Summary
В этом исследовании представлена систематически оптимизированная процедура построения гомозиготных мутантов саранчи на основе рибонуклеазы CRISPR/Cas9, а также подробный метод криоконсервации и реанимации яиц саранчи.
Abstract
Мигрирующая саранча, Locusta migratoria, является не только одной из мировых чумных саранч, которая нанесла огромные экономические потери людям, но и важной исследовательской моделью метаморфоза насекомых. Система CRISPR/Cas9 может точно определять местоположение в определенном локусе ДНК и расщеплять в пределах целевого участка, эффективно вводя двухцепочечные разрывы, чтобы индуцировать нокаут гена-мишени или интегрировать новые фрагменты генов в конкретный локус. Редактирование генома, опосредованное CRISPR/Cas9, является мощным инструментом для решения вопросов, возникающих в исследованиях саранчи, а также многообещающей технологией борьбы с саранчой. В этом исследовании представлен систематический протокол нокаута генов, опосредованного CRISPR/Cas9, с комплексом белка Cas9 и одиночных направляющих РНК (сгРНК) у мигрирующей саранчи. Подробно описан выбор сайтов-мишеней и дизайн сгРНК с последующим синтезом in vitro и верификацией сгРНК. Последующие процедуры включают сбор яйцеклеток и разделение дубленых яиц для достижения успешной микроинъекции с низким уровнем смертности, культивирование яиц, предварительную оценку частоты мутаций, размножение саранчи, а также обнаружение, сохранение и прохождение мутантов для обеспечения стабильности популяции отредактированной саранчи. Этот метод может быть использован в качестве эталона для приложений редактирования генов на основе CRISPR/Cas9 у мигрирующей саранчи, а также у других насекомых.
Introduction
Технологии редактирования генов могут быть использованы для введения вставок или делеций в определенный локус генома для искусственной модификации гена-мишени с целью1. В последние годы технология CRISPR/Cas9 быстро развивалась и имеет растущую сферу применения в различных областях наук о жизни 2,3,4,5,6. Система CRISPR/Cas9 была открыта еще в 1987 7 году и широко распространена у бактерий и архей. Дальнейшие исследования показали, что это была прокариотическая адаптивная иммунная система, которая зависит от нуклеазы Cas9, управляемой РНК, для борьбы с фагами8. Искусственно модифицированная система CRISPR/Cas9 в основном состоит из двух компонентов: одной направляющей РНК (сгРНК) и белка Cas9. СгРНК состоит из CRISPR РНК (крРНК), комплементарной целевой последовательности, и вспомогательной трансактивирующей крРНК (тракрРНК), которая относительно консервативна. Когда активируется система CRISPR/Cas9, сгРНК образует рибонуклеопротеин (РНП) с белком Cas9 и направляет Cas9 к целевому участку посредством спаривания оснований РНК-ДНК-взаимодействий. Затем двухцепочечная ДНК может быть расщеплена белком Cas9, и в результате двухцепочечный разрыв (DSB) возникает рядом с соседним мотивом протоспейсера (PAM) целевого сайта 9,10,11,12. Чтобы смягчить ущерб, вызванный DSB, клетки активируют комплексные реакции на повреждение ДНК, чтобы эффективно обнаруживать повреждения генома и инициировать процедуру репарации. В клетке существует два различных механизма репарации: негомологичное соединение концов (NHEJ) и гомологически направленная репарация (HDR). NHEJ является наиболее распространенным путем репарации, который может быстро восстанавливать двухцепочечные разрывы ДНК и предотвращает апоптоз клеток. Тем не менее, он подвержен ошибкам из-за того, что оставляет небольшие фрагменты вставок и делеций (инделов) рядом с DSB, что обычно приводит к сдвигу открытой рамки считывания и, таким образом, может привести к нокауту гена. Напротив, гомологичное восстановление является довольно редким событием. При условии, что существует шаблон репарации с последовательностями, гомологичными контексту DSB, клетки иногда восстанавливают геномный разрыв в соответствии с соседним шаблоном. Результатом HDR является то, что DSB точно ремонтируется. В частности, если между гомологичными последовательностями в матрице есть дополнительная последовательность, они будут интегрированы в геном через HDR, и, таким образом, могут быть реализованы специфические вставки генов13.
С оптимизацией и развитием структур sgRNA и вариантов белка Cas9 система генетического редактирования на основе CRISPR/Cas9 также успешно применяется в исследованиях насекомых, включая, помимо прочего, Drosophila melanogaster, Aedes aegypti, Bombyx mori, Helicoverpa Armigera, Plutella xylostella и Locusta migratoria 14,15,16,17,18 ,19. Насколько известно авторам, хотя РНП, состоящие из белка Cas9 и транскрибируемой sgRNA in vitro, использовались для редактирования генома саранчи20,21,22, систематический и подробный протокол для опосредованного рибонуклеазой CRISPR/Cas9 строительства гомозиготных мутантов мигрирующей саранчи все еще отсутствует.
Мигрирующая саранча является важным сельскохозяйственным вредителем, который имеет глобальное распространение и представляет существенную угрозу для производства продуктов питания, будучи особенно вредным для злаковых растений, таких как пшеница, кукуруза, рис и просо23. Анализ функций генов, основанный на технологиях редактирования генома, может обеспечить новые цели и новые стратегии борьбы с мигрирующей саранчой. В этом исследовании предлагается подробный метод нокаутирования мигрирующих генов саранчи с помощью системы CRISPR/Cas9, включая выбор целевых участков и дизайн сгРНК, синтез in vitro и верификацию сгРНК, микроинъекцию и культурирование яйцеклеток, оценку частоты мутаций на эмбриональной стадии, обнаружение мутантов, а также прохождение и сохранение мутантов. Этот протокол может быть использован в качестве базального эталона для манипулирования подавляющим большинством генов саранчи и может предоставить ценные ссылки для редактирования генома других насекомых.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Выбор целевого сайта и дизайн sgRNA
- Соберите как можно больше информации о последовательности интересующего гена с помощью литературных исследований и/или поиска мРНК или кодирующей последовательности ДНК (CDS) гена в NCBI и базе данных саранчи24.
- Сравните последовательность интересующего гена с его геномной последовательностью ДНК, чтобы различить экзонную и интронную области.
- Выберите регион-кандидат для разработки целевого сайта в зависимости от цели исследования. Разработайте пары праймеров для амплификации фрагмента области-кандидата и проверки его последовательности дикого типа путем анализа секвенирования продукта ПЦР.
ПРИМЕЧАНИЕ: Существуют различные стратегии выбора целевого региона-кандидата. Например, в большинстве исследований функции гена/белка используйте фрагмент экзона, близкий к его начальному кодону, в качестве области-кандидата, чтобы гарантировать, что вся функция белка/РНК будет потеряна после редактирования генома (т.е. нокаута гена). В то время как для анализа функций определенного домена выберите область-кандидат в начале (или обоих концах) домена. - Используйте онлайн-ресурсы, такие как E-CRISPDesign 25 , для поиска потенциальных целевых сайтов в целевом регионе-кандидате.
- Выберите «Drosophila melanogaster BDGP6» (или любое другое насекомое) в выпадающем списке эталонных геномов и выберите «Входными данными является последовательность FASTA», а затем вставьте последовательность целевой области в текстовое поле (в формате FASTA).
- Запустите приложение, нажав «Начать поиск sgRNA» со «средним» и «единым дизайном», чтобы получить возможные целевые сайты. Выберите 1-3 потенциальные мишени из результатов на основе их прогнозируемых оценок и соответствующим образом разработайте соответствующие сгРНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Существует множество других онлайн-платформ для разработки CRISPR, таких как CRISPOR, CHOPCHOP, CRISPRdirect, ZiFiT и так далее (см. Таблицу материалов). Некоторые из них имеют функцию проверки специфичности видов, данные геномных последовательностей которых находятся в их базах данных. Однако геномная последовательность саранчи не была найдена ни на одном онлайн-сайте. Лучше использовать более одного онлайн-инструмента для CRISPR-дизайна у саранчи. Всесторонне рассмотрите результаты с разных веб-сайтов и выберите sgRNA из результатов по принципу наибольшей специфичности, наибольшей эффективности и наименьшей частоты несоответствия (рис. 1A, B).
2. Синтез и верификация сгРНК in vitro
- Синтезируйте сгРНК с помощью наборов для синтеза сгРНК в соответствии с руководством производителя (Таблица материалов). Эта процедура обычно включает три этапа: амплификацию матрицы ДНК, транскрипцию in vitro и очистку sgRNA21. Разбавьте синтезированную сгРНК водой, не содержащей нуклеаз, до концентрации хранения 300 нг/мкл для дальнейшего использования.
- Амплифицировать и очищать фрагмент гена-мишени, чтобы он служил субстратом для анализа расщепления in vitro системы CRISPR/Cas9. Выполните эти действия, следуя инструкциям производителя.
- Разбавьте купленный белок Cas9 до 300 нг/мкл безнуклеазной водой. Инкубируют 1 мкл сгРНК (300 нг/мкл) и 1 мкл белка Cas9 (300 нг/мкл) с 200 нг очищенного фрагмента-мишени в буфере для расщепления при 37 °C в течение 1 ч (10 мкл общего объема; см. Таблицу 1). Оцените эффективность индуцированного сгРНК расщепления Cas9 методом электрофореза в агарозном геле (рис. 1C). Выберите сгРНК с высокой активностью для следующей микроинъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты электрофореза в агарозном геле могут быть преобразованы в изображения в оттенках серого с помощью программного обеспечения для обработки изображений, а эффективность спайности оценивается в соответствии с оттенками серого полос предполагаемых размеров.
3. Микроинъекция и культивирование яйцеклеток
- Подготовьте инъекционные иглы, вытягивая стеклянные капилляры с помощью съемника микропипеток (Таблица материалов). Установите параметры следующим образом: Нагрев на 588, Тяга на 90, Скорость на 60 и Время на 40. Отшлифуйте кончик инъекционной иглы с помощью микрошлифовальной машины (Таблица материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальные кончики игл должны быть открытыми и с острыми краями (рис. 2A). Настоятельно рекомендуется подготовить дополнительные иглы для экспериментов, потому что иглы иногда блокируются или случайно ломаются во время инъекций. - Смешайте 1 мкл белка Cas9 (300 нг/мкл) с 1 мкл проверенной сгРНК (300 нг/мкл) вместе, чтобы получить RNP для инъекции. Добавьте 8 мкл стерильной воды без РНКазы, чтобы конечный объем смеси составил 10 мкл. Тщательно перемешайте раствор и держите его на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конечные концентрации белка Cas9 и сгРНК могут быть оптимизированы в соответствии с результатами редактирования. Избегайте повторного замораживания и оттаивания приготовленного раствора RNP и рекомендуется немедленное использование. - Выращивайте самцов и самок взрослой саранчи вместе при температуре 30 ° C с фотопериодом 16 (светлый):8 (темный) и поставьте им достаточное количество свежих проростков пшеницы в качестве пищи. Ежедневно наблюдайте за этой саранчой и поставьте горшок для яйцекладки (пластиковый цветочный горшок или чашку, наполненную влажным стерильным песком) в клетку для выращивания для яйцекладки после спаривания саранчи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно 100 пар взрослой саранчи, выращенных в клетке для выращивания (40 см х 40 см х 40 см), достаточно для получения яиц для выбивания одного гена. Культивируйте дополнительные пары саранчи, если требуется больше яиц. - Соберите свежеотложенные яичные стручки из горшка для яйцекладки и подождите около 30 минут, пока яйца не подгорят. Аккуратно изолируйте яйца от стручков в воде с помощью тонкой щетки и трижды промойте их стерильной водой. Храните яйца в чашке Петри и добавьте стерильную воду, чтобы они оставались влажными.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дубление недавно отложенных яиц может значительно повысить эффективность мутантов21. - Наполните инъекционную иглу приготовленным раствором РНП и загрузите его в микроманипулятор (Таблица материалов).
- Установите параметры микровпрыска следующим образом: 300 гПа давления впрыска (pi), 0,5 с времени впрыска (ti) и 25 гПа компенсационного давления (pc).
- Нажмите на педаль, чтобы оценить объем вводимого раствора. Отрегулируйте давление впрыска и время впрыска, чтобы объем впрыска составлял около 50-100 нл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выпустите остаточный воздух из иглы, чтобы сделать раствор для инъекций непрерывным и максимально контролируемым. Соединение иглы и микроманипулятора должно быть плотным.
- Регулярно размещайте стерильные яйца на инъекционной подушечке (рис. 2B, C) и поместите прокладку на предметный стол микроскопа (рис. 3A). Регулируйте увеличение микроскопа до тех пор, пока яйца не будут наблюдаться. Отрегулируйте иглу для микроинъекций под микроскопом до тех пор, пока не станет виден наконечник инъекции, и расположите его рядом с вводимой яйцеклеткой.
- Начинайте инъекцию на подходящей высоте и под углом 30-45 градусов. Осторожно вставьте наконечник в яйцо рядом с микропилами яйца (рис. 3B) и нажмите педаль, чтобы выполнить инъекцию. Быстро втяните иглу и переместите инъекционную подушечку для инъекции следующего яйца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следует наблюдать небольшое расширение яйцеклетки во время микроинъекции. Допустима небольшая цитоплазматическая утечка в точечном отверстии. Замените инъекционную иглу на новую или отрегулируйте угол впрыска, если отток жидкости слишком велик. - Перенесите введенные яйца в культуральную чашку (чашку Петри с куском влажной фильтровальной бумаги) и поместите их в инкубатор при температуре 30 ° C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Потребуется около 13-14 дней, прежде чем нимфы вылупятся из этих инъецированных яиц (при условии, что мутация гена-мишени не влияет на развитие эмбрионов) (рис. 3C). Введите не менее 100 яиц, чтобы обеспечить достаточное количество вылупления и экклозии для выбивания определенного гена.
4. Оценка частоты мутаций и скрининг мутантов
- Проверяйте развитие введенных яйцеклеток каждый день после инъекции. Переносите введенные яйца в новую культуральную чашку каждые 24 часа в течение первых 5 дней.
- На6-й день (или позже) после инъекции случайным образом соберите и перенесите 10 яиц в пробирку и адекватно измельчите яйца двумя стальными шариками с частотой 60 Гц в течение 6 мин с помощью кофемолки (см. Таблицу материалов). Ресуспендируйте обломки с 1 мл PBS. Переведите 5 мкл смеси в 45 мкл 50 мМ NaOH и лизируйте при 95 °C в течение 5 мин. Добавьте 5 мкл 1 М трис-HCl (рН = 8,0) в систему лизиса, чтобы прекратить щелочную реакцию лизиса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца могут быть отобраны для щелочного лизиса в любой день после последнего переноса, и несколько яйцеклеток могут быть использованы в качестве одного образца в зависимости от их ситуации развития (например, пять 6-дневных эмбрионов могут быть использованы в качестве одного образца, а два 10-дневных эмбриона могут быть использованы в качестве одного образца). Иногда невозможно получить геномную ДНК яйцеклеток с помощью метода щелочного лизиса. Коммерческие наборы для выделения геномной ДНК могут быть использованы в качестве альтернативного метода выделения геномной ДНК из яйцеклеток. - Возьмите 1 мкл продукта лизиса в качестве шаблона ПЦР для амплификации фрагмента гена-мишени (Таблица 2 и Таблица 3) и отправьте продукты ПЦР на секвенирование. Сравните результаты секвенирования с последовательностью дикого типа, чтобы предварительно оценить, расщепляет ли система CRISPR/Cas9 ген-мишень in vivo (рис. 4A). Допускают остальные яйцеклетки для последующего развития при условии, что инделы будут обнаружены на эмбриональной стадии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Таким образом, скорость мутации может быть предварительно оценена на стадии эмбриона. Если на этом этапе не обнаружено никаких инделов, подготовьте несколько новых сгРНК для гена-мишени и повторите протокол нокаута, начиная с шага 2.1. - Перенесите вылупившихся нимф в клетку для выращивания и культивируйте их, как описано в шаге 3.3. Когда нимфы разовьются до пятой возрастной стадии, разделите их пластиковыми культуральными стаканчиками (1 нимфа / чашка).
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно нимфам требуется около 25-35 дней, чтобы развиться до пятого возраста, и наиболее очевидным фенотипом является то, что зачатки крыльев простираются до четвертого или пятого сегментов брюшка. Кроме того, рекомендуется записывать фенотипы погибших нимф для прогнозирования взаимосвязи между геном-мишенью и фенотипами в дальнейших исследованиях. - Отрежьте ножницами рассекающие усики длиной около 2 мм и лизируйте их методом щелочного лизиса (шаг 4.2). Проанализируйте последовательность фрагментов генов-мишеней этих нимф, как описано выше (шаг 4.3), чтобы идентифицировать мутанты G0 (рис. 4B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Усики, вырезанные для лизиса, могут быть немного длиннее, и измельчение или измельчение усиков полезно для лизиса, хотя усики могут быть непосредственно переварены. Особи с несколькими пиками вблизи целевого участка в результате секвенирования идентифицируются как положительные мутанты и допускаются к последующему развитию и спариванию.
5. Создание и прохождение мутантных линий
- Проведите скрещивание с использованием мутантов G0 и дикой саранчи (рис. 4B). Соберите ооцисты и инкубируйте эти ооцисты отдельно при 30 ° C. Используйте 3-6 развитых яйцеклеток в каждой ооцисте для обнаружения мутаций, как описано в шагах 4.2 и 4.3. Сохраняйте мутационно-положительные ооцисты для последующего развития и откажитесь от мутационно-отрицательных ооцист.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка частоты мутаций на эмбриональной стадии может значительно ускорить скрининг мутантов G1 . Обычно 3-6 развившихся яйцеклеток можно смешать в один образец для ПЦР-опосредованного генотипирования, как описано выше. - Поднимите нимфы G1 , как описано в шаге 4.4. Отрежьте около 2 мм длины усиков для выполнения генотипирования на основе ПЦР, как описано на шаге 4.5 для обнаружения гетерозигот G1 . Выполняйте TA-клонирование в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов) для выявления их мутаций. Выполните скрещивание с использованием гетерозигот G1 с одинаковыми мутациями для получения нимф G2 .
ПРИМЕЧАНИЕ: Секвенирование продуктов ПЦР по Сэнгеру может предоставить информацию только для обнаружения гетерозигот, но недостаточно информации для идентификации точных мутаций. Таким образом, клонирование ТА с использованием продуктов ПЦР необходимо для четкой идентификации мутаций и может способствовать созданию стабильных мутантных линий. - Поднимите нимф G2 до их пятого возраста. Используйте генотипирование на основе ПЦР, описанное на шаге 5.2, для идентификации гомозигот и/или гетерозигот, которые подходят для дальнейших исследований и стабильного пассажа (рис. 4B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание, чтобы избежать смешивания гомозигот и гетерозигот. Рекомендуется проводить генотипирование на основе ПЦР в каждом поколении для подтверждения гомозиготности и/или гетерозиготности каждой популяции. Количество саранчи, используемой для этой проверки, зависит от численности популяции. Кроме того, популяция саранчи может быть расширена с помощью стратегии in-cross.
6. Криоконсервация и реанимация яйцеклеток
- Яйца, подлежащие криоконсервированию, вымойте стерильной водой и инкубируйте их в посуде для культивирования, как описано выше (шаг 3.8), в течение 5-6 дней. Соберите эти яйца вместе в посуду для культуры и накройте их фрагментами фильтровальной бумаги. Оберните всю культуральную посуду парафиновой пленкой.
- Храните блюдо при температуре 25 ° C в течение 2 дней, а затем еще 2 дня при относительно более низкой температуре (13-16 ° C). Затем переложите блюдо в холодильник с температурой 6 °C. Добавляйте в него воду каждые 2 недели, чтобы обеспечить влажную среду для яиц (рис. 5А).
ПРИМЕЧАНИЕ: Предполагается, что эмбрионы находятся на стадии кататрепсиса после развития в течение 5-6 дней при 30 ° C26. Градиентное охлаждение полезно для криоконсервации яиц (табл. 5). - Для реанимации криоконсервированных яиц достаньте чашку Петри из холодильника и выдержите ее при температуре 25 °C в течение 2 дней. Поместите эти яйца в инкубатор с температурой 30 °C до тех пор, пока нимфы не вылупятся (рис. 5B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед переносом в инкубатор с температурой 30 °C необходимо поместить криоконсервированные яйца при температуре 25 °C. Эмбрионы могут быть криоконсервированы в течение как минимум пяти месяцев, хотя скорость вылупления и скорость экклозии могут снижаться из-за криоконсервации (таблица 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол содержит подробные этапы получения гомозиготных мутантов мигрирующей саранчи с РНП, состоящим из белка Cas9 и синтезированной in vitro сгРНК. Ниже приведены некоторые репрезентативные результаты нокаута гена-мишени, опосредованного CRISPR/Cas9, у саранчи, включая отбор мишеней, синтез и верификацию сгРНК (рис. 1A), сбор и инъекцию яйцеклеток, мутантный скрининг и пассажирование, криоконсервацию и реанимацию гомозиготных яиц.
В этом исследовании целевой сайт для системы CRISPR/Cas9 выбирается по результатам трех онлайн-программ (E-CRISP, CRISPOR и ZiFit) и располагается в первом экзоне (рис. 1B). Согласно анализу расщепления Cas9 in vitro (таблица 1), CRISPR/Cas9 RNP может переваривать фрагмент ПЦР (содержащий целевой сайт) со скоростью расщепления около 55% (рис. 1C). Затем этот RNP был микроинъекционно введен в 120 оплодотворенных яйцеклеток на их одноклеточной стадии с использованием стандартной системы микроинъекций (рис. 2 и рис. 3). Результаты секвенирования для оценки частоты мутаций на эмбриональной стадии показали эффективное редактирование генома на целевом участке (рис. 4A). Кроме того, это исследование привело к тому, что частота вылупления нимф составила 52,73%, а 66,7% взрослых особей G0 были мозаичными мутантами (таблица 4).
Кроме того, химеры G0 скрещивали с саранчой дикого типа для получения гетерозиготных особей G 1, а гетерозиготы G1 с теми же мутациями (проверенными с помощью TA-клонирования) скрещивали с образованием животных G2. Для выявления мутантов использовали фенотипирование на основе ПЦР, а полученные гомозиготы скрещивали для создания стабильных мутантных линий (рис. 4B).
Между тем, избыток гомозиготных яиц был криоконсервирован для улучшения коэффициента использования гомозигот. Несмотря на то, что скорость вылупления криоконсервированных яиц была снижена с увеличением времени криоконсервации (таблица 5), корректирующие действия, включая применение фрагментов фильтровальной бумаги для сохранения яиц влажными и извлечение этих консервированных яиц с градиентом повышения температуры, были полезны для реанимации (рис. 5 и табл. 5). Наконец, гомозиготная популяция мутантов была успешно сохранена для последующих исследований.
Рисунок 1: Дизайн мишени и верификация sgRNA in vitro . (A) Блок-схема для выбора мишеней, синтеза сгРНК и проверки биологической активности in vitro (включая, помимо прочего, саранчу). (B) Принципиальная схема структуры гена и целевого сайта. Экзоны этого гена-мишени показаны в виде синих доменов, а целевой сайт был выбран ниже по течению от стартового кодона в экзоне 1. Целевая последовательность выделена красным цветом. (C) Электрофорез в агарозном геле в результате анализа расщепления Cas9 in vitro . Фрагмент ДНК, содержащий целевую последовательность (длиной около 400.н.), амплифицировали и использовали в качестве субстрата для расщепления Cas9. Ожидаемые небольшие полосы (около 100.н. и 300.н. здесь; отмечены красными треугольниками) предполагали, что синтезированная сгРНК может индуцировать эффективное расщепление Cas9. Коэффициент расщепления составил около 55% в соответствии с анализом оттенков серого. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Подготовка иглы и подушечка для микроинъекций яиц саранчи. (A) Кончик подготовленной иглы для микроинъекции яиц саранчи. Масштабная линейка: 1 мм. (B) Изображение микроинъекционной подушечки с расположенными на ней яйцами (обозначены красным треугольником). Масштабная линейка представляет собой 1 см. (C) Размер микроинъекционной подушечки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Микроинъекции яйцеклеток. (A) Репрезентативная система микроинъекций, помеченная красными рамками, обозначающими микроскоп (посередине) и микроманипулятор (справа), подключенный к микроинжектору (слева). Компьютер используется для хранения данных и для обеспечения вспомогательного наблюдения. (B) Инъекция яйца саранчи. Место инъекции отмечено красным треугольником. (C) Вылупившаяся нимфа под микроскопом. Масштабные линейки представляют собой 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Результаты секвенирования животных G 0 и стратегия пассажа мутантных линий. (A) Типичные результаты секвенирования при скрининге G0. Множественные пики вблизи целевого участка (отмеченные красным прямоугольником в последовательности дикого типа) указывали на то, что испытуемое яйцо/саранча была успешно отредактирована системой CRISPR/Cas9 (как показано в G 0-1 и G0-2), в то время как особь без каких-либо изменений в результате секвенирования считалась не отредактированной и оставленной (например, G0-3). (Б) Стратегия пассажа мутантных линий. Животные G0 были сначала проверены с помощью ПЦР-опосредованного генотипирования, а животные с несколькими пиками в результатах секвенирования были скрещены с саранчой дикого типа для получения животных G1. Для идентификации гетерозиготG1 использовали ПЦР-опосредованное генотипирование и клонирование ТА. Затем гетерозиготы с одинаковыми мутациями скрещивали с образованием животных G2 (гомозиготы и гетерозиготы) для дальнейших исследований и прохождения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Криоконсервация и реанимация яиц. (A) Процедура криоконсервации: Изолируйте яйца от яичных стручков и инкубируйте их при 30 ° C в течение 5-6 дней после промывания стерильной водой. Затем соберите развитые яйца вместе в чашку Петри и накройте их небольшими обрывками влажной фильтровальной бумаги. Оберните всю чашку Петри парафиновой пленкой и держите ее при температуре 25 ° C в течение 2 дней, а затем еще 2 дня при относительно более низкой температуре (например, 13-16 ° C). Наконец, охладите его при температуре 6 ° C. (B) Процедура реанимации: Достаньте чашки Петри с криоконсервированными яйцами из холодильника и держите их при температуре 25 ° C в течение 2 дней после удаления обрезков фильтровальной бумаги. Затем яйца можно культивировать для последующего развития при 30 ° C до тех пор, пока нимфы не вылупятся. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Реагент | Объем (мкл) |
| Белок Cas9 (300 нг/мкл) | 1 |
| сгРНК (300 нг/мкл) | 1 |
| Продукт ПЦР (200 нг/мкл) | 1 |
| 10×NEBuffer r3.1 | 1 |
| Вода, не содержащая нуклеаз | 6 |
Таблица 1: Система пищеварения in vitro . 200 нг очищенного фрагмента-мишени (продукта ПЦР) смешивали с системой CRISPR/Cas9 (по 300 нг каждого компонента) для проверки биологической активности синтезированных сгРНК. Использовали коммерческий буфер и добавляли воду без нуклеазы, чтобы составить общий объем до 10 мкл.
| Реагент | Объем (мкл) |
| 2xEs Taq MasterMix | 12.5 |
| Передний праймер | 0.5 |
| Обратная грунтовка | 0.5 |
| Шаблон (продукт лизиса) | 1 |
| Вода, не содержащая нуклеаз | 10.5 |
Таблица 2: ПЦР-система для амплификации фрагментов генов-мишеней. Для амплификации геномного фрагмента гена-мишени использовали коммерческую смесь Taq и добавляли праймеры в соответствии с инструкциями производителя. В качестве матрицы использовали 1 мкл продукта лизиса, а воду без нуклеаз использовали для доведения общего объема до 25 мкл.
| Температура (°C) | Время | Циклов |
| 95 | 5 мин | 1 |
| 95 | 30 с | 35 |
| 55 | 30 с | |
| 72 | 40 с | |
| 72 | 10 мин | 1 |
Таблица 3: Программа ПЦР для амплификации генов-мишеней. Программа ПЦР для амплификации генов-мишеней составила: 95 °C в течение 5 мин; 35 циклов 95 °C в течение 30 с, 55 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 40 с; 72 °C в течение 10 мин.
| Элементы | Данные |
| Количество инъецированных яйцеклеток | 120 |
| Тестируемые эмбрионы | 10 |
| Количество вылупившихся нимф | 58 |
| Скорость вылупления | 52.73% |
| Количество G0 взрослый | 12 |
| Количество мутантов G0 | 8 |
| Эффективность мутаций у взрослых с G0 | 66.67% |
Таблица 4: Краткая информация об эффективности редактирования. 120 яйцеклеток были введены, чтобы выбить ген-мишень, и 10 яйцеклеток были взяты для тестирования на стадии эмбриона. Из остальных эмбрионов вылупилось 58 нимф (процент вылупления составил 52,73%). Наконец, 12 саранчовых G0 развились до взрослой стадии, и 8 из них были успешно отредактированы на целевом участке. Частота мутаций у взрослых с G0 составила 66,67%.
| Контрольная группа | Группа 1 | Группа 2 | Группа 3 | Группа 4 | |
| Количество яиц | 120 | 120 | 120 | 120 | 120 |
| Температурная обработка при хранении | 30 °С | 30°C (5-6 d)→6 °C | 30°C (5-6 дней)→25°C (2 дня)→13-16°C (2 дня)→6 °C | 30°C (5-6 дней)→25°C (2 дня)→13-16°C (2 дня)→6 °C | 30°C (5-6 дней)→25°C (2 дня)→13-16°C (2 дня)→6 °C |
| Время хранения | 14 дней | 14 дней | 1 месяц | 3 месяца | 5 месяцев |
| Температурная обработка для реанимации | 30 °С | 6°C→30 °C | 6°C→25°C (2 d)→30 °C | 6°C→25°C (2 d)→30 °C | 6°C→25°C (2 d)→30 °C |
| Количество вылупившейся саранчи | 108 | 0 | 96 | 86 | 78 |
| Скорость вылупления | 90.00% | 0 | 80.00% | 71.67% | 65.00% |
| Количество взрослой саранчи | 81 | 0 | 60 | 46 | 31 |
| Скорость экзозии | 75.00% | 0 | 62.50% | 53.49% | 39.74% |
Таблица 5: Резюме криоконсервации и реанимации яйцеклеток. 600 яйцеклеток были разделены на пять групп для криоконсервации и реанимационного исследования. Первую группу (контрольную) из 120 яиц всегда инкубировали при 30 °C и хранили в течение 14 дней. Вторую группу (1-я группа) из 120 яиц после инкубации при 30 °С в течение 5-6 дней переводили в холодильник и хранили при 6 °С в течение 14 дней. Затем эти яйца были перенесены в 30 ° C для реанимации. В других группах (группа 2, группа 3 и группа 4, каждая группа содержала 120 яиц) подвергались градиентному охлаждению и восстановительной температурной обработке, как описано в протоколе (этапы 6.1-6.3) с различным временем хранения (1 месяц для группы 2, 3 месяца для группы 3 и 5 месяцев для группы 4). Наконец, 108 нимф вылупились из контрольной группы (при скорости вылупления 90%), и 81 из них развилась до взрослой стадии (75% от скорости экклозии). Во второй группе (1-я группа) саранча не вылуплялась. Скорость вылупления и скорость экзозии в других группах были ниже по сравнению с контрольной группой и снижались со временем хранения. 96 нимф вылупились во 2-й группе, и 60 из них развились до взрослой стадии. 86 нимф вылупились в группе 3, и 46 из них развились до взрослой стадии. В группе 4 вылупилось 78 нимф, и 31 из них развилась до взрослой стадии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Саранча была одним из самых разрушительных вредителей для сельского хозяйства со времен цивилизации людей23. Технология редактирования генома на основе CRISPR/Cas9 является мощным инструментом для обеспечения лучшего знания биологических механизмов саранчи, а также многообещающей стратегией борьбы с вредителями. Таким образом, большую пользу представляет разработка эффективного и простого в использовании метода CRISPR/Cas9-опосредованного построения гомозиготных мутантов саранчи. Несмотря на то, что было сообщено о некоторых замечательных работах, которые обеспечили некоторый базовый рабочий процесс для редактирования генома саранчи 18,20,21,22, систематическая оптимизация всей процедуры все еще отсутствует. В целом, гомозиготный мутант саранчи, полученный при эмбриональной инъекции системы CRISPR/Cas9, можно разделить на три основных этапа: а) дизайн, синтез и скрининг sgRNA in vitro, б) сбор, подготовка и инъекция яйцеклеток; и в) скрининг мутантов и поддержание гомозигот. Этот протокол обеспечивает оптимизированный рабочий процесс, и этапы выбора целевого сайта, скрининга сгРНК in vitro, микроинъекции яйцеклеток, а также обнаружения мутантов особенно важны для эффективного создания гомозиготной мутантной саранчи с помощью системы CRISPR/Cas9.
Во-первых, сайт-мишень, форма соответствующей сгРНК и концентрация сгРНК были предложены в качестве критических факторов эффективности редактирования генома у насекомых18,27,28. Чтобы решить эту проблему, рекомендуется сначала проанализировать структуру гена и спроектировать более одного целевого участка на экзоне 1 или рядом со стартовым кодоном с помощью онлайн-ресурсов. Затем синтезируйте sgRNA in vitro и смешайте ее с белком Cas9 в разных концентрациях, чтобы оптимизировать эффективность резки RNP. Эта процедура поможет идентифицировать сгРНК с высокой биологической активностью и оптимизировать состав комплекса RNP для гена-мишени-кандидата.
Во-вторых, сбор как можно большего количества свежих яиц за ограниченное время и повышение скорости вылупления, а также частоты мутаций также являются большими проблемами для операций по редактированию генома. Стадные взрослые особи саранчи, выращенные в условиях фотопериода 16 (свет):8 (темно), используются для сбора достаточного количества яиц за короткий период с 9:00 до 11:00. Важно аккуратно надавить вниз между яйцами с помощью кисти или пинцета, чтобы аккуратно изолировать яйца от стручка. При достаточной практике несколько пользователей могут надежно отделить отдельные яйца от стручка. После того, как каждое яйцо изолируют и промывают стерильной водой, яйца выравнивают на разработанных инъекционных подушечках (рис. 2B, C) для стабилизации яиц во время микроинъекции. Яйцеклетка вводится с оптимизированным RNP рядом с микропилами. Чтобы ограничить механические повреждения и свести к минимуму загрязнение яиц, свежие яйца оставляют в стручках около 30 минут, чтобы убедиться, что дубление яичной скорлупы идеально подходит для микроинъекций21 из-за ее конденсированной структуры и высокой защитной способности при вторжении после достаточного загара29,30. Между тем, в опубликованном отчете указано, что синцитиальное деление31 яиц саранчи происходит в какой-то момент между 0 и 4 часами после кладки. При действующем стандартном протоколе микроинъекций инъекция около 100 яйцеклеток может быть выполнена в течение 40 минут. Взятые вместе, процедура загара и микроинъекции 100 оплодотворенных яйцеклеток может быть завершена в течение 2 часов. Таким образом, остается не менее 2 ч для опосредованного CRISRP/Cas9 расщепления и репарации генов-мишеней для достижения эффективной мутации в инъецированных яйцеклетках и будущих взрослых особях саранчи.
Наконец, эффективные стратегии пассажа и идентификации мутантов важны для создания гомозигот у большинства мутантных животных. У саранчи для генов, которые являются нелетальными после редактирования, предложенная здесь стратегия скрещивания заключается в том, что мутанты G0 скрещиваются с саранчой широкого типа, а дальнейшие скрещивания могут быть выполнены с использованием гетерозигот G1 с теми же мутациями для получения гомозиготных мутантов в следующем поколении. Чтобы проверить мутацию в каждой саранче во время процесса наследования мутантов, рекомендуется использовать метод щелочного лизиса для переваривания короткого сегмента усиков в качестве шаблона для генотипирования на основе ПЦР. Наконец, используйте полученные гомозиготные взрослые особи для дальнейшего скрещивания, чтобы расширить популяцию. Ограниченные размерами популяции и различиями в стадиях развития гомозиготной саранчи, избыточные яйца рекомендованы для криоконсервации при 6 °С и реанимации путем градиентного повышения температуры (рис. 5), что основано на принципе низкотемпературной диапаузы и высокотемпературной диапаузы высвобождения яиц мигрирующей саранчи32,33.
Короче говоря, было доказано, что система CRISPR/Cas9 является надежным инструментом для облегчения изучения функциональной геномики мигрирующей саранчи. Этот подробный протокол может быть использован в качестве справочного материала для приложений редактирования генов на основе CRISPR/Cas9 у мигрирующей саранчи, а также у других насекомых.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (32070502, 31601697, 32072419 и Китайским фондом постдокторантуры (2020M672205).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×NEBuffer r3.1 | New England Biolabs | B7030S | The buffer of in vitro Cas9 cleavage assays |
| 2xEs Taq MasterMix (Dye) | Cwbio | CW0690 | For gene amplification |
| 2xPfu MasterMix (Dye) | Cwbio | CW0686 | For gene amplification |
| CHOPCHOP | Online website for designing sgRNAs, http://chopchop.cbu.uib.no/. | ||
| CRISPOR | Online website for designing sgRNAs, http://crispor.org. | ||
| CRISPRdirect | Online website for designing sgRNAs, http://crispr.dbcls.jp/. | ||
| Electrophoresis power supply | LIUYI BIOLOGY | DYY-6D | Separation of nucleic acid molecules of different sizes |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 30125177 | For sample collection, etc. |
| Fine brushes | Annigoni | 1235 | For cleaning and isolating eggs. Purchased online. |
| Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | For making the microinjection needles |
| Gel Extraction Kit | Cwbio | CW2302 | DNA recovery and purification |
| Gel Imaging Analysis System | OLYMPUS | Gel Doc XR | Observe the electrophoresis results |
| GeneTouch Plus | Bioer | B-48DA | For gene amplification |
| Glass electrode capillary | Gairdner | GD-102 | For making injection needles with a micropipette Puller |
| Incubator | MEMMERT | INplus55 | For migratory locust embryo culture |
| Metal bath | TIANGEN | AJ-800 | For heating the sample |
| Micro autoinjector | Eppendorf | 5253000068 | Microinjection of embryos early in development |
| Micro centrifuge | Allsheng | MTV-1 | Used for mixing reagents |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | To ground the tip of injection needle |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | For loading solutions into the injection needles. |
| Micromanipulation system | Eppendorf | TransferMan 4r | An altinative manipulation system for microinjection |
| Microscope | cnoptec | SZ780 | For microinjection |
| Motor-drive Manipulator | NARISHIGE | MM-94 | For controling the position of the micropipette during the microinjection precedure |
| Multi-Sample Tissue Grinder | jingxin | Tissuelyser-64 | Grind and homogenize the eggs |
| ovipisition pot | ChangShengYuanYi | CS-11 | Filled with wet sterile sand for locust ovipositing in it. The oocysts are collected from this container. Purchased online. |
| Parafilm | ParafilmM | PM996 | For wrapping the petri dishes. |
| pEASY-T3 Cloning Kit | TransGen Biotech | CT301-01 | For TA cloning |
| Petri dish | NEST | 752001 | For culture and preservation of the eggs. |
| Pipettor | Eppendorf | Research plus | For sample loading |
| plastic culture cup | For rearing locusts seperately and any plastic cup big enough (not less than 1000 mL in volume) will do. Purchased online. | ||
| Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Primer Premier | PREMIER Biosoft | Primer Premier 5.00 | For primer design |
| SnapGene | Insightful Science | SnapGene®4.2.4 | For analyzing sequences |
| Steel balls | HuaXinGangQiu | HXGQ60 | For sample grinding.Purchased online. |
| Tips | bioleaf | D781349 | For sample loading |
| Trans DNA Marker II | TransGen Biotech | BM411-01 | Used to determine gene size |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo | A36496 | Cas9 protein |
| UniversalGen DNA Kit | Cwbio | CWY004 | For genomic DNA extraction |
| VANNAS Scissors | Electron Microscopy Sciences | 72932-01 | For cutting off the antennae |
| Wheat | To generate wheat seedlings as the food for locusts. Bought from local farmers. | ||
| ZiFiT | Online website for designing sgRNAs, http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx. |
References
- Doudna, J. A. The promise and challenge of therapeutic genome editing. Nature. 578 (7794), 229-236 (2020).
- van Haasteren, J., Li, J., Scheideler, O. J., Murthy, N., Schaffer, D. V. The delivery challenge: fulfilling the promise of therapeutic genome editing. Nature Biotechnology. 38 (7), 845-855 (2020).
- McCarty, N. S., Graham, A. E., Studena, L., Ledesma-Amaro, R. Multiplexed CRISPR technologies for gene editing and transcriptional regulation. Nature Communications. 11 (1), 1281 (2020).
- Manghwar, H., et al. CRISPR/Cas systems in genome editing: Methodologies and tools for sgRNA design, off-target evaluation, and strategies to mitigate off-target effects. Advanced Science. 7 (6), 1902312 (2020).
- Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).
- Rees, H. A., Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).
- Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M., Nakata, A. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriology. 169 (12), 5429-5433 (1987).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, 00471 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).
- Ai, D., et al. Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa Armigera (Hubner). Journal of Visualized Experiments: JoVE1. (173), e62068 (2021).
- Huang, Y., et al. CRISPR/Cas9 mediated knockout of the abdominal-A homeotic gene in the global pest, diamondback moth (Plutella xylostella). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 75, 98-106 (2016).
- Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).
- Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
- Li, Y., et al. CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).
- Xu, X., et al. BmHpo mutation induces smaller body size and late stage larval lethality in the silkworm, Bombyx mori. Insect Science. 25 (6), 1006-1016 (2018).
- Chen, D., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust. BMC Biotechnology. 18 (1), 60 (2018).
- Zhang, T., et al. Egg tanning improves the efficiency of CRISPR/Cas9-mediated mutant locust production by enhancing defense ability after microinjection. Journal of Integrative Agriculture. 20 (10), 2716-2726 (2021).
- Guo, X., et al. 4-Vinylanisole is an aggregation pheromone in locusts. Nature. 584 (7822), 584-588 (2020).
- Zhang, L., Lecoq, M., Latchininsky, A., Hunter, D.
- Yang, P., Hou, L., Wang, X., Kang, L. Core transcriptional signatures of phase change in the migratory locust. , Available from: http://www.locustmine.org:8080/locustmine (2019).
- Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. , Available from: http://www.e-crisp.org/E-CRISP/ (2014).
- Pétavy, G. Origin and development of the vitellophags during embryogenesis of the migratory locust, Locusta migratoria L. (Orthoptera : Acrididae). International Journal of Insect Morphology and Embryology. 14 (6), 361-379 (1985).
- Barry, S. K., et al.
- Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. Genome editing in the cricket, Gryllus bimaculatus. Methods in Molecular Biology. 1630, 219-233 (2017).
- Du, M. H., et al. Suppression of Laccase 2 severely impairs cuticle tanning and pathogen resistance during the pupal metamorphosis of Anopheles sinensis (Diptera: Culicidae). Parasites & Vectors. 10 (1), 171 (2017).
- Eisner, T., Shepherd, J., Happ, G. M. Tanning of grasshopper eggs by an exocrine secretion. Science. 152 (3718), 95-97 (1966).
- Ho, K., Dunin-Borkowski, O. M., Akam, M. Cellularization in locust embryos occurs before blastoderm formation. Development. 124 (14), 2761-2768 (1997).
- Wang, X., et al. Interactive effect of photoperiod and temperature on the induction and termination of embryonic diapause in the migratory locust. Pest Managment Science. 77 (6), 2854-2862 (2021).
- Jarwar, A. R., et al. Comparative transcriptomic analysis reveals molecular profiles of central nervous system in maternal diapause induction of Locusta migratoria. G3-Genes Genomes Genetics. 9 (10), 3287-3296 (2019).
