Summary
A combinação de transdução vetorial viral e limpeza cerebral usando o método CLARITY permite a investigação de um grande número de neurônios e astrócitos simultaneamente.
Abstract
A combinação de transdução vetorial viral e limpeza tecidual usando o método CLARITY torna possível investigar simultaneamente vários tipos de células cerebrais e suas interações. A transdução vetorial viral permite a marcação de diversos tipos de células em diferentes cores de fluorescência dentro do mesmo tecido. As células podem ser identificadas geneticamente por atividade ou projeção. Usando um protocolo CLARITY modificado, o tamanho potencial da amostra de astrócitos e neurônios cresceu em 2-3 ordens de magnitude. O uso do CLARITY permite a imagem de astrócitos completos, que são muito grandes para caber em sua totalidade em fatias, e o exame do somata com todos os seus processos. Além disso, oferece a oportunidade de investigar a interação espacial entre astrócitos e diferentes tipos de células neuronais, ou seja, o número de neurônios piramihários em cada domínio astrócito ou a proximidade entre astrócitos e populações específicas de neurônios inibitórios. Este artigo descreve, em detalhes, como esses métodos devem ser aplicados.
Introduction
Nos últimos anos, o conhecimento da função astrócito e como eles interagem com circuitos neuronais aumentaram drasticamente. Os astrócitos podem influenciar a plasticidade 1,2, auxiliar na recuperação neuronal da lesãopós-lesão 3,4, e até induzir a potencialização neuronal de novo, com estudos recentes mostrando a importância dos astrócitos na aquisição e recompensa da memória, antes consideradas como funções puramente neuronais 5,6,7 . Uma característica de particular interesse na pesquisa de astrócito é o arranjo espacial das células, que mantêm organizações espaciais únicas no hipocampo e outras estruturas cerebrais 8,9,10. Ao contrário dos dendritos neuronais que se entrelaçam entre somata celular, os astrócitos hipocampais habitam territórios visualmente distinguíveis com ligeira sobreposição entre seus processos, criando domínios distintos 8,11,12,13. As evidências que sustentam a participação de astrócitos em circuitos neuronais não suportam a falta de descrição anatômica detalhada dessas populações e dos neurônios em seus domínios14.
Os procedimentos de transdução de vetores virais, juntamente com animais transgênicos (TG), têm sido popularizados como um acessório para investigar estruturas cerebrais, funções e interações celulares15,16. A utilização de diferentes promotores permite o direcionamento de células específicas de acordo com suas propriedades genéticas, níveis de ativação17,18 ou alvos de projeção. Diferentes vírus podem expressar diferentes fluoroforos coloridos em diferentes populações. Um vírus pode ser combinado com a expressão endógena de fluoroforos em TG, ou animais TG podem ser usados sem a necessidade de vírus. Essas técnicas são amplamente utilizadas para marcação neuronal, e alguns laboratórios começaram a usá-las com modificações especializadas para atingir outros tipos de células, como os astrócitos 5,9,19.
A técnica CLARITY, descrita pela primeira vez em2013 20,21, permite o estudo de fatias cerebrais grossas, tornando todo o cérebro transparente, deixando intactas as estruturas microscópicas. Combinando os dois métodos de transdução vetorial viral e limpeza tecidual- a opção de examinar as interações espaciais entre diferentes populações do tipo celular está agora disponível. A maioria dos estudos de interação astrócito-neurônio foram realizados em finas fatias cerebrais, resultando em imagens de astrócitos incompletos devido a seus grandes domínios, restringindo radicalmente o número de células analisadas. O uso da técnica CLARITY permite a caracterização de resolução unicelular de populações celulares em volumes em larga escala simultaneamente. Imagens fluorescentes marcadas populações de células em cérebros claros não fornecem resolução sináptica, mas permite uma caracterização completa das interações espaciais entre astrócitos e uma variedade de tipos de células neuronais.
Por essa razão, aproveitamos essas técnicas de última geração para investigar as propriedades dos astrócitos em todo o CA1 dorsal, imagens de toda lamina (Estrato Radiatum, camada piramimal e Stratum Oriens). Medimos dezenas de milhares de astrócitos (com penetração viral de >96%5), analisando assim as informações de toda a população astróctica em torno do CA1. Com penetração eficiente dos marcadores neuronais, pudemos registrar as interações entre toda a população de astrócitos ca1 e os quatro tipos de células neuronais-parvalbumina (PV), somatostatina (SST), neurônios inibitórios VIP e células piramipelais excitatórias9.
Vários experimentos foram realizados usando uma combinação de fluorescência de animais TG e vetores virais de cores diferentes (todas as células inibitórias), enquanto outros (excitatório) utilizaram dois vetores virais expressando fluoroforos diferentes sob diferentes promotores9. Este artigo apresenta um protocolo detalhado, incluindo a marcação das células desejadas no cérebro, tornando o cérebro transparente usando um procedimento de CLARIDADE modificado, bem como imagens e análises de estruturas cerebrais completas, utilizando vários procedimentos e softwares.
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Protocol
Os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade Hebraica e atenderam às diretrizes do Guia Nacional de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Transdução de vetor viral
NOTA: A transdução vetorial viral é usada para expressar fluoroforos no cérebro.
- Use um atlas (por exemplo, Allen Brain Atlas) para localizar a coordenação relevante da área alvo.
NOTA: Atlases 3D podem ser encontrados online (por exemplo, http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer). - Usando cirurgia estereotática, injete os vetores virais na estrutura cerebral relevante. Consulte9 para um protocolo detalhado.
- Espere 3-6 semanas para a expressão fluorófora.
NOTA: Um curto período de tempo é suficiente se apenas corpos celulares precisarem ser marcados. Um longo período de tempo será necessário se as projeções axonais forem relevantes para a questão, pois leva mais tempo para os fluoroforos se expressarem em axônios, que podem ter vários milímetros de comprimento. - Validar a especificidade e penetração da expressão fluorófora (tanto de expressão viral quanto de animais TG) de antemão (Figura 1A). Antes de prosseguir com o procedimento CLARITY, designe pelo menos um cérebro para fatias finas e certifique-se de que a expressão fluorforeiro seja forte e específica para o recurso da célula alvo.
2. CLAREZA
NOTA: Este método torna o cérebro transparente dentro de 2-6 semanas.
- Realizar perfusão transcranária em animais usando soro fisiológico frio (PBS), seguido por 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS. Remova o cérebro e mantenha-o em PFA durante a noite a 4 °C em um tubo de 50 mL ou um recipiente semelhante.
NOTA: Antes da perfusão transcranária ser realizada, o animal deve ser profundamente anestesiado. Nos exemplos apresentados neste protocolo, todos os animais foram anestesiados usando cetamina e xylazina (90% e 10%, respectivamente). - Substitua a PFA por Hydrogel Solution (HS; consulte a tabela 1) por 48 h a 4 °C.
NOTA: Não permita que os materiais fiquem mais quentes do que a temperatura de refrigeração (4-8 °C) nesta fase, ou o Hidrogel irá polimerizar. O HS usado neste protocolo contém 2% de acrilamida, ao contrário dos protocolos anteriores que sugerem 4%22 ou 1%17. O benefício de 2% está detalhado na seção de discussão. Ao preparar o HS, trabalhe em uma superfície gelada. Armazene-o a -20 °C. - Desgaseificação
NOTA: O objetivo desta etapa é remover todo o oxigênio livre do tecido, pois O2 interfere no processo de polimerização. Qualquer gásnão-2 pode ser usado (por exemplo, N2, CO2); N2 é recomendado.- Transfira o N2 do tanque através de um tubo flexível de 5 mm (interno), conectado a uma agulha de 19 G na extremidade (Figura 1B).
- Faça dois pequenos furos (agulha-wide) na tampa do tubo: um para introduzir o gás e o outro para permitir que o ar saia do tubo (Figura 1C).
- Conecte o tubo do gás N2 ao tubo e substitua os gases por aproximadamente 30 minutos à temperatura ambiente (RT).
- Remova o tubo e sele imediatamente os orifícios com argila modeladora em cada tubo (Figura 1D).
- Transfira os tubos selados desgaseados para um banho de 37 °C por 3,5 h para polimerizar o HS, que se tornará um gel. Tenha cuidado para não agitar os tubos (Figura 1E).
- Extrair o cérebro do tubo e remover suavemente o gel polimerizado ao seu redor usando lenços de laboratório. Certifique-se de que nenhum gel residual permaneça ligado à superfície do tecido, pois pode reagir com a solução nas etapas seguintes, inibindo o processo de limpeza tecidual (Figura 1F).
NOTA: Como o gel continha PFA, a extração deve ser feita sob um capô de fumaça. - Corte o cérebro se a pergunta em questão exigir apenas uma parte dele. Divida-o ao meio ou em fatias muito grossas que contenham todas as áreas de interesse (Figura 1G).
- Coloque as fatias na Primeira Solução de Compensação (CS1, veja Tabela 2) em um novo recipiente e agite a 70 rpm por 24h a 37 °C.
- Siga os passos descritos abaixo para transferir o cérebro do CS1 para a segunda Solução de Compensação (CS2, ver Tabela 2).
- Prepare um tubo perfurado para o cérebro com antecedência (Figura 1H).
- Pré-aqueça CS2 a 40-45 °C em um béquer grande o suficiente para conter o tubo. Faça isso em uma placa quente com um agitador. Certifique-se de que a temperatura não chegue a 55 °C para evitar o branqueamento das proteínas expressas.
- Coloque o béquer cheio de CS2 e o tubo perfurado em um dispositivo de agitação (um béquer 2 L na Figura 1I). Defina uma taxa de agitação moderada que fará com que o líquido flua sem distorcer o tecido.
NOTA: Dentro de 2-6 semanas, o tecido se tornará transparente (o processo começa na periferia e se move para dentro em direção às estruturas cerebrais centrais). A decisão sobre quando o tecido é "claro o suficiente" cabe ao julgamento pessoal. O cérebro deve ser suficientemente transparente para imagens sob o microscópio sem interferência (Figura 1J não clara o suficiente; Figura 1K clara o suficiente). Superar o ponto em que o tecido é claro o suficiente pode causar perda de rigidez tecidual.
- Transfira de CS2 para PBST (0,5% Triton X-100 em PBS, consulte Tabela 2) em um novo recipiente a 37 °C com leve agitação (70 rpm) por 24 h.
NOTA: No PBST, o tecido ficará esbranquiçado (Figura 1L). A clareza retornará (e melhorará) quando incorporada na Solução de Correspondência de Índices Refrativos (RIMS, ver etapa 2.14). - Substitua o PBST pelo novo PBST. Mantenha-se sob as mesmas condições (37 °C com leve agitação) por mais 24 horas.
- Substitua o PBST novamente pelo novo PBST e mantenha-se no RT por 24 h.
- Transfira para PBS na RT por 24 h.
- Substitua o PBS e deixe em RT por mais 24 h.
- Remova o cérebro da PBS e transfira-o para RIMS a 37 °C durante a noite.
NOTA: Inicialmente, ondulações nas RIMS podem cercar o cérebro. Este protocolo foi projetado e validado utilizando dois RIMS comerciais específicos (ver Tabela 3). No entanto, o protocolo não deve diferir ao usar outros RIMS (comercial ou auto-fabricado). - Mantenha o tecido em RT por mais 24h ou até que a solução atinja o equilíbrio total, ou seja, quando o tecido se tornar transparente, e a solução não contiver mais nenhuma ondulação visível (Figura 1M).
- Se o tecido for transparente, vá para a preparação da câmara. Se neste ponto, o tecido se torna branco em vez de transparente (devido a agregados de moléculas residuais de SDS), limpe a amostra novamente repetindo as etapas 2.9 e 2.10, e transfira o tecido para CS2 (etapa 2.8) por alguns dias, seguido por todas as etapas até o passo 2.15.
3. Preparação da câmara
NOTA: Cada amostra requer um slide com uma câmara de imagem na qual a amostra será colocada.
- Coloque a amostra no meio do slide.
- Usando uma pistola de cola quente, crie paredes nas bordas do escorregador, quase tão alto quanto o tecido. Certifique-se de deixar uma pequena lacuna (aproximadamente 5 mm) em um dos cantos (Figura 2A,B).
- Aplique 1-2 gotas das RIMS na amostra para manter a superfície superior úmida e evitar que bolhas se formem entre a mancha de cobertura e o tecido.
- Imediatamente após a aplicação das gotas rims, adicione a última camada de cola quente às paredes (de modo que atinjam a altura do cérebro/fatia) e progrida imediatamente (enquanto a cola quente ainda é líquida) para o passo 3.5.
- Sele a parte superior com uma mancha de cobertura, colocando-a o mais uniformemente possível na parte superior da camada de cola quente ainda quente (Figura 2C).
- Encha a câmara com as RIMS através da abertura deixada nas paredes de cola quente (Figura 2D,E).
- Feche a lacuna com cola quente. Não deixe ar dentro (Figura 2F).
- Se as paredes de cola quente se estenderem além das bordas do slide, corte as bordas de extensão (Figura 2G).
- Se o objetivo utilizado para a imagem estiver imerso, adicione mais 2-3 mm de cola às paredes acima do deslizamento de cobertura para que a solução de imersão dure por um período mais longo (Figura 2H).
4. Imagem (confocal ou dois fótons)
- Verifique se o palco pode segurar a câmara, pois a espessura da câmara pode atingir vários milímetros.
NOTA: Por exemplo, o microscópio confocal (ver a Tabela de Materiais) utilizado neste protocolo é equipado com várias etapas (por exemplo, circular, retangular). Qualquer etapa escolhida para manter a câmara é irrelevante, desde que seus parâmetros se encaixem nos tamanhos da câmara. - Trabalhe com um objetivo com uma distância de trabalho suficiente, ou seja, uma distância mínima de trabalho ≥3 mm, pois a região de interesse cerebral pode ser de alguns milímetros de profundidade, e o deslizamento de cobertura pode não ser completamente reto como foi colocado manualmente.
NOTA: Como demonstração, os resultados apresentados na Figura 1, Vídeo 1 e Vídeo 2 foram obtidos sob um microscópio de dois fótons usando um objetivo de imersão de água 16x com uma distância de trabalho de 3 mm e ampliação de 2,4 para obter um campo de visão de 652 x 483 μm e uma pilha z com intervalos de 0,937 μm entre os planos. - Realizar imagens de várias áreas, que podem levar algumas horas ou até dias. Certifique-se de que há um amplo armazenamento gratuito no computador, pois o tamanho de cada imagem pode atingir até dezenas de gigabits.
NOTA: A imagem de CLAREZA pode resultar em seções de imagem significativamente mais profundas. Portanto, as intensidades utilizadas para capturar a expressão devem ser relativamente baixas para evitar a superexpressão durante a soma da imagem. - Para obter objetivos de imersão, verifique o líquido rotineiramente durante a imagem e suplemente com líquido adicional, se necessário.
NOTA: Durante a imagem dos dados apresentados no Vídeo 3, a água foi adicionada à superfície da câmara a cada 6-8 h para combater a evaporação. - Depois que a imagem for adquirida, visualize-a e analise-a usando vários pacotes de software diferentes.
NOTA: O software recomendado inclui Imaris e SyGlass para visualização e análise. O pipeline preciso para reconstrução otimizada de astrócitos usando o software Imaris foi descrito anteriormente9. Em suma, as características de Imaris utilizadas neste estudo foram Filamentos para reconstruir totalmente estruturas celulares e Manchas para extrair a posição no espaço de toda a somata.
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Representative Results
A limpeza bem sucedida de fatias de tecido cerebral espessa resulta em uma nova gama de perguntas que podem ser feitas sobre as propriedades de grandes populações celulares em oposição às propriedades de células únicas ou grupos vizinhos de células. Para alcançar resultados bem-sucedidos, deve-se aderir rigorosamente ao protocolo CLARITY, pois há uma ampla gama de parâmetros que precisam ser considerados para reduzir a variância entre as amostras (por exemplo, percentual de clareza, informações de fluorescência, parâmetros de inchaço).
A Figura 1 descreve todo o processo de compensação a partir da validação da expressão de proteína fluorescente através de todas as etapas do método de compensação. A Figura 2 descreve como preparar uma câmara para o tecido clarificado, ideal para imagens sob um microscópio de dois fótons ou confocal. Os materiais exigidos neste protocolo são extremamente baratos em relação a outros protocolos de preparação da câmara.
A Figura 3 apresenta o cubo descrito no Vídeo 1, onde mais de 300 astrócitos são mostrados em uma seção limpa da parte CA1 de um hipocampo de camundongos. A Figura 4 apresenta o cubo descrito no Vídeo 2, onde tanto os astrócitos quanto a somata neuronal excitatória são mostrados em tecido transparente espesso. A Figura 5 apresenta um hemisfério inteiro, como descrito no Vídeo 3. Projeções neuronais em todo o cérebro são exibidas a partir do CA1 dorsal (verde, GFP) e do CA1 ventral (vermelho, TdTomato).
O vídeo 1 apresenta uma imagem grossa de astrócitos hipocampais (>300) adquiridos com um microscópio de dois fótons após um procedimento CLARITY. A fluorescência foi fornecida por transdução vetorial viral específica para astrócitos. O vídeo 2 apresenta a proximidade espacial entre os astrócitos e os núcleos das células piramimonais hipocampais. O vídeo 3 rastreia pacotes axonais em todo o hemisfério; axônios projetam-se a partir do córtex motor primário e são rastreados de volta da medula espinhal. Outro pacote é rastreado do hipocampo dorsal em direção aos corpos supra mammillary. Por último, ele traça um feixe vermelho de axônios dos corpos mammillary em direção à sua origem no hipocampo ventral. Todas as células marcadas são exclusivamente excitatórias.
Figura 1: Descrição detalhada do processo de compensação. (A) Validação da expressão fluorófora. Neste exemplo, todos os astrócitos da parte CA1 de um hipocampo de camundongos expressam uma proteína vermelha (TdTomato, imagem em magenta), e todos os neurônios excitatórios expressam uma proteína verde em seus núcleos (H2B-GFP). Esta imagem foi adquirida usando um microscópio de 2 fótons. A imagem foi tirada utilizando um objetivo de imersão hídrica 16x (0,8 NA) com ampliação de 2,4 para obter um campo de visão de 652 x 483 μm, a 15,5 quadros/s e uma pilha z com intervalos de 0,937 μm entre os planos. A especificidade e penetração foram verificadas pela imunohistoquímica9. (B) Transferir o gás N2 do tanque para o tubo que segura o cérebro requer um tubo com uma agulha no final. (C) O ar dentro do tubo é substituído por N2 , criando dois orifícios, um (seta superior) para a entrada de N2através da agulha conectada à tubulação do tanque de gás e outra (seta inferior) para saída. (D) Cobrir os orifícios com argila de modelagem imediatamente após a desgaseamento impede que o N2 saia do tubo. (E) Aquecimento da solução desgaseada por 3,5 h em um banho quente. (F) Polimerização bem sucedida resulta em um cérebro embutido em HS gelled. Bolhas de gás podem estar presas no polímero. (G) Imediatamente após a extração do gel é o melhor ponto para o cérebro ser cortado na espessura desejada. (H) Os tubos perfurados permitem que o fluxo da solução no agitador chegue à amostra. (I) Cérebros dentro de tubos perfurados são mantidos verticalmente por um suporte auto-feito de um tamanho feito para caber um béquer 2 L, em pé sobre um agitador de placa quente. (J) Exemplo de um cérebro que não é claro o suficiente. A amostra deve ser agitada no CS2 por aproximadamente mais uma semana. (K) Exemplo de um cérebro suficientemente claro. (L) Ao inserir o cérebro claro no PBST, o tecido fica mais branco do que antes. Esta mudança de cor é devido ao Tritão e desaparecerá quando movido desta solução para a próxima. (M) Depois de >24 h nas RIMS, o cérebro se tornará totalmente transparente novamente. Abreviaturas: GFP = proteína fluorescente verde; NA = abertura numérica; HS = solução de hidrogel; CS2 = Solução de Compensação 2; PBST = Soro fisiológico tamponado com fosfato contendo 0,5% Triton X-100; RIMS = Solução de correspondência de índices de refração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Preparação da câmara. (A) A primeira camada de paredes de cola quente cobre as bordas de um slide e deixa um espaço largo o suficiente para conter o cérebro sem tocar nas paredes. Um buraco é deixado no canto superior esquerdo do slide. (B) Adicionar camada após camada para atingir a altura do tecido. (C) A mancha de cobertura reta (seta branca) sela a câmara. (D) Câmara cheia de RIMS através do orifício nas paredes da câmara. (E) A câmara está cheia de RIMS sem bolhas de ar. (F) Selar o orifício na câmara com cola quente para evitar qualquer vazamento. Vista lateral. (G) Nesta fase, qualquer remanescente de cola quente que se estenda sobre as bordas do slide deve ser cortado da câmara. (H) Câmara totalmente preparada, pronta para imagem sob o microscópio. Abreviação: RIMS = Solução de correspondência de índices refrativos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Todos os astrócitos imaged (AAV1-GFAP::TdTomato, vermelho) em um hipocampo limpo. Um único quadro do Vídeo 1 capturando todos os astrócitos imaged (AAV1-GFAP:::TdTomato, vermelho) em um hipocampo limpo. Todos os detalhes das propriedades da imagem são descritos no Vídeo 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Astrocitos (AAV1-GFAP::TdTomato, vermelho) e núcleos de células piramida hipocampal (AAV5-CaMKII:::H2B-eGFP, verde) em tecido transparente espesso. Um único quadro do Vídeo 2 mostrando ambos os astrócitos (AAV1-GFAP:::TdTomato, vermelho) e núcleos de células piramida hipocampal (AAV5-CaMKII:::H2B-eGFP, verde) em tecido transparente espesso. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Axônios verdes (AAV5-CaMKII:::eGFP, verde) e axônios vermelhos (AAV5-CaMKII:::TdTomato). Um único quadro do Vídeo 3 mostrando ambos os tipos de axônios derivados de vários locais em um cérebro de rato que pode ser rastreado em todo um hemisfério. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: Imagens de >1 mm de espessura de astrócitos de CA1 dorsais hipocampal (AAV1-GFAP::TdTomato, vermelho). O vídeo foi adquirido com um microscópio de dois fótons usando um objetivo de 16x (0,8 NA) com ampliação de 2,4 após um procedimento CLARITY. Semelhante à Figura 1A, o intervalo de pilha de z foi definido para 0,937 μm. A fluorescência foi fornecida por transdução vetorial viral específica para astrócitos. O número de astrócitos neste cubo é >300, e a maioria dos processos estão disponíveis para análise na maioria das células. Abreviaturas: NA = abertura numérica; AAV = vírus associado ao adeno; GFAP = proteína ácida fibrilar gliana. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 2: Astrocitos e núcleos de neurônios excitatórios em um cubo 3D. O cubo contém toda a lâmina do dCA1 sob as condições ópticas mencionadas para figura 1A e vídeo 1. Este cubo exibe a proximidade espacial entre os astrócitos (AAV1-GFAP:::TdTomato, vermelho) e os núcleos das células piramifecionais hipocampais (AAV5-CaMKII:::H2B-eGFP, verde). Abreviaturas: AAV = vírus associado ao adeno; GFAP = proteína ácida fibrilar gliana; CAMKII = proteína dependente de cálcio/calmodulina quinase II; eGFP = proteína fluorescente verde aprimorada; H2B = histone 2B. Clique aqui para baixar este Vídeo.
Vídeo 3: Traçando pacotes axonais em um hemisfério inteiro. Axônios verdes (AAV5-CaMKII::eGFP, verde) terminando na medula espinhal são facilmente rastreados até o córtex motor primário (mais de 7 mm de distância). Do hipocampo (lado dorsal), outro feixe é traçado em direção aos corpos Supra Mammillary (lado mais ventral do cérebro), um traço de quase 3 mm de comprimento. A segunda metade do vídeo traça um feixe vermelho de axônios (AAV5-CaMKII::tdTomato) originário do hipocampo ventral de volta de seu local alvo nos corpos mammillary. A imagem foi tirada sob um microscópio confocal de varredura do Olympus FV1000 usando um objetivo 4x (0.16 NA), e vários ROIs foram combinados usando o recurso MATL FluoView para apresentar todo o hemisfério. Abreviaturas: AAV = vírus associado ao adeno; CAMKII = proteína dependente de cálcio/calmodulina quinase II; eGFP = proteína fluorescente verde aprimorada; NA = abertura numérica; MATL = lapso de tempo de área múltipla. Clique aqui para baixar este vídeo.
| Solução de hidrogel (1 L) | |
| Material | Quantidade |
| Iniciador VA-044 | 2,5 g |
| PFA 4% | 900 mL |
| Acrilamida (40%) | 50 mL |
| Bisacrilamida (2%) | 50 mL |
Tabela 1: Preparação da solução de hidrogel (1 L). A solução de hidrogel deve ser preparada em uma superfície gelada. A ordem em que os ingredientes são misturados não é importante. Note que a porcentagem total de acrilamida é de 2% ao contrário de protocolos similares que usam 1%17 ou 4%22.
| Soluções de compensação (1 L) | ||
| Material | Quantidade | |
| CS1 | CS2 | |
| Ácido bórico (M.W. = 61,83 g/mol) | 12.366 g | 3,4 g |
| SDS | 80 g | 80 g |
| Base tris (M.W. = 121,14 g/mol) | 0 | 12,1 g |
| Água Destilada (DW) | Preencha para 1 L | Preencha para 1 L |
| Naoh | pH 8,5 | |
| 1 L de Salina tamponada com 0,5% Triton X-100 | ||
| Material | Quantidade | |
| QB2 | 995 mL | |
| Tritão X-100 | 5 mL | |
Tabela 2: Preparação das soluções de compensação 1 e 2 (1 L) e 1 L de Salina tamponada com 0,5% Triton X-100. As soluções de compensação podem ser preparadas com antecedência e mantidas em temperatura ambiente por um longo período. Qualquer solução que contenha ácido bórico e SDS deve ser manuseada sob uma capa de fumaça para evitar inalação ou contato com a pele com SDS ou ácido bórico. O NaOH em CS1 deve ser adicionado por último para definir o pH em 8.5. Cada amostra cerebral deve ser colocada em pelo menos 5-25 mL de CS1 e mantida durante a noite para difusão suficiente. Abreviaturas: CS1 = solução de compensação 1; SDS = sulfato de dodecyl de sódio; M.W. = peso molecular.
| Nome do produto | Vantagem primária | Desvantagem primária |
| RapiClear | A amostra permanece transparente | Inchaço tecidual |
| RapiClear CS | A amostra encolhe de volta ao tamanho normal | Amostra pode perder transparência |
Tabela 3: OPÇÕES RIMS com vantagens e desvantagens. Rapiclear (RC, RI = 1,47) ou Rapiclear específico da CLARIDADE (CSRC, RI = 1,45). A principal diferença entre essas duas soluções é que, enquanto o CSRC reduz o cérebro claro de volta ao seu tamanho original, a solução RC não, deixando a amostra limpa ligeiramente inchada. Abreviação: RI = índice refrativo.
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Discussion
Os métodos de limpeza de tecidos apresentam uma ferramenta revolucionária na pesquisa cerebral, convidando perguntas que não poderiam ter sido feitas anteriormente. A partir do direcionamento das propriedades de um pequeno grupo de células, uma única célula, ou mesmo uma única sinapse, a CLARITY agora permite o direcionamento de populações celulares totais ou recursos de conectividade de longo alcance usando fluoroforos relevantes.
O resultado da combinação de procedimentos fluorforhore e CLARITY não é binário; muitos fatores podem interferir no procedimento que leva a resultados subótimos. Em primeiro lugar, a expressão fluorforeiro deve ser verificada com antecedência. Como o procedimento CLARITY causa alguma perda de informações, a expressão suficiente da proteína fluorforeiro é crucial para a validade da imagem no final do processo CLARITY. Em segundo lugar, a perfusão transcranal deve ser tratada com cuidado, garantindo que todo o sangue saia do cérebro, porque a autofluorescência do sangue levará a dados não confiáveis em fatias grossas. Em terceiro lugar, todos os parâmetros discutidos no protocolo devem ser tratados em cada etapa do processo de compensação com precisão, por exemplo, resíduo de O2 no HS antes que a polimerização ou imprecisão da temperatura em cada etapa impeça a reação química entre os materiais ativos.
Protocolos anteriores17,22 recomendam diferentes concentrações de acrilamida no HS. O objetivo principal da acrilamida é fixar melhor as moléculas com resíduos de amina (proteínas e ácidos nucleicos). Pequenas alterações na concentração impactam muito todo o processo de compensação: se a fixação for muito compacta, as moléculas lipídicas não se desconectarão do tecido, e o processo de limpeza será desnecessariamente prolongado ou resultará em cérebros opacos. Concentrações mais baixas de acrilamida, no entanto, não manterão adequadamente a estrutura cerebral uma vez desprovida de lipídios. Neste protocolo, o percentual de acrilamida é definido para fornecer o delicado equilíbrio do tecido fixado, mas claro.
A maior parte do processo de compensação ocorre em CS2, e o nível de clareza tecidual deve ser testado diariamente. A limpeza do PBST é um passo essencial entre as soluções de compensação e as soluções de correspondência de índices de refração, pois limpa as moléculas residuais de SDS, que podem interagir com as RIMS. Também é possível manter o tecido claro no PBST (0,5%) indefinidamente se a preparação da câmara ainda não for necessária.
Ao colocar o cérebro nos RIMS, deve-se familiarizar-se com os benefícios e limitações das soluções. Por exemplo, o RapiClear causará total transparência mesmo em tecidos quase limpos, mas também causará algum inchaço, que não deve ser negligenciado ao analisar os dados. As medidas anteriores9 sugerem expansão igual ao longo de todos os eixos (ou seja, eixos dorsoventral, anterior-posterior e lateral-medial), possibilitando calcular o índice de inchaço em comparação com fatias finas da mesma região cerebral. O uso do RapiClear específico da CLARITY elimina o inchaço; no entanto, se alguma sobra de SDS permanecer no tecido, elas se agregarão em massas não transparentes.
Outro benefício deste protocolo modificado é o seu custo. Protocolos anteriores sugerem diferentes tipos de cola para criar uma câmara que possa segurar o cérebro em RIMS. Neste protocolo, simplesmente usamos cola quente. Ele não reage com as soluções, está disponível para compra em todos os lugares, é fácil de usar, e é significativamente mais barato do que as colas sugeridas antes.
Dados adquiridos a partir da imagem de amostras cerebrais espessas podem descrever populações celulares inteiras, conectividade entre estruturas cerebrais ou o rastreamento de um único axônio em grandes distâncias (Vídeo 3). Embora as perguntas sobre essas características tenham sido feitas antes, a validade dos dados agora alcançáveis usando fatias cerebrais grossas melhora muito em relação aos métodos anteriores, propensos a erros, de sobreposição de imagem de fatia fina.
O processo CLARITY concede uma limpeza bem sucedida e uniforme de fatias grossas de vários milímetros até imagens cerebrais completas. A compensação passiva (ou seja, não utilizando ETC) diminui o risco de dano ao tecido, e o tempo para o qual as amostras estão imersas em soluções de compensação para que não afete a alta eficiência da conservação de proteínas.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Este projeto recebeu financiamento do Conselho Europeu de Pesquisa (ERC) no âmbito do programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia (acordo de subvenção nº 803589), da Fundação Israelenta (isf grant nº 1815/18) e das bolsas Canadá-Israel (CIHR-ISF, conceder nº 2591/18). Agradecemos a Nechama Novick por comentar todo o manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV1-GFAP::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect astrocytes | |
| AAV5-CaMKII::eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| AAV5-CaMKII::H2B-eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neuronal nuclei | |
| AAV5-CaMKII::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| Acrylamide (40%) | Bio-rad | #161-0140 | |
| Bisacrylamide (2%) | Bio-rad | #161-0142 | |
| Boric acid | Sigma | #B7901 | Molecular weight - 61.83 g/mol |
| Confocal microscope, scanning, FV1000 | Olympus | 4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA) | |
| Imaris software | Bitplane, UK | A software that allows 3D analysis of images | |
| NaOH | Sigma | #S5881 | |
| PBS | |||
| PFA 4% | EMS | #15710 | |
| RapiClear | SunJin lab | #RC147002 | |
| RapiClear CS | SunJin lab | #RCCS002 | |
| SDS | Sigma | #L3771 | |
| SyGlass software | A software that allows 3D analysis of images using virtual reality | ||
| Tris base 1 M | Bio-rad | #002009239100 | Molecular weight - 121.14 g/mol |
| Triton X-100 | ChemCruz | #sc-29112A | |
| Two photon microscope | Neurolabware | Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA) | |
| VA-044 Initiator | Wako | #011-19365 |
References
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