Summary
Cette étude fournit une procédure systématiquement optimisée de construction à base de ribonucléase CRISPR/Cas9 de mutants homozygotes ainsi qu’une méthode détaillée de cryoconservation et de réanimation des œufs de criquets.
Abstract
Le criquet migrateur, Locusta migratoria, est non seulement l’un des criquets pèlerins du monde qui a causé d’énormes pertes économiques aux êtres humains, mais aussi un modèle de recherche important pour la métamorphose des insectes. Le système CRISPR / Cas9 peut localiser avec précision un locus d’ADN spécifique et se fendre dans le site cible, introduisant efficacement des cassures double brin pour induire l’élimination du gène cible ou intégrer de nouveaux fragments de gènes dans le locus spécifique. L’édition du génome médiée par CRISPR/Cas9 est un outil puissant pour répondre aux questions rencontrées dans la recherche acridienne ainsi qu’une technologie prometteuse pour la lutte antiacridienne. Cette étude fournit un protocole systématique pour l’élimination du gène médiée par CRISPR/Cas9 avec le complexe de la protéine Cas9 et des ARN guides uniques (ARNsg) chez les criquets migrateurs. La sélection des sites cibles et la conception de l’ARNg sont décrites en détail, suivies de la synthèse in vitro et de la vérification des ARNg. Les procédures ultérieures comprennent la collecte des radeaux d’œufs et la séparation des œufs bronzés pour obtenir une micro-injection réussie avec un faible taux de mortalité, la culture d’œufs, l’estimation préliminaire du taux de mutation, la reproduction acridienne ainsi que la détection, la préservation et le passage des mutants pour assurer la stabilité de la population des criquets modifiés. Cette méthode peut être utilisée comme référence pour les applications d’édition de gènes basées sur CRISPR/Cas9 chez les criquets migrateurs ainsi que chez d’autres insectes.
Introduction
Les technologies d’édition de gènes pourraient être utilisées pour introduire des insertions ou des délétions dans un locus génomique spécifique afin de modifier artificiellement le gène cible à dessein1. Au cours des dernières années, la technologie CRISPR / Cas9 s’est développée rapidement et a un champ d’applications croissant dans divers domaines des sciences de la vie 2,3,4,5,6. Le système CRISPR / Cas9 a été découvert en 19877 et largement trouvé chez les bactéries et les archées. D’autres recherches ont indiqué qu’il s’agissait d’un système immunitaire adaptatif procaryote qui dépend de la nucléase guidée par ARN Cas9 pour lutter contre les phages8. Le système CRISPR/Cas9 modifié artificiellement se compose principalement de deux composants, un seul ARN guide (ARNsg) et la protéine Cas9. Le sgRNA est constitué d’un ARN CRISPR (ARNcr) complémentaire à la séquence cible et d’un ARNcr transactivateur auxiliaire (ARNtrac), qui est relativement conservé. Lorsque le système CRISPR/Cas9 est activé, le sgRNA forme une ribonucléoprotéine (RNP) avec la protéine Cas9 et guide Cas9 vers son site cible via l’appariement de base des interactions ARN-ADN. Ensuite, l’ADN double brin peut être clivé par la protéine Cas9 et, par conséquent, la rupture double brin (DSB) émerge près du motif adjacent protospacer (PAM) du site cible 9,10,11,12. Pour atténuer les dommages causés par les DSB, les cellules activeraient des réponses complètes aux dommages à l’ADN pour détecter efficacement les dommages génomiques et lancer la procédure de réparation. Il existe deux mécanismes de réparation distincts dans la cellule : la jonction d’extrémité non homologue (NHEJ) et la réparation dirigée par homologie (HDR). NHEJ est la voie de réparation la plus courante qui peut réparer rapidement les cassures double brin de l’ADN et prévenir l’apoptose cellulaire. Cependant, il est sujet aux erreurs en laissant de petits fragments d’insertions et de délétions (indels) près des DSB, ce qui entraîne généralement un décalage de cadre de lecture ouvert et peut donc conduire à l’élimination des gènes. En revanche, la réparation homologue est un événement assez rare. À condition qu’il existe un modèle de réparation avec des séquences homologues au contexte du DSB, les cellules répareraient occasionnellement la rupture génomique selon le modèle voisin. Le résultat du HDR est que le DSB est réparé avec précision. En particulier, s’il y a une séquence supplémentaire entre les séquences homologues dans le modèle, elles seraient intégrées dans le génome par HDR, et de cette façon, les insertions de gènes spécifiques pourraient être réalisées13.
Avec l’optimisation et le développement des structures de l’ARNg et des variantes de la protéine Cas9, le système d’édition génétique basé sur CRISPR / Cas9 a également été appliqué avec succès dans la recherche sur les insectes, y compris, mais sans s’y limiter, Drosophila melanogaster, Aedes aegypti, Bombyx mori, Helicoverpa Armigera, Plutella xylostella et Locusta migratoria 14,15,16,17,18 ,19. À la connaissance des auteurs, bien que des RNP constitués de la protéine Cas9 et d’ARNg transcrits in vitro aient été utilisés pour l’édition du génome du criquet20,21,22, un protocole systématique et détaillé pour la construction médiée par la ribonucléase CRISPR / Cas9 de mutants homozygotes du criquet migrateur fait toujours défaut.
Le criquet migrateur est un ravageur agricole important qui a une distribution mondiale et constitue une menace importante pour la production alimentaire, étant particulièrement nocif pour les plantes graminées, telles que le blé, le maïs, le riz et le millet23. L’analyse de la fonction des gènes basée sur les technologies d’édition du génome peut fournir de nouvelles cibles et de nouvelles stratégies pour la lutte contre les criquets migrateurs. Cette étude propose une méthode détaillée pour éliminer les gènes du criquet migrateur via le système CRISPR/Cas9, comprenant la sélection des sites cibles et la conception des ARNsg, la synthèse in vitro et la vérification des ARNg, la microinjection et la culture d’œufs, l’estimation du taux de mutation au stade embryonnaire, la détection des mutants ainsi que le passage et la préservation des mutants. Ce protocole pourrait être utilisé comme référence basale pour la manipulation de la grande majorité des gènes de criquets et peut fournir des références précieuses pour l’édition du génome d’autres insectes.
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Protocol
1. Sélection du site cible et conception de l’ARNg
- Recueillir autant d’informations que possible sur les séquences du gène d’intérêt par la recherche documentaire et/ou la recherche de l’ARNm ou de la séquence d’ADN codant (CDS) du gène au NCBI et à la base de données sur les criquets24.
- Comparez la séquence du gène intéressé à sa séquence d’ADN génomique pour distinguer les régions de l’exon et de l’intron.
- Sélectionnez une région candidate pour la conception du site cible en fonction de l’objectif de la recherche. Concevez des paires d’amorces pour amplifier le fragment de région candidate et vérifier sa séquence de type sauvage en séquençant l’analyse du produit PCR.
NOTE: Il existe différentes stratégies pour la sélection de la région cible candidate. Par exemple, dans la plupart des recherches sur la fonction des gènes ou des protéines, utiliser le fragment d’exon près de son codon de départ comme région candidate pour s’assurer que toute la fonction de la protéine ou de l’ARN est perdue après l’édition du génome (c.-à-d. élimination du gène). Pour l’analyse fonctionnelle d’un domaine spécifique, sélectionnez la région candidate au début (ou aux deux extrémités) du domaine. - Utilisez des ressources en ligne telles que E-CRISP Design25 pour rechercher des sites cibles potentiels dans la région cible candidate.
- Sélectionnez « Drosophila melanogaster BDGP6 » (ou tout autre insecte) dans la liste déroulante des génomes de référence et choisissez « L’entrée est la séquence FASTA » suivie de coller la séquence de la région cible dans la zone de texte (au format FASTA).
- Démarrez l’application en appuyant sur « Démarrer la recherche sgRNA » avec « medium » et « single design » pour obtenir les sites cibles possibles. Sélectionnez 1 à 3 cibles potentielles parmi les résultats en fonction de leurs scores prédits et concevez les sgRNA correspondants en conséquence.
REMARQUE: Il existe de nombreuses autres plates-formes en ligne pour la conception CRISPR, telles que CRISPOR, CHOPCHOP, CRISPRdirect, ZiFiT, etc. (voir Tableau des matériaux). Certains d’entre eux ont la fonction de contrôle de spécificité pour les espèces dont les données de séquence génomique se trouvent dans leurs bases de données. Cependant, la séquence génomique des criquets n’a été trouvée sur aucun site Web en ligne. Il est préférable d’utiliser plus d’un outil en ligne pour la conception CRISPR chez les criquets. De manière exhaustive, examinez les résultats de différents sites Web et sélectionnez le sgRNA parmi les résultats sur le principe de la spécificité la plus élevée, de l’efficacité la plus élevée et du taux de discordance le plus faible (Figure 1A, B).
2. Synthèse et vérification de l’ARNg in vitro
- Synthétiser l’ARNg à l’aide de kits de synthèse d’ARNg conformément au manuel du fabricant (Tableau des matériaux). Cette procédure comprend généralement trois étapes: amplification du modèle d’ADN, transcription in vitro et purification de l’ARNg21. Diluer l’ARNg synthétisé avec de l’eau sans nucléase jusqu’à une concentration de stockage de 300 ng/μL pour une utilisation ultérieure.
- Amplifier et purifier le fragment de gène cible pour servir de substrat au test de clivage in vitro du système CRISPR/Cas9. Effectuez ces étapes en suivant les instructions du fabricant.
- Diluer la protéine Cas9 achetée à 300 ng/μL avec de l’eau sans nucléase. Incuber 1 μL d’ARNg (300 ng/μL) et 1 μL de protéine Cas9 (300 ng/μL) avec 200 ng de fragment cible purifié dans le tampon de clivage à 37 °C pendant 1 h (10 μL de volume total; voir Tableau 1). Estimer l’efficacité du clivage Cas9 induit par l’ARNsg par électrophorèse sur gel d’agarose (Figure 1C). Sélectionnez les sgRNA à forte activité pour la micro-injection suivante.
REMARQUE: Les résultats de l’électrophorèse sur gel d’agarose peuvent être convertis en images en niveaux de gris avec un logiciel de traitement d’image et l’efficacité du clivage est estimée en fonction des niveaux de gris des bandes de tailles spéculées.
3. Micro-injection et culture des œufs
- Préparez les aiguilles d’injection en tirant les capillaires en verre avec un extracteur de micropipette (Table of Materials). Définissez les paramètres comme suit : Heat à 588, Pull à 90, Velocity à 60 et Time à 40. Broyer la pointe de l’aiguille d’injection avec une micro-meuleuse (Table des matériaux).
REMARQUE : Les extrémités idéales des aiguilles sont ouvertes et à arêtes vives (figure 2A). Il est fortement recommandé de préparer des aiguilles supplémentaires pour les expériences car les aiguilles sont parfois bloquées ou accidentellement cassées pendant les injections. - Mélanger 1 μL de protéine Cas9 (300 ng/μL) avec 1 μL de l’ARNg vérifié (300 ng/μL) ensemble pour obtenir les RNP pour injection. Ajouter 8 μL d’eau stérile sans RNase pour porter le volume final du mélange à 10 μL. Bien mélanger la solution et la garder sur la glace.
REMARQUE: Les concentrations finales de la protéine Cas9 et des ARNg peuvent être optimisées en fonction des résultats de l’édition. Évitez la congélation et la décongélation répétitives de la solution de RNP préparée et une utilisation immédiate est recommandée. - Élever les criquets adultes mâles et femelles ensemble à 30 °C avec une photopériode de 16 (clair):8 (foncé) et leur fournir suffisamment de plants de blé frais comme nourriture. Observez ces criquets tous les jours et placez un pot de ponte (un pot de fleurs en plastique ou une tasse remplie de sable stérile humide) dans la cage d’élevage pour la ponte une fois que les criquets se sont accouplés.
NOTE: Habituellement, 100 couples de criquets adultes élevés dans une cage d’élevage (40 cm x 40 cm x 40 cm) suffisent pour générer des œufs pour éliminer un seul gène. Cultiver des paires de criquets supplémentaires si plus d’œufs sont nécessaires. - Ramassez les gousses fraîchement pondues dans le pot de ponte et attendez environ 30 minutes pour le tannage des œufs. Isolez délicatement les œufs des gousses dans de l’eau à l’aide d’une brosse fine et lavez-les trois fois à l’eau stérile. Gardez les œufs dans une boîte de Petri et ajoutez de l’eau stérile pour les garder humides.
NOTE: Le tannage des œufs nouvellement pondus peut améliorer considérablement l’efficacité mutante21. - Remplissez une aiguille d’injection avec la solution de RNP préparée et chargez-la sur le micromanipulateur (Tableau des matériaux).
- Réglez les paramètres de micro-injection comme suit : 300 hPa de pression d’injection (pi), 0,5 s du temps d’injection (ti) et 25 hPa de la pression de compensation (pc).
- Appuyez sur la pédale pour évaluer le volume de la solution injectée. Ajustez la pression et le temps d’injection pour vous assurer que le volume d’injection est d’environ 50-100 nL.
REMARQUE: Évacuez l’air résiduel dans l’aiguille pour rendre la solution d’injection continue et contrôlable autant que possible. La connexion de l’aiguille et du micromanipulateur doit être serrée.
- Disposer régulièrement les œufs stériles sur le tampon d’injection (Figure 2B,C) et placer le tampon sur la table à objets du microscope (Figure 3A). Ajustez le grossissement du microscope jusqu’à ce que les œufs soient observés. Ajustez l’aiguille de micro-injection au microscope jusqu’à ce que l’embout d’injection puisse être vu et placez-le près de l’œuf à injecter.
- Commencez l’injection à une hauteur appropriée et à un angle de 30-45 degrés. Insérez soigneusement l’embout dans l’œuf près des micropyles de l’œuf (Figure 3B) et appuyez sur la pédale pour effectuer l’injection. Rétractez rapidement l’aiguille et déplacez le tampon d’injection pour l’injection de l’œuf suivant.
REMARQUE: Une légère expansion de l’œuf pendant la micro-injection doit être observée. Une petite quantité de fuite cytoplasmique au sténopé est acceptable. Remplacez l’aiguille d’injection par une nouvelle ou ajustez l’angle d’injection si l’écoulement du liquide est trop important. - Transférer les œufs injectés dans une boîte de culture (une boîte de Petri avec un morceau de papier filtre humide) et les placer dans un incubateur à 30 °C.
NOTE: Il faudra environ 13-14 jours pour que les nymphes éclosent de ces œufs injectés (à condition que la mutation du gène cible n’affecte pas le développement des embryons) (Figure 3C). Injectez au moins 100 œufs pour assurer une quantité suffisante d’éclosion et d’éclosion pour éliminer un gène spécifique.
4. Estimation du taux de mutation et criblage des mutants
- Vérifiez le développement des ovules injectés tous les jours après l’injection. Transférer les œufs injectés dans une nouvelle boîte de culture toutes les 24 heures au cours des 5 premiers jours.
- Le 6e jour (ou plus tard) après l’injection, cueillir et transférer au hasard 10 œufs dans un tube et broyer adéquatement les œufs avec deux billes d’acier à 60 Hz pendant 6 minutes à l’aide d’un broyeur (voir le tableau des matériaux). Remettez les débris en suspension avec 1 mL de PBS. Transvaser 5 μL du mélange dans 45 μL de NaOH 50 mM et lyser à 95 °C pendant 5 min. Ajouter 5 μL de 1 M Tris-HCl (pH = 8,0) dans le système de lyse pour mettre fin à la réaction de lyse alcaline.
REMARQUE : Les ovules peuvent être prélevés pour la lyse alcaline n’importe quel jour après le dernier transfert et plusieurs ovules peuvent être utilisés comme un seul échantillon selon leur situation de développement (p. ex., cinq embryons âgés de 6 jours peuvent être utilisés comme un échantillon, et deux embryons de 10 jours peuvent être utilisés comme un échantillon). Parfois, il n’est pas possible d’obtenir l’ADN génomique des œufs en utilisant la méthode de lyse alcaline. Les kits commerciaux d’extraction d’ADN génomique peuvent être utilisés comme méthode alternative pour isoler l’ADN génomique des œufs. - Prendre 1 μL du produit de lyse comme modèle de PCR pour amplifier le fragment de gène cible (Tableau 2 et Tableau 3) et envoyer les produits PCR pour séquençage. Comparer les résultats du séquençage avec la séquence de type sauvage pour évaluer de manière préliminaire si le système CRISPR/Cas9 a clivé le gène cible in vivo (Figure 4A). Laisser le reste des œufs pour un développement ultérieur à condition que les indels soient détectés au stade embryonnaire.
NOTE: De cette façon, le taux de mutation peut être estimé provisoirement au stade embryonnaire. Si aucun indel n’est trouvé à cette étape, préparez de nouveaux sgRNA pour le gène cible et répétez le protocole knock-out de l’étape 2.1. - Transférer les nymphes écloses dans une cage d’élevage et les cultiver comme décrit à l’étape 3.3. Lorsque les nymphes se sont développées au stade du cinquième stade, séparez-les avec des coupes de culture en plastique (1 nymphe / tasse).
NOTE: Il faut généralement environ 25 à 35 jours pour que les nymphes se développent jusqu’à leur cinquième stade et le phénotype le plus évident est que les bourgeons alaires s’étendent jusqu’aux quatrième ou cinquième segments abdominaux. De plus, il est recommandé d’enregistrer les phénotypes des nymphes mortes pour prédire la relation entre le gène cible et les phénotypes dans des recherches ultérieures. - Couper environ 2 mm de longueur des antennes avec des ciseaux à dissection et lyser en utilisant la méthode de lyse alcaline (étape 4.2). Analyser la séquence de fragments de gènes cibles de ces nymphes comme décrit ci-dessus (étape 4.3) pour identifier les mutants G0 (Figure 4B).
REMARQUE: Les antennes coupées pour la lyse peuvent être un peu plus longues et le meulage ou le hachage des antennes est utile pour la lyse, bien que les antennes puissent être directement digérées. Les individus présentant plusieurs pics près du site cible dans le résultat du séquençage sont identifiés comme des mutants positifs et autorisés pour le développement ultérieur et l’accouplement.
5. Etablissement et passage de lignées mutantes
- Effectuer des croisements à l’aide des mutants G0 et des criquets de type sauvage (Figure 4B). Prélever les oocystes et les incuber séparément à 30 °C. Utilisez 3 à 6 œufs développés dans chaque oocyste pour détecter les mutations décrites aux étapes 4.2 et 4.3. Conservez les oocystes positifs pour le développement ultérieur et abandonnez les oocystes mutation-négative.
REMARQUE : L’estimation du taux de mutation au stade embryonnaire peut grandement accélérer le dépistage des mutants G1 . Habituellement, 3 à 6 œufs développés peuvent être mélangés en un seul échantillon pour le génotypage médié par PCR comme décrit ci-dessus. - Élever les nymphes G1 comme décrit à l’étape 4.4. Couper environ 2 mm de longueur des antennes pour effectuer le génotypage basé sur la PCR comme décrit à l’étape 4.5 pour détecter les hétérozygotes G1 . Effectuer le clonage TA conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux) pour identifier leurs mutations. Réaliser des in-cross en utilisant des hétérozygotes G1 présentant les mêmes mutations pour obtenir des nymphesG2 .
NOTE: Le séquençage de Sanger des produits PCR ne peut fournir que des informations pour découvrir les hétérozygotes, mais pas assez d’informations pour identifier les mutations exactes. Ainsi, le clonage TA à l’aide des produits PCR est nécessaire pour identifier clairement les mutations et peut favoriser l’établissement de lignées mutantes stables. - Reculez les nymphes G2 jusqu’à leur cinquième étoile. Utiliser le génotypage basé sur la PCR décrit à l’étape 5.2 pour identifier les homozygotes et/ou hétérozygotes qui conviennent à des recherches plus approfondies et à une passagère stable (Figure 4B).
REMARQUE: Faites attention à éviter de mélanger les homozygotes et les hétérozygotes. Il est recommandé d’effectuer un génotypage basé sur la PCR à chaque génération pour confirmer l’homozygotie et/ou l’hétérozygotie de chaque population. Le nombre de criquets utilisés pour ce contrôle dépend de la taille de la population. De plus, la population de criquets peut être élargie par la stratégie in-cross.
6. Cryoconservation et réanimation des ovules
- Lavez les œufs à cryoconserver avec de l’eau stérile et incuberez-les dans une boîte de culture comme décrit ci-dessus (étape 3.8) pendant 5-6 jours. Rassemblez ces œufs dans le plat de culture et recouvrez-les de fragments de papier filtre. Enveloppez tout le plat de culture avec un film de paraffine.
- Gardez le plat à 25 °C pendant 2 jours, suivis de 2 autres jours à une température relativement plus basse (13-16 °C). Ensuite, transférer le plat dans un réfrigérateur à 6 °C. Ajoutez-y de l’eau toutes les 2 semaines pour fournir un environnement humide aux œufs (figure 5A).
NOTE: Les embryons sont supposés être au stade de katatrepsis après avoir été développés pendant 5-6 jours à 30 °C 26. Le refroidissement par gradient est utile pour la cryoconservation des œufs (tableau 5). - Pour ressusciter les œufs cryoconservés, sortez la boîte de Petri du réfrigérateur et conservez-la à 25 °C pendant 2 jours. Placer ces œufs dans un incubateur à 30 °C jusqu’à l’éclosion des nymphes (Figure 5B).
NOTE: Il est nécessaire de mettre les œufs cryoconservés à 25 ° C avant de les transférer dans un incubateur à 30 ° C. Les embryons peuvent être cryoconservés pendant au moins cinq mois, bien que le taux d’éclosion et le taux d’éclosion puissent diminuer en raison de la cryoconservation (tableau 5).
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Representative Results
Ce protocole contient les étapes détaillées pour générer des mutants homozygotes des criquets migrateurs avec le RNP constitué de la protéine Cas9 et de l’ARNg synthétisé in vitro . Voici quelques résultats représentatifs de l’élimination du gène cible médiée par CRISPR/Cas9 chez les criquets, y compris la sélection de la cible, la synthèse et la vérification de l’ARNg (Figure 1A), la collecte et l’injection d’ovules, le dépistage et le passage des mutants, la cryoconservation et la réanimation des œufs homozygotes.
Dans cette étude, le site cible du système CRISPR/Cas9 est sélectionné en fonction des résultats de trois programmes en ligne (E-CRISP, CRISPOR et ZiFit) et situé dans le premier exon (Figure 1B). Selon le test de clivage Cas9 in vitro (Tableau 1), le RNP CRISPR/Cas9 a pu digérer le fragment de PCR (contenant le site cible) avec un taux de clivage d’environ 55% (Figure 1C). Ensuite, ce RNP a été micro-injecté dans 120 œufs fécondés à leur stade unicellulaire à l’aide du système de micro-injection standard (Figure 2 et Figure 3). Les résultats du séquençage pour l’estimation du taux de mutation au stade embryonnaire suggèrent une édition efficace du génome au site cible (Figure 4A). De plus, cette étude a donné lieu à un taux d’éclosion des nymphes de 52,73 % et 66,7 % des adultes G0 étaient des mutants mosaïques (tableau 4).
De plus, les chimères G0 ont été croisées avec des criquets de type sauvage pour obtenir des individus hétérozygotes G 1 et les hétérozygotes G1 avec les mêmes mutations (criblées par clonage TA) ont été croisées pour générer les animaux G2. Le phénotypage basé sur la PCR a été utilisé pour détecter les mutants et les homozygotes obtenus ont été croisés pour établir des lignées mutantes stables (Figure 4B).
Pendant ce temps, les œufs homozygotes excédentaires ont été cryoconservés pour améliorer le taux d’utilisation des homozygotes. Bien que le taux d’éclosion des œufs cryoconservés ait été réduit avec l’allongement du temps de cryoconservation (tableau 5), les mesures correctives, y compris l’application de fragments de papier filtre pour garder les œufs humides et la récupération de ces œufs conservés avec un gradient de température croissante, ont été utiles pour la réanimation (figure 5 et tableau 5). Enfin, la population homozygote de mutants a été conservée avec succès pour des recherches ultérieures.
Figure 1 : Conception de la cible et vérification in vitro de l’ARNg. (A) L’organigramme pour la sélection de la cible, la synthèse de l’ARNg et la vérification de la bioactivité in vitro (y compris, mais sans s’y limiter, les criquets). (B) Schéma de principe de la structure du gène et du site cible. Les exons de ce gène cible sont représentés comme des domaines bleus et le site cible a été sélectionné en aval du codon de départ dans l’exon 1. La séquence cible est surlignée en rouge. (C) L’électrophorèse sur gel d’agarose résulte du test de clivage Cas9 in vitro. Un fragment d’ADN abritant la séquence cible (environ 400 pb de longueur) a été amplifié et utilisé comme substrat pour la digestion Cas9. Les petites bandes attendues (environ 100 pb et 300 pb ici; marquées de triangles rouges) suggéraient que l’ARNg synthétisé pourrait induire un clivage efficace du Cas9. Le taux de clivage était d’environ 55% selon l’analyse des niveaux de gris. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Préparation de l’aiguille et du tampon de micro-injection pour les œufs de criquet. (A) Pointe d’une aiguille préparée pour la microinjection d’œufs de criquets. Barre d’échelle: 1 mm. (B) Image d’un tampon de micro-injection avec des œufs (indiqués par un triangle rouge) disposés dessus. La barre d’échelle représente 1 cm. (C) La taille du tampon de micro-injection. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Microinjections d’œufs. (A) Un système de micro-injection représentatif étiqueté avec des cases rouges indiquant un microscope (au milieu) et un micromanipulateur (à droite) relié à un micro-injecteur (à gauche). L’ordinateur est utilisé pour le stockage de données et pour fournir une observation auxiliaire. B) Injection de l’œuf de criquet. Le site d’injection est marqué d’un triangle rouge. (C) Une nymphe éclose au microscope. Les barres d’échelle représentent 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Résultats du séquençage des animaux G 0 et stratégie de passage des lignées mutantes. (A) Le séquençage typique aboutit au criblage G0. Plusieurs pics près du site cible (marqués d’un rectangle rouge dans la séquence de type sauvage) ont indiqué que l’œuf/criquet testé avait été édité avec succès par le système CRISPR/Cas9 (comme le montrent G 0-1 et G0-2), tandis que l’individu sans aucun changement dans le résultat du séquençage était considéré comme non édité et abandonné (p. ex., G0-3). (B) La stratégie de passage des lignées mutantes. Les animaux G0 ont d’abord été criblés par génotypage médié par PCR et ceux avec plusieurs pics dans leurs résultats de séquençage ont été croisés avec des criquets de type sauvage pour générer les animaux G1. Le génotypage médié par PCR et le clonage TA ont été utilisés pour identifier les hétérozygotes G1. Ensuite, des hétérozygotes avec les mêmes mutations ont été croisés pour générer les animaux G2 (homozygotes et hétérozygotes) pour des recherches plus approfondies et le passage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Cryoconservation et réanimation des œufs. (A) La procédure de cryoconservation: Isoler les œufs des gousses et les incuber à 30 ° C pendant 5-6 jours après le lavage à l’eau stérile. Ensuite, rassemblez les œufs développés dans la boîte de Petri et recouvrez-les de petits bouts de papier filtre humide. Enveloppez toute la boîte de Petri avec un film de paraffine et maintenez-la à 25 °C pendant 2 jours, puis 2 autres jours à une température relativement plus basse (par exemple, 13-16 °C). Enfin, réfrigérez-le à 6 °C. (B) La procédure de réanimation: Sortez les boîtes de Petri contenant des œufs cryoconservés du réfrigérateur et conservez-les à 25 °C pendant 2 jours après avoir retiré les chutes de papier filtre. Ensuite, les œufs peuvent être cultivés pour un développement ultérieur à 30 ° C jusqu’à l’éclosion des nymphes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Réactif | Volume (μL) |
| Protéine Cas9 (300 ng/μL) | 1 |
| ARNg (300 ng/μL) | 1 |
| Produit PCR (200 ng/μL) | 1 |
| 10×NEBuffer r3.1 | 1 |
| Eau sans nucléase | 6 |
Tableau 1 : Système de digestion in vitro . 200 ng de fragment cible purifié (produit PCR) ont été mélangés avec le système CRISPR/Cas9 (300 ng de chaque composant) pour tester la bioactivité des sgRNA synthétisés. Un tampon commercial a été utilisé et de l’eau exempte de nucléases a été ajoutée pour porter le volume total à 10 μL.
| Réactif | Volume (μL) |
| 2xEs Taq MasterMix | 12.5 |
| Amorce avant | 0.5 |
| Abécédaire inverse | 0.5 |
| Modèle (produit de lyse) | 1 |
| Eau sans nucléase | 10.5 |
Tableau 2 : Système de PCR pour l’amplification des fragments de gènes cibles. Pour amplifier le fragment génomique du gène cible, un mélange commercial Taq a été utilisé et des amorces ont été ajoutées conformément aux instructions du fabricant. 1 μL du produit de lyse a été utilisé comme matrice et de l’eau sans nucléase a été utilisée pour porter le volume total à 25 μL.
| Température (°C) | Heure | Cycles |
| 95 | 5 min | 1 |
| 95 | 30 s | 35 |
| 55 | 30 s | |
| 72 | 40 s | |
| 72 | 10 min | 1 |
Tableau 3 : Programme de PCR pour l’amplification des gènes cibles. Le programme de PCR pour l’amplification du gène cible était : 95 °C pendant 5 min ; 35 cycles de 95 °C pendant 30 s, 55 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 40 s; 72 °C pendant 10 min.
| Articles | Données |
| Nombre d’oeufs injectés | 120 |
| Embryons testés | 10 |
| Nombre de nymphes écloses | 58 |
| Taux d’éclosion | 52.73% |
| Nombre de G0 adulte | 12 |
| Nombre de mutants G0 | 8 |
| Efficacité de la mutation chez les adultes G0 | 66.67% |
Tableau 4 : Résumé de l’efficacité de l’édition. 120 ovules ont été injectés pour éliminer le gène cible et 10 œufs ont été prélevés pour être testés au stade embryonnaire. 58 nymphes ont éclos des embryons restants (le taux d’éclosion était de 52,73%). Enfin, 12 criquets G0 se sont développés jusqu’au stade adulte et 8 d’entre eux ont été édités avec succès sur le site cible. Le taux de mutation chez les adultes G0 était de 66,67%.
| Groupe témoin | Groupe 1 | Groupe 2 | Groupe 3 | Groupe 4 | |
| Nombre d’oeufs | 120 | 120 | 120 | 120 | 120 |
| Traitement thermique pour le stockage | 30 °C | 30 °C (5-6 j)→6 °C | 30 °C (5-6 d)→25 °C (2 d)→13-16 °C (2 d)→6 °C | 30 °C (5-6 d)→25 °C (2 d)→13-16 °C (2 d)→6 °C | 30 °C (5-6 d)→25 °C (2 d)→13-16 °C (2 d)→6 °C |
| Durée de stockage | 14 jours | 14 jours | 1 mois | 3 mois | 5 mois |
| Traitement thermique pour la réanimation | 30 °C | 6°C→30 °C | 6 °C→25 °C (2 d)→30 °C | 6 °C→25 °C (2 d)→30 °C | 6 °C→25 °C (2 d)→30 °C |
| Nombre de criquets éclos | 108 | 0 | 96 | 86 | 78 |
| Taux d’éclosion | 90.00% | 0 | 80.00% | 71.67% | 65.00% |
| Nombre de criquets adultes | 81 | 0 | 60 | 46 | 31 |
| Taux d’éclosion | 75.00% | 0 | 62.50% | 53.49% | 39.74% |
Tableau 5 : Résumé de la cryoconservation et de la réanimation des œufs. 600 ovules ont été divisés en cinq groupes pour une étude de cryoconservation et de réanimation. Le premier groupe (témoin) de 120 œufs a toujours été incubé à 30 °C et conservé pendant 14 jours. Le deuxième groupe (groupe 1) de 120 œufs a été transféré dans un réfrigérateur après incubation à 30 °C pendant 5-6 jours et conservé à 6 °C pendant 14 jours. Ensuite, ces œufs ont été transférés à 30 °C pour être réanimés. Les autres groupes (groupe 2, groupe 3 et groupe 4, chaque groupe contenait 120 œufs) ont subi un traitement de refroidissement et de récupération de température en gradient tel que décrit dans le protocole (étapes 6.1-6.3) avec un temps de stockage différent (1 mois pour le groupe 2, 3 mois pour le groupe 3 et 5 mois pour le groupe 4). Enfin, 108 nymphes ont éclos du groupe témoin (à un taux d’éclosion de 90%) et 81 d’entre elles se sont développées jusqu’au stade adulte (75% du taux d’éclosion). Aucun criquet n’a éclos dans le deuxième groupe (Groupe 1). Le taux d’éclosion et le taux d’éclosion des autres groupes étaient inférieurs à ceux du groupe témoin et diminuaient avec le temps de stockage. 96 nymphes ont éclos dans le groupe 2 et 60 d’entre elles se sont développées jusqu’au stade adulte. 86 nymphes ont éclos dans le groupe 3 et 46 d’entre elles se sont développées jusqu’au stade adulte. Dans le groupe 4, 78 nymphes ont éclos et 31 d’entre elles se sont développées jusqu’au stade adulte.
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Discussion
Les criquets ont été parmi les ravageurs les plus dévastateurs pour l’agriculture depuis la civilisation des êtres humains23. La technologie d’édition du génome basée sur CRISPR/Cas9 est un outil puissant pour fournir une meilleure connaissance des mécanismes biologiques chez les criquets ainsi qu’une stratégie prometteuse de lutte antiparasitaire. Ainsi, il est très utile de développer une méthode efficace et facile à utiliser de construction médiée par CRISPR / Cas9 de mutants homozygotes du criquet. Bien que d’excellents travaux aient été rapportés et aient fourni un flux de travail de base pour l’édition du génome chez les criquets 18,20,21,22, une optimisation systématique de l’ensemble de la procédure fait encore défaut. En général, le mutant homozygote généré par injection embryonnaire du système CRISPR/Cas9 peut être divisé en trois étapes principales : a) conception, synthèse et criblage in vitro de l’ARNg, b) collecte, préparation et injection des ovules ; et c) le dépistage des mutants et le maintien des homozygotes. Ce protocole fournit un flux de travail optimisé et les étapes de sélection du site cible, de criblage in vitro de l’ARNg, de micro-injection des œufs ainsi que de détection des mutants sont particulièrement critiques pour générer efficacement des criquets mutants homozygotes avec le système CRISPR / Cas9.
Tout d’abord, le site cible, la forme de l’ARNg correspondant et la concentration d’ARNg ont été suggérés comme les facteurs critiques de l’efficacité de l’édition du génome chez les insectes18,27,28. Pour résoudre ce problème, il est recommandé d’analyser d’abord la structure du gène et de concevoir plus d’un site cible sur l’exon 1 ou près du codon de départ en utilisant les ressources en ligne. Ensuite, synthétisez l’ARNg in vitro et mélangez-le avec la protéine Cas9 à différentes concentrations pour optimiser l’efficacité de coupe de la RNP. Cette procédure permettra d’identifier un sgRNA à haute bioactivité et d’optimiser la composition du complexe RNP pour le gène cible candidat.
Deuxièmement, la collecte d’autant d’œufs frais que possible dans un temps limité et l’amélioration du taux d’éclosion ainsi que du taux de mutation sont également de grands défis pour les opérations d’édition du génome. Les criquets adultes grégaires élevés à la condition de 16 (lumière):8 (foncé) photopériode sont utilisés pour collecter suffisamment d’œufs dans une courte période de 9h00 à 11h00. Il est important d’appliquer doucement une pression vers le bas entre les œufs à l’aide d’un pinceau ou d’une pince à épiler pour isoler soigneusement les œufs de la gousse. Avec suffisamment de pratique, plusieurs utilisateurs peuvent séparer de manière fiable les œufs individuels de la gousse. Une fois chaque ovule isolé et lavé à l’eau stérile, les œufs sont alignés sur les coussinets d’injection conçus (Figure 2B,C) pour stabiliser les œufs pendant la micro-injection. L’œuf est injecté avec le RNP optimisé près des micropyles. Pour limiter les dommages mécaniques et minimiser la pollution des œufs, les œufs frais sont autorisés à rester dans les gousses pendant environ 30 minutes pour s’assurer que le tannage de la coquille d’œuf est idéal pour la micro-injection21, en raison de sa structure condensée et de sa grande capacité de défense en cas d’invasion après un bronzage suffisant29,30. Pendant ce temps, un rapport publié indiquait que la division syncytiale31 des œufs de criquets se produit à un moment donné entre 0 h et 4 h après la ponte. Avec le protocole de micro-injection standard actuel, l’injection d’environ 100 œufs peut être réalisée en 40 minutes. Ensemble, la procédure de tannage et de micro-injection de 100 œufs fécondés peut être complétée en 2 heures. Il reste donc au moins 2 heures pour le clivage médié par CRISRP/Cas9 et la réparation des gènes cibles pour obtenir une mutation efficace dans les œufs injectés et les futurs criquets adultes.
Enfin, des stratégies efficaces de passage et d’identification des mutants sont importantes pour générer des homozygotes chez la plupart des animaux mutants. Chez les criquets, pour les gènes qui ne sont pas létaux après édition, la stratégie croisée suggérée ici est que les mutants G0 croisent avec des criquets de type large et que d’autres croisements peuvent être effectués en utilisant les hétérozygotes G1 avec les mêmes mutations pour générer des mutants homozygotes dans la génération suivante. Pour vérifier la mutation dans chaque criquet au cours du processus d’héritage mutant, il est recommandé d’utiliser la méthode de lyse alcaline pour digérer un court segment d’antennes comme modèle pour le génotypage basé sur la PCR. Enfin, utilisez les adultes homozygotes obtenus pour d’autres croisements afin d’élargir la population. Limités par la taille de la population et les différences de stade de développement entre les criquets homozygotes, les œufs excédentaires sont recommandés pour la cryoconservation à 6 °C et la réanimation par élévation de température de gradient (Figure 5), qui repose sur le principe de la diapause à basse température et de la diapause à haute température des œufs de criquets migrateurs32,33.
En bref, le système CRISPR/Cas9 s’est avéré être un outil fiable pour faciliter l’étude de la génomique fonctionnelle des criquets migrateurs. Ce protocole détaillé peut être utilisé comme référence pour les applications d’édition de gènes basées sur CRISPR / Cas9 chez les criquets migrateurs ainsi que chez d’autres insectes.
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Disclosures
Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32070502, 31601697, 32072419 et la Fondation chinoise des sciences postdoctorales (2020M672205).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×NEBuffer r3.1 | New England Biolabs | B7030S | The buffer of in vitro Cas9 cleavage assays |
| 2xEs Taq MasterMix (Dye) | Cwbio | CW0690 | For gene amplification |
| 2xPfu MasterMix (Dye) | Cwbio | CW0686 | For gene amplification |
| CHOPCHOP | Online website for designing sgRNAs, http://chopchop.cbu.uib.no/. | ||
| CRISPOR | Online website for designing sgRNAs, http://crispor.org. | ||
| CRISPRdirect | Online website for designing sgRNAs, http://crispr.dbcls.jp/. | ||
| Electrophoresis power supply | LIUYI BIOLOGY | DYY-6D | Separation of nucleic acid molecules of different sizes |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 30125177 | For sample collection, etc. |
| Fine brushes | Annigoni | 1235 | For cleaning and isolating eggs. Purchased online. |
| Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | For making the microinjection needles |
| Gel Extraction Kit | Cwbio | CW2302 | DNA recovery and purification |
| Gel Imaging Analysis System | OLYMPUS | Gel Doc XR | Observe the electrophoresis results |
| GeneTouch Plus | Bioer | B-48DA | For gene amplification |
| Glass electrode capillary | Gairdner | GD-102 | For making injection needles with a micropipette Puller |
| Incubator | MEMMERT | INplus55 | For migratory locust embryo culture |
| Metal bath | TIANGEN | AJ-800 | For heating the sample |
| Micro autoinjector | Eppendorf | 5253000068 | Microinjection of embryos early in development |
| Micro centrifuge | Allsheng | MTV-1 | Used for mixing reagents |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | To ground the tip of injection needle |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | For loading solutions into the injection needles. |
| Micromanipulation system | Eppendorf | TransferMan 4r | An altinative manipulation system for microinjection |
| Microscope | cnoptec | SZ780 | For microinjection |
| Motor-drive Manipulator | NARISHIGE | MM-94 | For controling the position of the micropipette during the microinjection precedure |
| Multi-Sample Tissue Grinder | jingxin | Tissuelyser-64 | Grind and homogenize the eggs |
| ovipisition pot | ChangShengYuanYi | CS-11 | Filled with wet sterile sand for locust ovipositing in it. The oocysts are collected from this container. Purchased online. |
| Parafilm | ParafilmM | PM996 | For wrapping the petri dishes. |
| pEASY-T3 Cloning Kit | TransGen Biotech | CT301-01 | For TA cloning |
| Petri dish | NEST | 752001 | For culture and preservation of the eggs. |
| Pipettor | Eppendorf | Research plus | For sample loading |
| plastic culture cup | For rearing locusts seperately and any plastic cup big enough (not less than 1000 mL in volume) will do. Purchased online. | ||
| Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Primer Premier | PREMIER Biosoft | Primer Premier 5.00 | For primer design |
| SnapGene | Insightful Science | SnapGene®4.2.4 | For analyzing sequences |
| Steel balls | HuaXinGangQiu | HXGQ60 | For sample grinding.Purchased online. |
| Tips | bioleaf | D781349 | For sample loading |
| Trans DNA Marker II | TransGen Biotech | BM411-01 | Used to determine gene size |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo | A36496 | Cas9 protein |
| UniversalGen DNA Kit | Cwbio | CWY004 | For genomic DNA extraction |
| VANNAS Scissors | Electron Microscopy Sciences | 72932-01 | For cutting off the antennae |
| Wheat | To generate wheat seedlings as the food for locusts. Bought from local farmers. | ||
| ZiFiT | Online website for designing sgRNAs, http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx. |
References
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