^,³ , Yumiao Zhao²^,³ , Min Zhang² , Tingting Zhang²

¹State Key Laboratory of Cotton Biology, Key Laboratory of Plant Stress Biology, School of Life Sciences, Henan University, ²Research Institute of Applied Biology, Shanxi University, ³School of Life Science, Shanxi University

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cette étude fournit une procédure systématiquement optimisée de construction à base de ribonucléase CRISPR/Cas9 de mutants homozygotes ainsi qu’une méthode détaillée de cryoconservation et de réanimation des œufs de criquets.

Résumé

Le criquet migrateur, Locusta migratoria, est non seulement l’un des criquets pèlerins du monde qui a causé d’énormes pertes économiques aux êtres humains, mais aussi un modèle de recherche important pour la métamorphose des insectes. Le système CRISPR / Cas9 peut localiser avec précision un locus d’ADN spécifique et se fendre dans le site cible, introduisant efficacement des cassures double brin pour induire l’élimination du gène cible ou intégrer de nouveaux fragments de gènes dans le locus spécifique. L’édition du génome médiée par CRISPR/Cas9 est un outil puissant pour répondre aux questions rencontrées dans la recherche acridienne ainsi qu’une technologie prometteuse pour la lutte antiacridienne. Cette étude fournit un protocole systématique pour l’élimination du gène médiée par CRISPR/Cas9 avec le complexe de la protéine Cas9 et des ARN guides uniques (ARNsg) chez les criquets migrateurs. La sélection des sites cibles et la conception de l’ARNg sont décrites en détail, suivies de la synthèse in vitro et de la vérification des ARNg. Les procédures ultérieures comprennent la collecte des radeaux d’œufs et la séparation des œufs bronzés pour obtenir une micro-injection réussie avec un faible taux de mortalité, la culture d’œufs, l’estimation préliminaire du taux de mutation, la reproduction acridienne ainsi que la détection, la préservation et le passage des mutants pour assurer la stabilité de la population des criquets modifiés. Cette méthode peut être utilisée comme référence pour les applications d’édition de gènes basées sur CRISPR/Cas9 chez les criquets migrateurs ainsi que chez d’autres insectes.

Introduction

Les technologies d’édition de gènes pourraient être utilisées pour introduire des insertions ou des délétions dans un locus génomique spécifique afin de modifier artificiellement le gène cible à dessein¹. Au cours des dernières années, la technologie CRISPR / Cas9 s’est développée rapidement et a un champ d’applications croissant dans divers domaines des sciences de la vie 2,3,4,5,6. Le système CRISPR / Cas9 a été découvert en 1987⁷ et largement trouvé chez le....