Summary
Este estudo fornece um procedimento sistematicamente otimizado de construção de mutantes homozigotos de gafanhotos baseado em ribonuclease CRISPR/Cas9, bem como um método detalhado para criopreservação e ressuscitação dos ovos de gafanhotos.
Abstract
O gafanhoto migratório, Locusta migratoria, não é apenas um dos gafanhotos da peste mundial que causaram enormes perdas econômicas aos seres humanos, mas também um importante modelo de pesquisa para a metamorfose de insetos. O sistema CRISPR/Cas9 pode localizar com precisão em um locus de DNA específico e clivar dentro do local alvo, introduzindo eficientemente quebras de fita dupla para induzir knockout do gene alvo ou integrar novos fragmentos gênicos no locus específico. A edição do genoma mediada por CRISPR/Cas9 é uma ferramenta poderosa para abordar questões encontradas na pesquisa de gafanhotos, bem como uma tecnologia promissora para o controle de gafanhotos. Este estudo fornece um protocolo sistemático para knockout gênico mediado por CRISPR/Cas9 com o complexo da proteína Cas9 e RNAs guia único (sgRNAs) em gafanhotos migratórios. A seleção dos sítios alvo e o planejamento do sgRNA são descritos em detalhes, seguidos pela síntese in vitro e verificação dos sgRNAs. Os procedimentos subsequentes incluem coleta de jangada de ovos e separação de ovos curtidos para alcançar microinjeção bem-sucedida com baixa taxa de mortalidade, cultura de ovos, estimativa preliminar da taxa de mutação, criação de gafanhotos, bem como detecção, preservação e passagem dos mutantes para garantir a estabilidade populacional dos gafanhotos editados. Este método pode ser usado como referência para aplicações de edição genética baseadas em CRISPR/Cas9 em gafanhotos migratórios, bem como em outros insetos.
Introduction
Tecnologias de edição de genes poderiam ser usadas para introduzir inserções ou deleções em um locus específico do genoma para modificar artificialmente o gene alvo na finalidade1. Nos últimos anos, a tecnologia CRISPR/Cas9 desenvolveu-se rapidamente e tem um escopo crescente de aplicações em vários campos das ciências da vida 2,3,4,5,6. O sistema CRISPR/Cas9 foi descoberto em 19877, e amplamente encontrado em bactérias e arqueias. Pesquisas posteriores indicaram que se tratava de um sistema imune adaptativo procariótico que depende da nuclease Cas9 guiada por RNA para lutar contra fagos8. O sistema CRISPR/Cas9 modificado artificialmente consiste principalmente de dois componentes, um RNA guia único (sgRNA) e a proteína Cas9. O sgRNA é composto por um RNA CRISPR (crRNA) complementar à sequência alvo e um crRNA auxiliar transativador (tracrRNA), que é relativamente conservado. Quando o sistema CRISPR/Cas9 é ativado, o sgRNA forma uma ribonucleoproteína (RNP) com a proteína Cas9 e guia Cas9 para seu local alvo através do pareamento de bases das interações RNA-DNA. Em seguida, o DNA de fita dupla pode ser clivado pela proteína Cas9 e, como resultado, a quebra de fita dupla (DSB) emerge perto do motivo adjacente do protoespaçador (PAM) do sítio alvo 9,10,11,12. Para mitigar os danos causados pelos DSBs, as células ativariam respostas abrangentes de danos ao DNA para detectar eficientemente os danos genômicos e iniciar o procedimento de reparo. Existem dois mecanismos distintos de reparo na célula: a junção final não homóloga (NHEJ) e o reparo dirigido por homologia (HDR). NHEJ é a via de reparo mais comum que pode reparar quebras de fita dupla de DNA rapidamente e previne a apoptose celular. No entanto, é propenso a erros por deixar pequenos fragmentos de inserções e deleções (indels) perto dos DSBs, o que geralmente resulta em uma mudança de quadro de leitura aberta e, portanto, pode levar ao nocaute genético. Em contraste, o reparo homólogo é um evento bastante raro. Com a condição de que haja um modelo de reparo com sequências homólogas ao contexto do DSB, as células ocasionalmente reparariam a quebra genômica de acordo com o modelo próximo. O resultado do HDR é que o DSB é precisamente reparado. Especialmente, se houvesse uma sequência adicional entre as sequências homólogas no template, elas seriam integradas ao genoma através do HDR e, dessa forma, as inserções gênicas específicas poderiam ser realizadas13.
Com a otimização e o desenvolvimento das estruturas de sgRNA e variantes da proteína Cas9, o sistema de edição genética baseado em CRISPR/Cas9 também tem sido aplicado com sucesso em pesquisas de insetos, incluindo, mas não se limitando a, Drosophila melanogaster, Aedes aegypti, Bombyx mori, Helicoverpa Armigera, Plutella xylostella e Locusta migratoria 14,15,16,17,18 ,19. Até onde sabemos, embora RNPs constituídas pela proteína Cas9 e sgRNA transcrito in vitro tenham sido utilizados para edição do genoma de gafanhotos20,21,22, ainda não existe um protocolo sistemático e detalhado para a construção mediada por ribonucleases CRISPR/Cas9 de mutantes homozigotos do gafanhoto migratório.
O gafanhoto migratório é uma importante praga agrícola de distribuição global e ameaça substancial à produção de alimentos, sendo especialmente prejudicial às gramíneas, como trigo, milho, arroz e milheto23. A análise da função gênica baseada em tecnologias de edição do genoma pode fornecer novos alvos e novas estratégias para o controle de gafanhotos migratórios. Este estudo propõe um método detalhado para nocautear genes de gafanhotos migratórios através do sistema CRISPR/Cas9, incluindo a seleção de sítios alvo e planejamento de sgRNAs, síntese e verificação in vitro dos sgRNAs, microinjeção e cultura de ovos, estimativa da taxa de mutação na fase embrionária, detecção de mutantes, bem como passagem e preservação dos mutantes. Este protocolo pode ser usado como uma referência basal para a manipulação da grande maioria dos genes de gafanhotos e pode fornecer referências valiosas para a edição do genoma de outros insetos.
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Protocol
1. Seleção do local alvo e projeto de sgRNA
- Coletar o máximo possível de informações de sequência para o gene de interesse através de pesquisa bibliográfica e/ou busca do mRNA ou sequência de DNA codificante (CDS) do gene no banco de dados NCBI e gafanhotos24.
- Comparar a sequência do gene interessado com sua sequência de DNA genômico para distinguir as regiões do éxon e do íntron.
- Selecione uma região candidata para o design do site de destino com base no objetivo da pesquisa. Projete pares de primers para amplificar o fragmento da região candidata e verificar sua sequência selvagem por meio da análise de sequenciamento do produto de PCR.
NOTA: Existem diferentes estratégias para a seleção da região-alvo candidata. Por exemplo, na maioria das pesquisas de função gene/proteína, use o fragmento de éxon próximo ao seu códon inicial como a região candidata para garantir que toda a função proteína/RNA seja perdida após a edição do genoma (ou seja, nocaute do gene). Enquanto para a análise de função de um domínio específico, selecione a região candidata no início (ou ambas as extremidades) do domínio. - Use recursos on-line como o E-CRISP Design25 para procurar potenciais sites-alvo na região de destino candidata.
- Selecione "Drosophila melanogaster BDGP6" (ou qualquer outro inseto) na lista suspensa de genomas de referência e escolha "Input is FASTA sequence" seguido de colar a sequência da região alvo na caixa de texto (no formato FASTA).
- Inicie o aplicativo pressionando "Start sgRNA search" com "medium" e "single design" para obter os possíveis sites de destino. Selecione 1-3 alvos potenciais a partir dos resultados com base em suas pontuações previstas e projete os sgRNAs correspondentes de acordo.
NOTA: Existem muitas outras plataformas on-line para o design CRISPR, como CRISPOR, CHOPCHOP, CRISPRdirect, ZiFiT, e assim por diante (consulte a Tabela de Materiais). Alguns deles têm a função de verificar a especificidade das espécies cujos dados de sequência genômica estão em seus bancos de dados. No entanto, a sequência genômica dos gafanhotos não foi encontrada em nenhum site online. É melhor usar mais de uma ferramenta on-line para o projeto CRISPR em gafanhotos. De forma abrangente, considere os resultados de diferentes sites e selecione o sgRNA a partir dos resultados com base no princípio da maior especificidade, maior eficiência e menor taxa de incompatibilidade (Figura 1A,B).
2. Síntese e verificação do sgRNA in vitro
- Sintetizar o sgRNA utilizando kits de síntese de sgRNA de acordo com o manual do fabricante (Tabela de Materiais). Esse procedimento geralmente inclui três etapas: amplificação do molde de DNA, transcrição in vitro e purificação do sgRNA21. Diluir o sgRNA sintetizado com água livre de nucleases para uma concentração de armazenamento de 300 ng/μL para uso posterior.
- Amplificar e purificar o fragmento do gene alvo para servir como substrato do ensaio de clivagem in vitro do sistema CRISPR/Cas9. Execute estas etapas seguindo as instruções do fabricante.
- Diluir a proteína Cas9 adquirida a 300 ng/μL com água livre de nucleases. Incubar 1 μL de sgRNA (300 ng/μL) e 1 μL de proteína Cas9 (300 ng/μL) com 200 ng de fragmento alvo purificado no tampão de clivagem a 37 °C durante 1 h (10 μL de volume total; ver Tabela 1). Estimar a eficiência da clivagem de Cas9 induzida por sgRNA por eletroforese em gel de agarose (Figura 1C). Selecione os sgRNAs com alta atividade para a seguinte microinjeção.
NOTA: Os resultados da eletroforese em gel de agarose podem ser convertidos em imagens em tons de cinza com software de processamento de imagens e a eficiência de clivagem é estimada de acordo com a escala de cinza das bandas de tamanhos especulados.
3. Microinjeção e cultura dos ovos
- Prepare as agulhas de injeção puxando os capilares de vidro com um extrator de micropipeta (Tabela de Materiais). Defina os parâmetros da seguinte forma: Calor para 588, Puxar para 90, Velocidade para 60 e Tempo para 40. Triture a ponta da agulha de injeção com um micro moedor (Tabela de Materiais).
OBS: As pontas ideais da agulha são abertas e pontiagudas (Figura 2A). É altamente recomendável preparar agulhas adicionais para os experimentos, porque as agulhas às vezes são bloqueadas ou quebradas acidentalmente durante as injeções. - Misturar 1 μL da proteína Cas9 (300 ng/μL) com 1 μL do sgRNA verificado (300 ng/μL) para obter as RNPs injetáveis. Adicione 8 μL de água estéril sem RNase para fazer o volume final da mistura para 10 μL. Misture bem a solução e mantenha-a no gelo.
NOTA: As concentrações finais da proteína Cas9 e sgRNAs podem ser otimizadas de acordo com os resultados da edição. Evite o congelamento e descongelamento repetitivos da solução preparada de RNP e recomenda-se o uso imediato. - Criar os gafanhotos adultos machos e fêmeas juntos a 30 °C com fotoperíodo de 16 (claro):8 (escuro) e fornecer-lhes mudas de trigo fresco suficientes como alimento. Observe esses gafanhotos diariamente e coloque um vaso de oviposição (um vaso de plástico ou copo cheio de areia estéril molhada) na gaiola de criação para oviposição assim que os gafanhotos acasalarem.
NOTA: Normalmente, 100 pares de gafanhotos adultos criados em uma gaiola de criação (40 cm x 40 cm x 40 cm) são suficientes para gerar ovos para nocautear um único gene. Cultive pares de gafanhotos adicionais se mais ovos forem necessários. - Recolha as vagens de ovos recém-colocadas do pote de oviposição e aguarde cerca de 30 minutos para o bronzeamento dos ovos. Isole suavemente os ovos das vagens de ovos em água usando uma escova fina e lave-os com água estéril três vezes. Mantenha os ovos em uma placa de Petri e adicione água estéril para mantê-los úmidos.
NOTA: O curtimento dos ovos recém-postos pode melhorar significativamente a eficiência mutante21. - Encha uma agulha de injeção com a solução RNP preparada e carregue-a no micromanipulador (Tabela de Materiais).
- Defina os parâmetros de microinjeção da seguinte forma: 300 hPa da pressão de injeção (pi), 0,5 s do tempo de injeção (ti) e 25 hPa da pressão de compensação (pc).
- Pressione o pedal para avaliar o volume da solução injetada. Ajuste a pressão de injeção e o tempo de injeção para garantir que o volume de injeção seja de cerca de 50-100 nL.
NOTA: Exaure o ar residual na agulha para tornar a solução de injeção contínua e controlável tanto quanto possível. A conexão da agulha e do micromanipulador precisa ser apertada.
- Dispor os ovos estéreis regularmente sobre a almofada injetora (Figura 2B,C) e colocá-la sobre a mesa objeto do microscópio (Figura 3A). Ajustar a ampliação do microscópio até que os ovos sejam observados. Ajuste a agulha de microinjeção sob o microscópio até que a ponta de injeção possa ser vista e posicione-a perto do ovo a ser injetado.
- Inicie a injeção a uma altura adequada e num ângulo de 30-45 graus. Insira a ponta no ovo cuidadosamente perto das micrópilas do ovo (Figura 3B) e pressione o pedal para realizar a injeção. Retraia a agulha rapidamente e mova a almofada de injeção para injeção do próximo ovo.
NOTA: Deve observar-se uma ligeira expansão do ovo durante a microinjeção. Uma pequena quantidade de extravasamento citoplasmático no orifício é aceitável. Substitua a agulha de injeção por uma nova ou ajuste o ângulo de injeção se a saída de líquido for excessiva. - Transfira os ovos injetados para uma placa de cultura (uma placa de Petri com um pedaço de papel de filtro úmido) e coloque-os em uma incubadora a 30 °C.
NOTA: Levará cerca de 13-14 dias até que as ninfas eclodam desses ovos injetados (com a condição de que a mutação do gene alvo não afete o desenvolvimento dos embriões) (Figura 3C). Injetar pelo menos 100 ovos para garantir uma quantidade suficiente de eclosão e eclosão para eliminar um gene específico.
4. Estimativa da taxa de mutação e triagem de mutantes
- Verifique o desenvolvimento dos ovos injetados todos os dias após a injeção. Transfira os ovos injetados para uma nova placa de cultura a cada 24 h nos primeiros 5 dias.
- No6º dia (ou mais tarde) após a injeção, colher e transferir aleatoriamente 10 ovos para um tubo e triturar adequadamente os ovos com duas esferas de aço a 60 Hz por 6 min usando um moedor (ver Tabela de Materiais). Ressuspender os detritos com 1 mL de PBS. Transferir 5 μL da mistura para 45 μL de NaOH 50 mM e lisar a 95 °C durante 5 min. Adicionar 5 μL de Tris-HCl 1 M (pH=8,0) no sistema de lise para terminar a reação de lise alcalina.
NOTA: Os ovos podem ser selecionados para lise alcalina em qualquer dia após a última transferência e vários ovos podem ser usados como uma amostra, dependendo de sua situação de desenvolvimento (por exemplo, cinco embriões de 6 dias podem ser usados como uma amostra, e dois embriões de 10 dias podem ser usados como uma amostra). Às vezes, não é viável obter o DNA genômico dos ovos usando o método de lise alcalina. Kits comerciais de extração de DNA genômico podem ser usados como um método alternativo para isolar o DNA genômico dos ovos. - Tome 1 μL do produto da lise como molde de PCR para amplificar o fragmento do gene alvo (Tabela 2 e Tabela 3) e envie os produtos de PCR para sequenciamento. Comparar os resultados do sequenciamento com a sequência selvagem para avaliar preliminarmente se o sistema CRISPR/Cas9 clivou o gene alvo in vivo (Figura 4A). Permitir o resto dos ovos para o desenvolvimento subsequente na condição de que indels são detectados na fase embrionária.
NOTA: Desta forma, a taxa de mutação pode ser preliminarmente estimada na fase embrionária. Se nenhum indels for encontrado nesta etapa, prepare alguns novos sgRNAs para o gene alvo e repita o protocolo de nocaute da etapa 2.1. - Transferir as ninfas eclodidas para uma gaiola de criação e cultivá-las conforme descrito na etapa 3.3. Quando as ninfas evoluírem para o estágio de quinto ínstar, separe-as com copos plásticos de cultura (1 ninfa/xícara).
NOTA: Geralmente leva cerca de 25-35 dias para que as ninfas se desenvolvam até seu quinto ínstar e o fenótipo mais óbvio é que os brotos alares se estendem até o quarto ou quinto segmentos abdominais. Além disso, recomenda-se registrar os fenótipos de ninfas mortas para predizer a relação entre o gene alvo e os fenótipos em pesquisas futuras. - Cortar cerca de 2 mm de comprimento das antenas com uma tesoura dissecante e lisá-la utilizando o método de lise alcalina (passo 4.2). Analisar a sequência de fragmentos gênicos alvo dessas ninfas conforme descrito acima (passo 4.3) para identificar os mutantes G0 (Figura 4B).
NOTA: O corte das antenas para lise pode ser um pouco mais longo e moer ou picar as antenas é útil para lise, embora as antenas possam ser digeridas diretamente. Indivíduos com múltiplos picos próximos ao local alvo no resultado do sequenciamento são identificados como mutantes positivos e permitem o desenvolvimento e acasalamento subsequentes.
5. Estabelecimento e passagem de linhagens mutantes
- Realizar cruzamento utilizando os mutantes G0 e gafanhotos selvagens (Figura 4B). Recolher os oocistos e incubá-los separadamente a 30 °C. Use 3-6 ovos desenvolvidos em cada oocisto para detectar mutações conforme descrito nas etapas 4.2 e 4.3. Mantenha oocistos mutação-positivos para o desenvolvimento subsequente e abandone os oocistos mutação-negativos.
NOTA: A estimativa da taxa de mutação na fase embrionária pode acelerar muito a triagem de mutantesG1 . Geralmente, 3-6 ovos desenvolvidos podem ser misturados como uma amostra para genotipagem mediada por PCR, como descrito acima. - Recuar as ninfas G1 conforme descrito no passo 4.4. Cortar cerca de 2 mm de comprimento das antenas para realizar a genotipagem baseada em PCR, conforme descrito na etapa 4.5 para detectar heterozigotos G1 . Realizar a clonagem de AT de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais) para identificar suas mutações. Realizar o cruzamento utilizando heterozigotos G1 com as mesmas mutações para obtenção de ninfas G2 .
NOTA: O sequenciamento de Sanger dos produtos de PCR só pode fornecer informações para descobrir os heterozigotos, mas não informações suficientes para identificar as mutações exatas. Assim, a clonagem de TA usando os produtos da PCR é necessária para identificar claramente as mutações e pode promover o estabelecimento de linhagens mutantes estáveis. - Recue as ninfas G2 até o quinto ínstar. Use a genotipagem baseada em PCR descrita na etapa 5.2 para identificar os homozigotos e/ou heterozigotos que são adequados para pesquisas futuras e passagem estável (Figura 4B).
OBS: Preste atenção para evitar a mistura de homozigotos e heterozigotos. Recomenda-se a realização de genotipagem baseada em PCR em cada geração para confirmar a homozigosidade e/ou heterozigosidade de cada população. O número de gafanhotos utilizados para esta verificação depende do tamanho da população. Além disso, a população de gafanhotos pode ser expandida pela estratégia in-cross.
6. Criopreservação e ressuscitação de ovos
- Lavar os ovos a serem criopreservados com água estéril e incubá-los em uma placa de cultura conforme descrito acima (passo 3.8) por 5-6 dias. Junte esses ovos no prato de cultura e cubra-os com fragmentos de papel de filtro. Embrulhe todo o prato de cultura com um filme de parafina.
- Mantenha o prato a 25 °C por 2 dias seguidos por mais 2 dias a uma temperatura relativamente mais baixa (13-16 °C). Em seguida, transfira o prato para uma geladeira a 6 °C. Adicione água a cada 2 semanas para proporcionar um ambiente úmido para os ovos (Figura 5A).
NOTA: Especula-se que os embriões estejam na fase katatrepsis após serem desenvolvidos por 5-6 dias a 30 °C26. O resfriamento do gradiente é útil para a criopreservação dos ovos (Tabela 5). - Para ressuscitar os ovos criopreservados, retire a placa de Petri da geladeira e mantenha-a a 25 °C por 2 dias. Colocar esses ovos em incubadora a 30 °C até que as ninfas eclodam (Figura 5B).
NOTA: É necessário colocar os ovos criopreservados a 25 °C antes de transferi-los para uma incubadora a 30 °C. Os embriões podem ser criopreservados por pelo menos cinco meses, embora a taxa de eclosão e a taxa de eclosão possam diminuir devido à criopreservação (Tabela 5).
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Representative Results
Este protocolo contém as etapas detalhadas para geração de mutantes homozigotos dos gafanhotos migratórios com a RNP constituída pela proteína Cas9 e sgRNA sintetizado in vitro . A seguir estão alguns resultados representativos do knockout do gene alvo mediado por CRISPR/Cas9 em gafanhotos, incluindo seleção de alvo, síntese e verificação de sgRNA (Figura 1A), coleta e injeção de ovos, triagem e passagem de mutantes, criopreserva e ressuscitação dos ovos homozigotos.
Neste estudo, o local alvo do sistema CRISPR/Cas9 é selecionado de acordo com os resultados de três programas on-line (E-CRISP, CRISPOR e ZiFit) e localizado no primeiro éxon (Figura 1B). De acordo com o ensaio de clivagem de Cas9 in vitro (Tabela 1), o CRISPR/Cas9 RNP foi capaz de digerir o fragmento de PCR (contendo o sítio alvo) com uma taxa de clivagem de cerca de 55% (Figura 1C). Em seguida, essa RNP foi microinjetada em 120 ovos fertilizados em seu estágio unicelular utilizando o sistema de microinjeção padrão (Figura 2 e Figura 3). Os resultados do sequenciamento para a estimativa da taxa de mutação no estágio embrionário sugeriram edição eficiente do genoma no sítio alvo (Figura 4A). Além disso, este estudo resultou em uma taxa de eclosão de ninfas de 52,73% e 66,7% dos adultos G0 eram mutantes em mosaico (Tabela 4).
Além disso, as quimeras G0 foram cruzadas com gafanhotos selvagens para obter indivíduos heterozigotos G 1 e os heterozigotos G1 com as mesmas mutações (rastreados por clonagem TA) foram cruzados para gerar os animaisG2. A fenotipagem baseada em PCR foi utilizada para a detecção de mutantes e os homozigotos obtidos foram cruzados para estabelecer linhagens mutantes estáveis (Figura 4B).
Enquanto isso, o excesso de ovos homozigotos foi criopreservado para melhorar a taxa de utilização dos homozigotos. Embora a taxa de eclosão dos ovos criopreservados tenha sido reduzida com o prolongamento do tempo de criopreservação (Tabela 5), as ações corretivas, incluindo a aplicação de fragmentos de papel filtro para manter os ovos úmidos e a recuperação desses ovos preservados com gradiente de elevação da temperatura, foram úteis para a ressuscitação (Figura 5 e Tabela 5). Finalmente, a população homozigótica de mutantes foi mantida com sucesso para pesquisas subsequentes.
Figura 1: Desenho do alvo e verificação in vitro do sgRNA. (A) O diagrama de fluxo para seleção de alvo, síntese de sgRNA e verificação de bioatividade in vitro (incluindo, mas não limitado a gafanhotos). (B) Diagrama esquemático da estrutura do gene e do sítio alvo. Os exons deste gene alvo são mostrados como domínios azuis e o sítio alvo foi selecionado a jusante do códon inicial no éxon 1. A sequência de destino é realçada em vermelho. (C) A eletroforese em gel de agarose resulta do ensaio de clivagem in vitro Cas9. Um fragmento de DNA contendo a sequência alvo (cerca de 400 pb de comprimento) foi amplificado e usado como substrato para a digestão de Cas9. As pequenas bandas esperadas (cerca de 100 pb e 300 pb aqui; marcadas com triângulos vermelhos) sugeriram que o sgRNA sintetizado poderia induzir clivagem Cas9 eficaz. A taxa de clivagem foi de cerca de 55% de acordo com a análise em tons de cinza. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Preparo da agulha e da almofada de microinjeção para ovos de alfarroba. (A) Ponta de uma agulha preparada para microinjeção de ovos de alfarroba. Barra de escala: 1 mm. (B) Imagem de uma almofada de microinjeção com ovos (indicada com um triângulo vermelho) dispostos sobre ela. A barra de escala representa 1 cm. (C) O tamanho da almofada de microinjeção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Microinjeções de ovos. (A) Um sistema de microinjeção representativo marcado com caixas vermelhas indicando um microscópio (meio) e um micromanipulador (direita) conectado a um microinjetor (esquerda). O computador é usado para armazenamento de dados e para fornecer observação auxiliar. (B) Injeção do ovo de alfarroba. O local de injeção é marcado com um triângulo vermelho. (C) Uma ninfa eclodida ao microscópio. As barras de escala representam 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Resultados do sequenciamento dos animais G 0 e estratégia de passagem das linhagens mutantes. (A) O sequenciamento típico resulta na triagem G0. Vários picos próximos ao local alvo (marcados com um retângulo vermelho na sequência selvagem) indicaram que o ovo/gafanhoto testado foi editado com sucesso pelo sistema CRISPR/Cas9 (como mostrado em G 0-1 e G0-2), enquanto o indivíduo sem qualquer alteração no resultado do sequenciamento foi considerado como não editado e abandonado (por exemplo, G0-3). (B) A estratégia de passagem das linhas mutantes. Os animais do G0 foram primeiramente triados por genotipagem mediada por PCR e aqueles com múltiplos picos em seus resultados de sequenciamento foram cruzados com gafanhotos selvagens para gerar os animais doG1. A genotipagem mediada por PCR e a clonagem de AT foram utilizadas para identificar os heterozigotosG1. Em seguida, heterozigotos com as mesmas mutações foram cruzados para gerar os animaisG2 (homozigotos e heterozigotos) para posterior pesquisa e passagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Criopreservação e ressuscitação dos ovos. (A) O procedimento de criopreservação: Isolar os ovos das vagens de ovos e incubá-los a 30 °C por 5-6 dias após a lavagem com água estéril. Em seguida, junte os ovos desenvolvidos na placa de Petri e cubra-os com pequenos pedaços de papel de filtro úmido. Embrulhe toda a placa de Petri com uma película de parafina e mantenha-a a 25 °C por 2 dias, seguidos por mais 2 dias a uma temperatura relativamente mais baixa (por exemplo, 13-16 °C). Finalmente, leve à geladeira a 6 °C. (B) O procedimento de ressuscitação: Tire as placas de Petri com ovos criopreservados da geladeira e mantenha-as a 25 °C por 2 dias após a remoção dos pedaços de papel de filtro. Em seguida, os ovos podem ser cultivados para posterior desenvolvimento a 30 °C até a eclosão das ninfas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Reagente | Volume (μL) |
| Proteína Cas9 (300 ng/μL) | 1 |
| sgRNA (300 ng/μL) | 1 |
| Produto de PCR (200 ng/μL) | 1 |
| 10×NEBuffer r3.1 | 1 |
| Água livre de nucleases | 6 |
Tabela 1: Sistema de digestão in vitro . 200 ng de fragmento alvo purificado (produto de PCR) foram misturados com o sistema CRISPR/Cas9 (300 ng de cada componente) para testar a bioatividade dos sgRNAs sintetizados. Um tampão comercial foi usado e água livre de nuclease foi adicionada para compor o volume total de 10 μL.
| Reagente | Volume (μL) |
| 2xEs Taq MasterMix | 12.5 |
| Primer para frente | 0.5 |
| Primer reverso | 0.5 |
| Molde (produto de lise) | 1 |
| Água livre de nucleases | 10.5 |
Tabela 2: Sistema de PCR para amplificação de fragmentos gênicos alvo. Para amplificar o fragmento genômico do gene alvo, uma mistura comercial de Taq foi usada e primers foram adicionados de acordo com as instruções do fabricante. 1 μL do produto de lise foi usado como molde e água livre de nuclease foi usada para fazer o volume total para 25 μL.
| Temperatura (°C) | Hora | Ciclos |
| 95 | 5 minutos | 1 |
| 95 | Anos 30 | 35 |
| 55 | Anos 30 | |
| 72 | Anos 40 | |
| 72 | 10 minutos | 1 |
Tabela 3: Programa de PCR para amplificação do gene alvo. O programa de PCR para amplificação do gene alvo foi: 95 °C por 5 min; 35 ciclos de 95 °C por 30 s, 55 °C por 30 s, 72 °C por 40 s; 72 °C por 10 min.
| Itens | Dados |
| Nº de ovos injetados | 120 |
| Embriões testados | 10 |
| Nº de ninfas eclodidas | 58 |
| Taxa de eclosão | 52.73% |
| Nº de G0 adulto | 12 |
| Nº de G0 mutantes | 8 |
| Eficiência da mutação em adultos G0 | 66.67% |
Tabela 4: Resumo da eficiência de edição. 120 ovos foram injetados para nocautear o gene alvo e 10 ovos foram levados para teste durante a fase embrionária. 58 ninfas eclodiram dos demais embriões (a taxa de eclosão foi de 52,73%). Finalmente, 12 gafanhotos G0 se desenvolveram para a fase adulta e 8 deles foram editados com sucesso no local alvo. A taxa de mutação em adultos G0 foi de 66,67%.
| Grupo controle | Grupo 1 | Grupo 2 | Grupo 3 | Grupo 4 | |
| Nº de ovos | 120 | 120 | 120 | 120 | 120 |
| Tratamento de temperatura para armazenamento | 30 °C | 30°C (5-6 d)→6 °C | 30°C (5-6 d)→25°C (2 d)→13-16°C (2 d)→6 °C | 30°C (5-6 d)→25°C (2 d)→13-16°C (2 d)→6 °C | 30°C (5-6 d)→25°C (2 d)→13-16°C (2 d)→6 °C |
| Tempo de armazenamento | 14 dias | 14 dias | 1 mês | 3 meses | 5 meses |
| Tratamento térmico para ressuscitação | 30 °C | 6°C→30 °C | 6°C→25°C (2 d)→30 °C | 6°C→25°C (2 d)→30 °C | 6°C→25°C (2 d)→30 °C |
| Nº de gafanhotos eclodidos | 108 | 0 | 96 | 86 | 78 |
| Taxa de eclosão | 90.00% | 0 | 80.00% | 71.67% | 65.00% |
| Nº de gafanhotos adultos | 81 | 0 | 60 | 46 | 31 |
| Taxa de eclosão | 75.00% | 0 | 62.50% | 53.49% | 39.74% |
Tabela 5: Resumo da criopreservação e ressuscitação dos ovos. 600 ovos foram divididos em cinco grupos para estudo de criopreservação e ressuscitação. O primeiro grupo (controle) de 120 ovos foi sempre incubado a 30 °C e armazenado por 14 dias. O segundo grupo (Grupo 1) de 120 ovos foi transferido para geladeira após incubação a 30 °C por 5-6 dias e armazenado a 6 °C por 14 dias. Em seguida, esses ovos foram transferidos a 30 °C para ressuscitação. Os demais grupos (grupo 2, grupo 3 e grupo 4, cada grupo continha 120 ovos) experimentaram um tratamento gradiente de resfriamento e recuperação de temperatura conforme descrito no protocolo (passos 6.1-6.3) com um tempo de armazenamento diferente (1 mês para o grupo 2, 3 meses para o grupo 3 e 5 meses para o grupo 4). Por fim, 108 ninfas eclodiram do grupo controle (a uma taxa de eclosão de 90%) e 81 delas evoluíram até a fase adulta (75% da taxa de eclosão). Nenhum gafanhoto eclodiu no segundo grupo (Grupo 1). A taxa de eclosão e a taxa de eclosão dos demais grupos foram menores em relação ao grupo controle e declinaram com o tempo de armazenamento. 96 ninfas eclodiram no grupo 2 e 60 delas evoluíram até a fase adulta. 86 ninfas eclodiram no grupo 3 e 46 delas evoluíram até a fase adulta. No grupo 4, 78 ninfas eclodiram e 31 delas evoluíram até a fase adulta.
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Discussion
Os gafanhotos estão entre as pragas mais devastadoras para a agricultura desde a civilização dos seres humanos23. A tecnologia de edição do genoma baseada em CRISPR/Cas9 é uma ferramenta poderosa para fornecer um melhor conhecimento dos mecanismos biológicos em gafanhotos, bem como uma estratégia promissora de controle de pragas. Assim, é de grande benefício desenvolver um método eficiente e fácil de usar de construção de mutantes homozigotos de gafanhotos mediada por CRISPR/Cas9. Embora alguns grandes trabalhos tenham sido relatados e fornecido algum fluxo de trabalho básico para a edição do genoma em gafanhotos 18,20,21,22, uma otimização sistemática de todo o procedimento ainda é escassa. Em geral, o mutante homozigoto de gafanhotos gerado pela injeção embrionária do sistema CRISPR/Cas9 pode ser dividido em três etapas principais: a) planejamento, síntese e triagem in vitro do sgRNA, b) coleta, preparo e injeção de ovos; e c) triagem de mutantes e manutenção do homozigoto. Este protocolo fornece um fluxo de trabalho otimizado e as etapas de seleção do local alvo, triagem in vitro de sgRNA, microinjeção dos ovos, bem como detecção de mutantes são especialmente críticas para a geração eficaz de gafanhotos mutantes homozigotos com o sistema CRISPR/Cas9.
Em primeiro lugar, o sítio alvo, a forma do sgRNA correspondente e a concentração de sgRNA têm sido sugeridos como fatores críticos da eficiência de edição do genoma em insetos18,27,28. Para resolver esse problema, recomenda-se primeiro analisar a estrutura do gene e projetar mais de um local alvo no éxon 1 ou próximo ao códon inicial usando os recursos on-line. Em seguida, sintetizar o sgRNA in vitro e misturá-lo com a proteína Cas9 em diferentes concentrações para otimizar a eficiência de corte da RNP. Este procedimento ajudará a identificar um sgRNA com alta bioatividade e otimizar a composição do complexo RNP para o gene alvo candidato.
Em segundo lugar, coletar o maior número possível de ovos frescos em um tempo limitado e melhorar a taxa de eclosão, bem como a taxa de mutação, também são grandes desafios para as operações de edição do genoma. Os gafanhotos adultos gregários criados na condição de 16 (claro):8 (escuro) fotoperíodo são usados para coletar ovos suficientes em um curto período durante 9:00-11:00 am. É importante aplicar suavemente a pressão descendente entre os ovos usando um pincel ou pinça para isolar cuidadosamente os ovos da vagem. Com prática suficiente, vários usuários podem separar de forma confiável ovos individuais da vagem. Depois que cada ovo é isolado e lavado com água estéril, os ovos são alinhados nas almofadas de injeção projetadas (Figura 2B,C) para estabilizar os ovos durante a microinjeção. O ovo é injetado com o RNP otimizado próximo às micrópilas. Para limitar os danos mecânicos e minimizar a poluição dos ovos, os ovos frescos podem permanecer nas vagens por cerca de 30 min para garantir que o curtimento da casca do ovo seja ideal para microinjeção21, devido à sua estrutura condensada e alta capacidade de defesa na invasão após bronzeamento suficiente 29,30. Enquanto isso, um relatório publicado indicou que a divisão sincicial31 de ovos de gafanhotos ocorre em algum momento entre 0 h e 4 h após a postura. Com o protocolo de microinjeção padrão atual, a injeção de cerca de 100 ovos pode ser realizada dentro de 40 minutos. Em conjunto, o procedimento de curtimento e microinjeção de 100 óvulos fertilizados pode ser concluído em até 2 h. Assim, restam pelo menos 2 h para a clivagem mediada por CRISRP/Cas9 e o reparo de genes-alvo para alcançar uma mutação eficiente nos ovos injetados e futuros gafanhotos adultos.
Por fim, estratégias efetivas de passagem e identificação de mutantes são importantes para gerar homozigotos na maioria dos animais mutantes. Em gafanhotos, para genes que não são letais após a edição, a estratégia cruzada sugerida aqui é que os mutantes G0 cruzam com gafanhotos de tipo largo e outros cruzamentos podem ser realizados usando os heterozigotos G1 com as mesmas mutações para gerar mutantes homozigotos na geração seguinte. Para verificar a mutação em cada gafanhoto durante o processo de herança mutante, recomenda-se usar o método de lise alcalina para digerir um segmento curto de antenas como molde para genotipagem baseada em PCR. Finalmente, use os adultos homozigotos obtidos para mais cruzamento para expandir a população. Limitados pelas diferenças de tamanho populacional e estágio de desenvolvimento entre gafanhotos homozigotos, os ovos em excesso são recomendados para criopreservação a 6 °C e ressuscitação por gradiente de elevação da temperatura (Figura 5), que se baseia no princípio de diapausa a baixa temperatura e liberação de diapausa a alta temperatura de ovos de gafanhotosmigratórios 32,33.
Em suma, o sistema CRISPR/Cas9 provou ser uma ferramenta confiável para facilitar o estudo da genômica funcional de gafanhotos migratórios. Este protocolo detalhado pode ser usado como referência para aplicações de edição gênica baseadas em CRISPR/Cas9 em gafanhotos migratórios, bem como em outros insetos.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (32070502, 31601697, 32072419 e pela China Postdoctoral Science Foundation (2020M672205).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×NEBuffer r3.1 | New England Biolabs | B7030S | The buffer of in vitro Cas9 cleavage assays |
| 2xEs Taq MasterMix (Dye) | Cwbio | CW0690 | For gene amplification |
| 2xPfu MasterMix (Dye) | Cwbio | CW0686 | For gene amplification |
| CHOPCHOP | Online website for designing sgRNAs, http://chopchop.cbu.uib.no/. | ||
| CRISPOR | Online website for designing sgRNAs, http://crispor.org. | ||
| CRISPRdirect | Online website for designing sgRNAs, http://crispr.dbcls.jp/. | ||
| Electrophoresis power supply | LIUYI BIOLOGY | DYY-6D | Separation of nucleic acid molecules of different sizes |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 30125177 | For sample collection, etc. |
| Fine brushes | Annigoni | 1235 | For cleaning and isolating eggs. Purchased online. |
| Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | For making the microinjection needles |
| Gel Extraction Kit | Cwbio | CW2302 | DNA recovery and purification |
| Gel Imaging Analysis System | OLYMPUS | Gel Doc XR | Observe the electrophoresis results |
| GeneTouch Plus | Bioer | B-48DA | For gene amplification |
| Glass electrode capillary | Gairdner | GD-102 | For making injection needles with a micropipette Puller |
| Incubator | MEMMERT | INplus55 | For migratory locust embryo culture |
| Metal bath | TIANGEN | AJ-800 | For heating the sample |
| Micro autoinjector | Eppendorf | 5253000068 | Microinjection of embryos early in development |
| Micro centrifuge | Allsheng | MTV-1 | Used for mixing reagents |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | To ground the tip of injection needle |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | For loading solutions into the injection needles. |
| Micromanipulation system | Eppendorf | TransferMan 4r | An altinative manipulation system for microinjection |
| Microscope | cnoptec | SZ780 | For microinjection |
| Motor-drive Manipulator | NARISHIGE | MM-94 | For controling the position of the micropipette during the microinjection precedure |
| Multi-Sample Tissue Grinder | jingxin | Tissuelyser-64 | Grind and homogenize the eggs |
| ovipisition pot | ChangShengYuanYi | CS-11 | Filled with wet sterile sand for locust ovipositing in it. The oocysts are collected from this container. Purchased online. |
| Parafilm | ParafilmM | PM996 | For wrapping the petri dishes. |
| pEASY-T3 Cloning Kit | TransGen Biotech | CT301-01 | For TA cloning |
| Petri dish | NEST | 752001 | For culture and preservation of the eggs. |
| Pipettor | Eppendorf | Research plus | For sample loading |
| plastic culture cup | For rearing locusts seperately and any plastic cup big enough (not less than 1000 mL in volume) will do. Purchased online. | ||
| Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Primer Premier | PREMIER Biosoft | Primer Premier 5.00 | For primer design |
| SnapGene | Insightful Science | SnapGene®4.2.4 | For analyzing sequences |
| Steel balls | HuaXinGangQiu | HXGQ60 | For sample grinding.Purchased online. |
| Tips | bioleaf | D781349 | For sample loading |
| Trans DNA Marker II | TransGen Biotech | BM411-01 | Used to determine gene size |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo | A36496 | Cas9 protein |
| UniversalGen DNA Kit | Cwbio | CWY004 | For genomic DNA extraction |
| VANNAS Scissors | Electron Microscopy Sciences | 72932-01 | For cutting off the antennae |
| Wheat | To generate wheat seedlings as the food for locusts. Bought from local farmers. | ||
| ZiFiT | Online website for designing sgRNAs, http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx. |
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