Summary
CLARITY yöntemini kullanarak viral vektör iletimini ve beyin temizlemeyi birleştirmek, aynı anda çok sayıda nöron ve astrositin araştırılmasına izin verir.
Abstract
CLARITY yöntemini kullanarak viral vektör iletimini ve doku temizlemeyi birleştirmek, aynı anda birkaç beyin hücresi türünü ve etkileşimlerini araştırmayı mümkün kılar. Viral vektör iletimi, aynı doku içinde farklı floresan renklerinde farklı hücre tiplerinin işaretlenmesini sağlar. Hücreler genetik olarak aktivite veya projeksiyon ile tanımlanabilir. Modifiye edilmiş bir CLARITY protokolü kullanarak, astrositlerin ve nöronların potansiyel örneklem büyüklüğü 2-3 büyüklük sırasına göre büyümüştür. CLARITY kullanımı, dilimler halinde bütününe sığmayacak kadar büyük olan astrositlerin tamamının görüntülenmesini ve somatanın tüm işlemleriyle incelenmesini sağlar. Ek olarak, astrositler ve farklı nöronal hücre tipleri arasındaki mekansal etkileşimi, yani her astrositik alandaki piramidal nöronların sayısını veya astrositler ile spesifik inhibitör nöron popülasyonları arasındaki yakınlığı araştırma fırsatı sunar. Bu makale, bu yöntemlerin nasıl uygulanacağını ayrıntılı olarak açıklamaktadır.
Introduction
Son yıllarda, astrosit fonksiyonu ve nöronal devrelerle nasıl etkileşime girdikleri bilgisi çarpıcı bir şekilde artmıştır. Astrositler plastisiteyi etkileyebilir 1,2, nöronal yaralanma sonrası iyileşmeye yardımcı olabilir3,4 ve hatta astrositlerin hafıza edinimi ve ödülündeki önemini gösteren son çalışmalarla, daha önce tamamen nöronal fonksiyonlar olarak kabul edilen 5,6,7 . Astrosit araştırmalarında özellikle ilgi çekici bir özellik, hipokampus ve diğer beyin yapılarında benzersiz mekansal organizasyonları koruyan hücrelerin mekansal düzenlemesidir 8,9,10. Hücre somataları arasında iç içe geçen nöronal dendritlerin aksine, hipokampal astrositler, süreçleri arasında hafif örtüşme ile görsel olarak ayırt edilebilir bölgelerde yaşarlar ve farklı alanlar yaratırlar 8,11,12,13. Astrositlerin nöronal devrelere katılımını destekleyen kanıtlar, bu tür popülasyonların ve alanlarındaki nöronların ayrıntılı anatomik tanımının eksikliğini desteklememektedir14.
Viral vektör transdüksiyon prosedürleri, transgenik hayvanlarla (TG) birlikte, beyin yapılarını, fonksiyonlarını ve hücre etkileşimlerini araştırmak için bir araç seti olarak popülerleştirilmiştir15,16. Farklı promotörlerin kullanılması, spesifik hücrelerin genetik özelliklerine, aktivasyon seviyelerine17,18 veya projeksiyon hedeflerine göre hedeflenmesini sağlar. Farklı virüsler, farklı popülasyonlarda farklı renkli floroforları ifade edebilir. Bir virüs, TG'deki floroforların endojen ekspresyonu ile birleştirilebilir veya TG hayvanları virüslere ihtiyaç duymadan kullanılabilir. Bu teknikler nöronal işaretleme için yaygın olarak kullanılmaktadır ve bazı laboratuvarlar bunları astrositler 5,9,19 gibi diğer hücre tiplerini hedeflemek için uzmanlaşmış modifikasyonlarla kullanmaya başlamıştır.
İlk olarak 201320,21'de tanımlanan CLARITY tekniği, mikroskobik yapıları sağlam bırakırken tüm beyni şeffaf hale getirerek kalın beyin dilimlerinin incelenmesini sağlar. İki yöntemi birleştirerek - viral vektör transdüksiyonu ve doku temizliği - farklı hücre tipi popülasyonları arasındaki uzamsal etkileşimleri inceleme seçeneği artık mevcuttur. Çoğu astrosit-nöron etkileşimi çalışması ince beyin dilimleri üzerinde gerçekleştirildi, bu da büyük alanları nedeniyle tamamlanmamış astrositlerin görüntüleriyle sonuçlandı ve böylece analiz edilen hücrelerin sayısını radikal bir şekilde kısıtladı. CLARITY tekniğinin kullanılması, aynı anda büyük ölçekli hacimlerde hücre popülasyonlarının tek hücreli çözünürlük karakterizasyonuna izin verir. Berrak beyinlerde floresan olarak etiketlenmiş hücre popülasyonlarının görüntülenmesi sinaptik çözünürlük sağlamaz, ancak astrositler ve çeşitli nöronal hücre tipleri arasındaki uzamsal etkileşimlerin kapsamlı bir şekilde karakterize edilmesine izin verir.
Bu nedenle, astrositlerin dorsal CA1 boyunca özelliklerini araştırmak ve tüm laminaları (Stratum Radyatum, piramidal tabaka ve Stratum Oriens) görüntülemek için bu son teknoloji teknikleri kullandık. On binlerce astrositi ölçtük (viral penetransı >% 965 ile), böylece CA1 çevresindeki tüm astrositik popülasyonun bilgilerini analiz ettik. Nöronal belirteçlerin etkili penetransı ile, CA1 astrositlerinin tüm popülasyonu ile dört tip nöronal hücre-parvalbümin (PV), somatostatin (SST), VIP inhibitör nöronlar ve uyarıcı piramidal hücreler arasındaki etkileşimleri kaydedebiliriz9.
TG hayvanlarından floresan ve farklı renkli viral vektörlerin (tüm inhibitör hücreler) bir kombinasyonu kullanılarak çeşitli deneyler yapılırken, diğerleri (uyarıcı) farklı promotörler altında farklı floroforları ifade eden iki viral vektör kullandı9. Bu makale, beyinde istenen hücrelerin etiketlenmesi, değiştirilmiş bir CLARITY prosedürü kullanılarak beynin şeffaf hale getirilmesinin yanı sıra çeşitli prosedürler ve yazılımlar kullanarak tüm beyin yapılarının görüntülenmesi ve analiz edilmesi de dahil olmak üzere ayrıntılı bir protokol sunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deneysel protokoller İbrani Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı ve Ulusal Sağlık Enstitüsü Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nun yönergelerini karşıladı.
1. Viral vektör transdüksiyonu
NOT: Viral vektör iletimi, beyindeki floroforları eksprese etmek için kullanılır.
- Hedef alanın ilgili koordinasyonunu bulmak için bir atlas (örneğin, Allen Beyin Atlası) kullanın.
NOT: 3B atlaslar çevrimiçi olarak bulunabilir (örneğin, http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer). - Stereotaktik cerrahi kullanarak, viral vektörleri ilgili beyin yapısına enjekte edin. Ayrıntılı bir protokol için9'a bakın.
- Florofor ekspresyonu için 3-6 hafta bekleyin.
NOT: Sadece hücre gövdelerinin işaretlenmesi gerekiyorsa kısa bir süre yeterlidir. Aksonal projeksiyonlar soruyla ilgiliyse, floroforların birkaç milimetre uzunluğunda olabilen aksonlarda eksprese edilmesi daha uzun sürdüğü için uzun bir süreye ihtiyaç duyulacaktır. - Florofor ekspresyonunun (hem viral ekspresyon hem de TG hayvanlarının) özgüllüğünü ve penetransını önceden doğrulayın (Şekil 1A). CLARITY prosedürüne geçmeden önce, ince dilimler için en az bir beyin belirleyin ve florofor ekspresyonunun hem güçlü hem de hedef hücre özelliğine özgü olduğundan emin olun.
2. NETLİK
NOT: Bu yöntem beyni 2-6 hafta içinde saydam hale getirir.
- Soğuk Fosfat tamponlu Salin (PBS) ve ardından PBS'de% 4 Paraformaldehit (PFA) kullanarak hayvanlar üzerinde transkraniyal perfüzyon uygulayın. Beyni çıkarın ve 50 mL'lik bir tüp veya benzeri bir kapta 4 ° C'de gece boyunca PFA'da tutun.
NOT: Transkraniyal perfüzyon yapılmadan önce, hayvan derin anestezi altına alınmalıdır. Bu protokolde sunulan örneklerde, tüm hayvanlar Ketamin ve Ksilazin (sırasıyla% 90 ve% 10) kullanılarak uyuşturulmuştur. - PFA'yı 4 °C'de 48 saat boyunca Hidrojel Çözeltisi (HS; bakınız Tablo 1) ile değiştirin.
NOT: Bu aşamada malzemelerin soğutma sıcaklığından (4-8 ° C) daha sıcak olmasına izin vermeyin, aksi takdirde Hidrojel polimerize olur. Bu protokolde kullanılan HS, önceki protokollerin aksine% 4 veya% 17 öneren% 2 akrilamid içerir. %2'nin faydası tartışma bölümünde detaylandırılmıştır. HS'yi hazırlarken, buz gibi soğuk bir yüzey üzerinde çalışın. -20 °C'de saklayın. - Gazdan arındırma
NOT: Bu aşamanın amacı,O2 polimerizasyon işlemine müdahale ettiği için dokudaki tüm serbest oksijeni uzaklaştırmaktır. O2 olmayan herhangi bir gaz kullanılabilir (örneğin, N 2, CO2); N2 önerilir.- N2'yi , ucundaki 19 G'lik bir iğneye bağlı 5 mm'lik (iç) esnek bir boru ile tanktan aktarın (Şekil 1B).
- Tüpün kapağında iki küçük delik (iğne genişliğinde) açın: biri gazı sokmak için, diğeri havanın tüpten ayrılmasına izin vermek için (Şekil 1C).
- BoruyuN2 gazından tüpe takın ve gazları oda sıcaklığında (RT) yaklaşık 30 dakika boyunca değiştirin.
- Boruyu çıkarın ve delikleri hemen her tüpte modelleme kili ile kapatın (Şekil 1D).
- Gazdan arındırılmış sızdırmaz tüpleri, bir jel haline gelecek olan HS'yi polimerize etmek için 3,5 saat boyunca 37 ° C'lik bir banyoya aktarın. Tüpleri sallamamaya dikkat edin (Şekil 1E).
- Beyni tüpten çıkarın ve laboratuvar mendilleri kullanarak polimerize jeli etrafından yavaşça çıkarın. Doku yüzeyine bağlı artık jel kalmadığından emin olun, çünkü aşağıdaki adımlarda çözelti ile reaksiyona girerek doku temizleme işlemini inhibe edebilir (Şekil 1F).
NOT: Jel PFA içerdiğinden, ekstraksiyon bir duman başlığı altında yapılmalıdır. - Eldeki soru sadece bir kısmını gerektiriyorsa beyni dilimleyin. Ikiye veya tüm ilgi alanlarını içeren çok kalın dilimlere bölün (Şekil 1G).
- Dilimleri Birinci Temizleme Çözeltisine (CS1, bakınız Tablo 2) yeni bir kaba yerleştirin ve 37 °C'de 24 saat boyunca 70 rpm'de çalkalayın.
- Beyni CS1'den ikinci Temizleme Çözümüne aktarmak için aşağıda açıklanan adımları izleyin (CS2, bkz. Tablo 2).
- Beyin için önceden delikli bir tüp hazırlayın (Şekil 1H).
- CS2'yi tüpü içerecek kadar büyük bir beherde 40-45 °C'ye kadar önceden ısıtın. Bunu karıştırıcılı bir ocakta yapın. İfade edilen proteinlerin ağartılmasını önlemek için sıcaklığın 55 ° C'ye ulaşmadığından emin olun.
- CS2 ile doldurulmuş beheri ve delikli tüpü bir karıştırma cihazına ( Şekil 1I'de 2 L beher) yerleştirin. Sıvının dokuyu bozmadan akmasına neden olacak ılımlı bir karıştırma hızı ayarlayın.
NOT: 2-6 hafta içinde doku saydam hale gelecektir (süreç çevreden başlar ve merkezi beyin yapılarına doğru içe doğru hareket eder). Dokunun ne zaman "yeterince açık" olduğuna dair karar kişisel yargıya bağlıdır. Beyin, mikroskop altında girişim olmadan görüntüleme için yeterince şeffaf olmalıdır (Şekil 1J yeterince açık değildir; Şekil 1K yeterince açık). Dokunun yeterince berrak olduğu noktanın aşılması doku sertliğinin kaybına neden olabilir.
- CS2'den PBST'ye (PBS'de %0,5 Triton X-100, bakınız Tablo 2) 37 °C'de yeni bir kapta 24 saat boyunca hafif sarsıntı (70 rpm) ile aktarın.
NOT: PBST'de doku beyazımsı hale gelecektir (Şekil 1L). Netlik, Kırılma İndisi Eşleştirme Çözümüne (RIMS, bkz. adım 2.14) yerleştirildiğinde geri döner (ve iyileşir). - PBST'yi yeni PBST ile değiştirin. Aynı koşullar altında (hafif sallanma ile 37 ° C) 24 saat daha saklayın.
- PBST'yi tekrar yeni PBST ile değiştirin ve RT'de 24 saat boyunca saklayın.
- RT'de PBS'ye 24 saat boyunca aktarın.
- PBS'yi değiştirin ve RT'de 24 saat daha bekletin.
- Beyni PBS'den çıkarın ve gece boyunca 37 ° C'de RIMS'ye aktarın.
NOT: Başlangıçta, RIMS'deki dalgalanmalar beyni çevreleyebilir. Bu protokol iki özel ticari RIMS kullanılarak tasarlanmış ve doğrulanmıştır (bkz. Tablo 3). Bununla birlikte, protokol diğer RIM'leri (ticari veya kendi kendine yapılan) kullanırken farklılık göstermemelidir. - Dokuyu RT'de 24 saat daha veya çözelti tam dengeye ulaşana kadar, yani doku şeffaf hale geldiğinde ve çözelti artık görünür dalgalanmalar içermediğinde tutun (Şekil 1M).
- Doku şeffaf ise, oda hazırlığına devam edin. Bu noktada, doku şeffaf yerine beyaz hale gelirse (artık SDS moleküllerinin agregaları nedeniyle), 2.9 ve 2.10 adımlarını tekrarlayarak numuneyi tekrar temizleyin ve dokuyu birkaç gün boyunca CS2'ye (adım 2.8) aktarın, ardından adım 2.15'e kadar tüm adımları izleyin.
3. Oda hazırlığı
NOT: Her numune, numunenin yerleştirileceği görüntüleme odasına sahip bir slayt gerektirir.
- Örneği slaytın ortasına yerleştirin.
- Sıcak bir tutkal tabancası kullanarak, slaytın kenarlarında, neredeyse doku kadar yüksek duvarlar oluşturun. Köşelerden birinde küçük bir boşluk (yaklaşık 5 mm) bıraktığınızdan emin olun (Şekil 2A,B).
- Üst yüzeyi nemli tutmak ve kapak kayması ile doku arasında kabarcıklar oluşmasını önlemek için numuneye 1-2 damla RIMS uygulayın.
- RIMS damlalarını uyguladıktan hemen sonra, duvarlara son sıcak yapıştırıcı tabakasını ekleyin (böylece beynin / dilimin yüksekliğine ulaşırlar) ve hemen (sıcak tutkal hala sıvı iken) adım 3.5'e ilerleyin.
- Üstünü bir kapak kayması ile kapatın, hala ılık sıcak tutkal tabakasının üstüne mümkün olduğunca eşit bir şekilde yerleştirin (Şekil 2C).
- Odayı sıcak tutkal duvarlarında kalan boşluktan RIMS ile doldurun (Şekil 2D, E).
- Boşluğu sıcak tutkalla kapatın. İçeride hava bırakmayın (Şekil 2F).
- Sıcak tutkal duvarları kızağın kenarlıklarının ötesine uzanıyorsa, uzatma kenarlarını kesin (Şekil 2G).
- Görüntüleme için kullanılan objektif daldırılırsa, daldırma çözeltisinin daha uzun süre dayanması için kapak kaymasının üzerindeki duvarlara 2-3 mm yapıştırıcı daha ekleyin (Şekil 2H).
4. Görüntüleme (konfokal veya iki foton)
- Odanın kalınlığı birkaç milimetreye ulaşabileceğinden, sahnenin odayı tutup tutamayacağını kontrol edin.
NOT: Örneğin, bu protokolde kullanılan konfokal mikroskop ( Malzeme Tablosuna bakınız) birkaç aşama (örneğin, dairesel, dikdörtgen) ile donatılmıştır. Odayı tutmak için hangi aşama seçilirse seçilsin, parametreleri oda boyutlarına uyduğu sürece önemsizdir. - Yeterli bir çalışma mesafesine, yani 3 mm'≥ minimum çalışma mesafesine sahip bir hedefle çalışın, çünkü ilgilenilen beyin bölgesi birkaç milimetre derinlikte olabilir ve kapak kayması manuel olarak yerleştirildiği gibi tamamen düz olmayabilir.
NOT: Bir gösterim olarak, Şekil 1, Video 1 ve Video 2'de sunulan sonuçlar, 652 x 483 μm görüş alanı ve düzlemler arasında 0.937 μm aralıklarla bir z-yığını elde etmek için 3 mm çalışma mesafesi ve 2.4 büyütme ile bir su daldırma 16x hedefi kullanılarak iki fotonlu bir mikroskop altında elde edilmiştir. - Birkaç saat hatta günler sürebilen çok alanlı görüntüleme gerçekleştirin. Her görüntünün boyutu onlarca gigabit'e kadar ulaşabileceğinden, bilgisayarda bol miktarda boş depolama alanı olduğundan emin olun.
NOT: CLARITY görüntüleme, derinlikte önemli ölçüde daha fazla görüntü bölümüne neden olabilir. Bu nedenle, görüntü toplama sırasında aşırı ifadeyi önlemek için ifadeyi yakalamak için kullanılan yoğunluklar nispeten düşük olmalıdır. - Daldırma hedefleri için, görüntüleme sırasında sıvıyı rutin olarak kontrol edin ve gerekirse ek sıvı ile destekleyin.
NOT: Video 3'te sunulan verilerin görüntülenmesi sırasında, buharlaşmayla mücadele etmek için odanın yüzeyine her 6-8 saatte bir su eklenmiştir. - Görüntü alındıktan sonra, birkaç farklı yazılım paketi kullanarak görüntüleyin ve analiz edin.
NOT: Önerilen yazılım, hem görselleştirme hem de analiz için Imaris ve SyGlass'ı içerir. Imaris yazılımı kullanılarak astrositlerin optimize edilmiş rekonstrüksiyonu için hassas boru hattı daha önce9 olarak tanımlanmıştır. Kısacası, bu çalışmada kullanılan Imaris özellikleri, hücre yapılarını tamamen yeniden yapılandırmak için Filamentler ve tüm somataların uzayındaki pozisyonu çıkarmak için Lekelerdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kalın beyin dokusu dilimlerinin başarılı bir şekilde temizlenmesi, tek hücrelerin veya komşu hücre gruplarının özelliklerinin aksine, büyük hücre popülasyonlarının özellikleri hakkında sorulabilecek yeni bir dizi soruyla sonuçlanır. Başarılı sonuçlar elde etmek için, numuneler arasındaki varyansı azaltmak için dikkate alınması gereken çok çeşitli parametreler olduğundan (örneğin, berraklık yüzdesi, floresan bilgisi, şişlik parametreleri) CLARITY protokolüne kesinlikle uyulmalıdır.
Şekil 1 , floresan protein ekspresyon doğrulamasından temizleme yönteminin tüm aşamalarına kadar tüm temizleme işlemini açıklamaktadır. Şekil 2 , iki fotonlu veya konfokal mikroskop altında görüntüleme için en uygun olan berraklaştırılmış doku için bir odanın nasıl hazırlanacağını açıklamaktadır. Bu protokolde gerekli olan malzemeler, diğer oda hazırlama protokollerine göre son derece ucuzdur.
Şekil 3 , bir fare hipokampusunun CA1 kısmının temizlenmiş bir bölümünde 300'den fazla astrositin gösterildiği Video 1'de açıklanan küpü sunmaktadır. Şekil 4 , hem astrositlerin hem de uyarıcı nöronal somataların kalın şeffaf dokuda gösterildiği Video 2'de açıklanan küpü sunmaktadır. Şekil 5 , Video 3'te açıklandığı gibi tüm yarım küreyi göstermektedir. Beyin çapında nöronal projeksiyonlar dorsal CA1 (yeşil, GFP) ve ventral CA1'den (kırmızı, TdTomato) görüntülenir.
Video 1 , bir CLARITY prosedüründen sonra iki fotonlu mikroskopla elde edilen hipokampal astrositlerin (>300) kalın bir görüntüsünü sunmaktadır. Floresan, astrositlere özgü viral vektör transdüksiyonu ile sağlandı. Video 2 , astrositler ve hipokampal piramidal hücrelerin çekirdekleri arasındaki mekansal yakınlığı sunmaktadır. Video 3, tüm yarımküredeki aksonal demetleri izler; aksonlar primer motor korteksten çıkıntı yapar ve omurilikten geriye doğru izlenir. Başka bir demet dorsal hipokampustan Supra Mammillary cisimlerine doğru izlenir. Son olarak, Mammillary cisimciklerinden ventral hipokampustaki kökenlerine doğru kırmızı bir akson demeti izler. İşaretli tüm hücreler sadece uyarıcıdır.
Şekil 1: Temizleme işleminin ayrıntılı açıklaması. (A) Florofor ekspresyonunun doğrulanması. Bu örnekte, bir fare hipokampusunun CA1 kısmındaki tüm astrositler kırmızı bir protein (Eflatun olarak görüntülenen TdTomato) ve tüm uyarıcı nöronlar çekirdeklerinde yeşil bir protein (H2B-GFP) ifade eder. Bu görüntü 2-foton mikroskobu kullanılarak elde edildi. Görüntü, 15,5 kare/sn hızında 652 x 483 μm görüş alanı elde etmek için 2,4 büyütmeli 16x su daldırma hedefi (0,8 NA) ve düzlemler arasında 0,937 μm aralıklarla bir z-yığını kullanılarak çekilmiştir. Özgüllük ve penetrans immünohistokimya9 ile doğrulandı. (B) N2 gazının tanktan beyni tutan tüpe aktarılması, ucunda iğne bulunan bir boru gerektirir. (C) Tüpün içindeki hava, biri gaz tankından boruya bağlı iğne yoluyla N2'nin girişi için (üst ok) ve çıkış için başka bir (alt ok) olmak üzere iki delik oluşturularakN2 ile değiştirilir. (D) Gazdan arındırmadan hemen sonra deliklerin modelleme kili ile kaplanması,N2'nin tüpten çıkmasını önler. (E) Gazdan arındırılmış çözeltinin ılık bir banyoda 3,5 saat ısıtılması. (F) Başarılı polimerizasyon, jelleşmiş HS'ye gömülü bir beyin ile sonuçlanır. Gaz kabarcıkları polimerde sıkışmış olabilir. (G) Jelden ekstraksiyondan hemen sonra, beynin istenen kalınlığa kesilmesi için en iyi noktadır. (H) Delikli tüpler, karıştırıcı üzerindeki çözeltinin akışının numuneye ulaşmasını sağlar. (I) Delikli tüplerin içindeki beyinler, bir ocak karıştırıcı üzerinde duran, 2 L'lik bir beherin sığması için yapılmış bir boyutta, kendi kendine yapılan bir tutucu tarafından dikey olarak tutulur. (J) Yeterince açık olmayan bir beyin örneği. Numune CS2'de yaklaşık bir hafta daha karıştırılmalıdır. (K) Yeterince berrak bir beyin örneği. (L) Berrak beyni PBST'ye yerleştirirken, doku öncekinden daha beyaz hale gelir. Bu renk değişikliği Triton'dan kaynaklanmaktadır ve bu çözümden diğerine taşındığında kaybolacaktır. (M) RIMS'de >24 saat sonra, beyin tekrar tamamen saydam hale gelecektir. Kısaltmalar: GFP = yeşil floresan protein; NA = sayısal diyafram; HS = hidrojel çözeltisi; CS2 = Takas Çözümü 2; PBST = %0,5 Triton X-100 içeren fosfat tamponlu salin; RIMS = Kırılma İndeksi Eşleştirme Çözümü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Oda hazırlığı. (A) Sıcak tutkal duvarlarının ilk tabakası bir slaytın kenarlarını kaplar ve duvarlara dokunmadan beyni içerecek kadar geniş bir alan bırakır. Slaytın sol üst köşesinde bir delik bırakılmıştır. (B) Dokunun yüksekliğine ulaşmak için katman katman eklemek. (C) Düz kapak kayması (beyaz ok) odayı kapatır. (D) Oda duvarlarındaki delikten RIMS ile doldurulmuş oda. (E) Hazne, hava kabarcığı bırakmayan RIMS ile doldurulur. (F) Herhangi bir sızıntıyı önlemek için odadaki deliğin sıcak tutkalla kapatılması. Yandan görünüm. (G) Bu aşamada, kızağın kenarları boyunca uzanan sıcak tutkal kalıntıları odadan kesilmelidir. (H) Mikroskop altında görüntülemeye hazır, tamamen hazırlanmış oda. Kısaltma: RIMS = Kırılma İndeksi Eşleştirme Çözümü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 3: Temizlenmiş bir hipokampusta görüntülenen tüm astrositler (AAV1-GFAP::TdTomato, kırmızı). Video 1'den tek bir kare, temizlenmiş bir hipokampusta görüntülenen tüm astrositleri (AAV1-GFAP::TdTomato, kırmızı) yakalar. Görüntü özelliklerinin tüm ayrıntıları Video 1 altında açıklanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 4: Kalın şeffaf dokuda astrositler (AAV1-GFAP::TdDomates, kırmızı) ve hipokampal piramidal hücre çekirdekleri (AAV5-CaMKII::H2B-eGFP, yeşil). Video 2'den hem astrositleri (AAV1-GFAP::TdDomates, kırmızı) hem de hipokampal piramidal hücre çekirdeklerini (AAV5-CaMKII::H2B-eGFP, yeşil) kalın şeffaf dokuda gösteren tek bir kare. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 5: Yeşil aksonlar (AAV5-CaMKII::eGFP, yeşil) ve kırmızı aksonlar (AAV5-CaMKII::TdTomato). Video 3'ten tek bir kare, bir fare beynindeki çeşitli konumlardan türetilen ve tüm yarım küre boyunca izlenebilen her iki akson türünü de gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: >1 mm kalınlığında hipokampal dorsal CA1 astrosit diliminin görüntüleri (AAV1-GFAP::TdTomato, kırmızı). Video, bir CLARITY prosedürünü takiben 2.4 büyütme ile 16x hedefi (0.8 NA) kullanılarak iki fotonlu bir mikroskopla elde edildi. Şekil 1A'ya benzer şekilde, z-yığını aralığı 0,937 μm olarak ayarlandı. Floresan, astrositlere özgü viral vektör transdüksiyonu ile sağlandı. Bu küpteki astrosit sayısı >300'dür ve çoğu hücrede analiz için çoğu işlem mevcuttur. Kısaltmalar: NA = sayısal diyafram; AAV = adeno ilişkili virüs; GFAP = glial fibriler asidik protein. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 2: Bir 3D küpte astrositler ve uyarıcı nöron çekirdekleri. Küp, Şekil 1A ve Video 1 için belirtilen optik koşullar altında dCA1'in tüm laminalarını içerir. Bu küp, astrositler (AAV1-GFAP::TdDomates, kırmızı) ile hipokampal piramidal hücrelerin çekirdekleri (AAV5-CaMKII::H2B-eGFP, yeşil) arasındaki uzamsal yakınlığı sergiler. Kısaltmalar: AAV = adeno ilişkili virüs; GFAP = glial fibriler asidik protein; CAMKII = kalsiyum/kalmodüline bağımlı protein kinaz II; eGFP = gelişmiş yeşil floresan proteini; H2B = histon 2B. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Video 3: Tüm yarımkürede aksonal demetlerin izlenmesi. Omurilikte biten yeşil aksonlar (AAV5-CaMKII::eGFP, yeşil) kolayca birincil motor kortekse (7 mm'den fazla mesafe) kadar izlenebilir. Hipokampustan (dorsal taraf), başka bir demet Supra Mammillary cisimlerine (beynin çoğu ventral tarafı), neredeyse 3 mm uzunluğunda bir iz izine doğru izlenir. Videonun ikinci yarısı, ventral hipokampustan kaynaklanan kırmızı bir akson demetini (AAV5-CaMKII::tdTomato) Mammillary cisimlerindeki hedef konumlarından geri izliyor. Görüntü, Olympus taramalı lazer konfokal mikroskop FV1000 altında 4x objektif (0.16 NA) kullanılarak çekildi ve tüm yarımküreyi sunmak için MATL FluoView özelliği kullanılarak birden fazla yatırım getirisi birleştirildi. Kısaltmalar: AAV = adeno ilişkili virüs; CAMKII = kalsiyum/kalmodüline bağımlı protein kinaz II; eGFP = gelişmiş yeşil floresan proteini; NA = sayısal diyafram; MATL = birden çok alan hızlandırılmış. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
| Hidrojel Çözeltisi (1 L) | |
| Malzeme | Miktar |
| VA-044 Başlatıcı | 2.5 gr |
| PFA %4 | 900 mL |
| Akrilamid (%40) | 50 mL |
| Bisakrilamid (%2) | 50 mL |
Tablo 1: Hidrojel çözeltisinin (1 L) hazırlanması. Hidrojel çözeltisi buz gibi soğuk bir yüzeyde hazırlanmalıdır. Malzemelerin karıştırılma sırası önemli değildir. Akrilamid toplam yüzdesinin,% 17 veya% 4 22 kullanan benzer protokollerin aksine% 2 olduğunu unutmayın.
| Takas Çözümleri (1 L) | ||
| Malzeme | Miktar | |
| CS1 bölümüne bakınız | CS2 bölümüne bakınız | |
| Borik asit (M.W. = 61.83 g/mol) | 12.366 gr | 3.4 gr |
| cesaret | 80 gr | 80 gr |
| Tris tabanı (M.W. = 121.14 g/mol) | 0 | 12.1 gr |
| Damıtılmış Su (DW) | 1 L'ye kadar doldurun | 1 L'ye kadar doldurun |
| NaOH | pH 8,5 | |
| % 0.5 Triton X-100 ile 1 L Fosfat tamponlu Salin | ||
| Malzeme | Miktar | |
| PBS | 995 mL | |
| Triton X-100 | 5 mL | |
Tablo 2: %0.5 Triton X-100 ile 1 ve 2 (1 L) ve 1 L Fosfat tamponlu Salin temizleme çözeltilerinin hazırlanması. Temizleme çözeltileri önceden hazırlanabilir ve uzun süre oda sıcaklığında tutulabilir. Borik asit ve SDS içeren herhangi bir çözelti, SDS veya borik asit ile solunmasını veya cilt temasını önlemek için bir duman başlığı altında tutulmalıdır. CS1'deki NaOH, pH'ı 8.5'e ayarlamak için en son eklenmelidir. Her beyin örneği en az 5-25 mL CS1'e yerleştirilmeli ve yeterli difüzyon için gece boyunca tutulmalıdır. Kısaltmalar: CS1 = temizleme çözümü 1; SDS = sodyum dodesil sülfat; M.W. = moleküler ağırlık.
| Ürün Adı | Birincil avantaj | Birincil dezavantaj |
| RapiClear | Örnek şeffaf kalır | Doku şişmesi |
| RapiClear CS | Numune normal boyutuna geri döner | Örnek şeffaflığını kaybedebilir |
Tablo 3: Avantajları ve dezavantajları olan RIMS seçenekleri. Rapiclear (RC, RI = 1.47) veya CLARITY'ye özgü Rapiclear (CSRC, RI = 1.45). Bu iki çözüm arasındaki temel fark, CSRC berrak beyni orijinal boyutuna geri döndürürken, RC çözeltisinin bunu yapmaması ve temizlenmiş numuneyi hafifçe şişirmesidir. Kısaltma: RI = kırılma indisi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Doku temizleme yöntemleri, beyin araştırmalarında devrim niteliğinde bir araç sunarak, daha önce sorulamayan soruları davet ediyor. Küçük bir hücre grubunun, tek bir hücrenin veya hatta tek bir sinapsın özelliklerini hedeflemekten, CLARITY artık ilgili floroforları kullanarak toplam hücre popülasyonlarının veya uzun menzilli bağlantı özelliklerinin hedeflenmesini sağlar.
Florofor ekspresyonu ve CLARITY prosedür kombinasyonunun sonucu ikili değildir; birçok faktör prosedüre müdahale edebilir ve optimal olmayan sonuçlara yol açabilir. İlk olarak, florofor ekspresyonu önceden doğrulanmalıdır. CLARITY prosedürü bazı bilgi kayıplarına neden olduğundan, yeterli florofor protein ekspresyonu, CLARITY işleminin sonunda görüntünün geçerliliği için çok önemlidir. İkincisi, transkraniyal perfüzyon, tüm kanın beyinden çıkmasını sağlayarak dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır, çünkü kanın otofloresansı kalın dilimlerde güvenilmez verilere yol açacaktır. Üçüncüsü, protokolde tartışılan tüm parametreler, temizleme işleminin her adımında hassas bir şekilde ele alınmalıdır, örneğin, polimerizasyondan önce HS'dekiO2 kalıntısı veya her aşamada sıcaklık hassasiyetsizliği, aktif malzemeler arasındaki kimyasal reaksiyonun oluşmasını önleyecektir.
Önceki protokoller17,22, HS'de farklı konsantrasyonlarda akrilamid önermektedir. Akrilamidin temel amacı, molekülleri amin kalıntıları (proteinler ve nükleik asitler) ile daha iyi sabitlemektir. Konsantrasyondaki küçük değişiklikler tüm temizleme işlemini büyük ölçüde etkiler: fiksasyon çok kompaktsa, lipit molekülleri dokudan ayrılmaz ve temizleme işlemi gereksiz yere uzar veya opak beyinlere neden olur. Bununla birlikte, daha düşük akrilamid konsantrasyonları, lipitlerden yoksun bir kez beyin yapısını yeterince korumayacaktır. Bu protokolde, akrilamid yüzdesi, sabitlenmiş ancak berrak dokunun hassas dengesini sağlayacak şekilde ayarlanmıştır.
Temizleme işleminin çoğu CS2'de gerçekleşir ve doku berraklık seviyesi günlük olarak test edilmelidir. PBST temizleme, Temizleme çözeltileri ile kırılma indisi eşleştirme çözeltileri arasında önemli bir adımdır, çünkü RIMS ile etkileşime girebilecek artık SDS moleküllerini temizler. Henüz oda hazırlığına ihtiyaç duyulmamışsa PBST'de (% 0.5) berrak dokunun süresiz olarak tutulması da mümkündür.
Beyni RIMS'ye yerleştirirken, çözümlerin yararları ve sınırlamaları hakkında bilgi sahibi olunmalıdır. Örneğin, RapiClear, neredeyse temizlenmiş dokularda bile tam şeffaflığa neden olur, ancak verileri analiz ederken ihmal edilmemesi gereken bazı şişliklere de neden olur. Önceki ölçümler 9, tüm eksenler boyunca eşitgenişlemeyi (yani, dorsoventral, anterior-posterior ve lateral-medial eksenler) önermektedir, bu da aynı beyin bölgesinden ince dilimlere kıyasla şişlik indeksini hesaplamayı mümkün kılmaktadır. CLARITY'ye Özel RapiClear kullanmak şişliği ortadan kaldırır; Bununla birlikte, herhangi bir SDS kalıntısı dokuda kalırsa, şeffaf olmayan kitleler halinde toplanırlar.
Bu değiştirilmiş protokolün bir başka yararı da maliyetidir. Önceki protokoller, beyni RIMS'de tutabilen bir oda oluşturmak için farklı yapıştırıcı türleri önermektedir. Bu protokolde, sadece sıcak tutkal kullanıyoruz. Çözeltilerle reaksiyona girmez, her yerde satın alınabilir, kullanımı kolaydır ve daha önce önerilen yapıştırıcılardan önemli ölçüde daha ucuzdur.
Kalın beyin örneklerinin görüntülenmesinden elde edilen veriler, tüm hücre popülasyonlarını, beyin yapıları arasındaki bağlantıyı veya tek bir aksonun geniş mesafelerde izlenmesini tanımlayabilir (Video 3). Bu özelliklerle ilgili sorular daha önce sorulmuş olsa da, kalın beyin dilimleri kullanılarak elde edilebilen verilerin geçerliliği, ince dilimli görüntü bindirmesinin önceki, hataya eğilimli yöntemlerine göre büyük ölçüde iyileşmektedir.
CLARITY süreci, kalın dilimlerin birkaç milimetreden tam beyin görüntülemeye kadar başarılı ve düzgün bir şekilde temizlenmesini sağlar. Pasif temizleme (yani, ETC kullanmamak), dokuya zarar verme riskini ve numunelerin temizleme çözeltilerine daldırılma süresini azaltır, böylece protein korumasının yüksek verimliliğini etkilemez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu proje, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programı (hibe anlaşması No 803589), İsrail Bilim Vakfı (ISF hibe No. 1815/18) ve Kanada-İsrail hibeleri (CIHR-ISF, hibe No. 2591/18) kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi'nden (ERC) finansman almıştır. Nechama Novic'e tüm el yazması hakkında yorum yaptığı için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV1-GFAP::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect astrocytes | |
| AAV5-CaMKII::eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| AAV5-CaMKII::H2B-eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neuronal nuclei | |
| AAV5-CaMKII::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| Acrylamide (40%) | Bio-rad | #161-0140 | |
| Bisacrylamide (2%) | Bio-rad | #161-0142 | |
| Boric acid | Sigma | #B7901 | Molecular weight - 61.83 g/mol |
| Confocal microscope, scanning, FV1000 | Olympus | 4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA) | |
| Imaris software | Bitplane, UK | A software that allows 3D analysis of images | |
| NaOH | Sigma | #S5881 | |
| PBS | |||
| PFA 4% | EMS | #15710 | |
| RapiClear | SunJin lab | #RC147002 | |
| RapiClear CS | SunJin lab | #RCCS002 | |
| SDS | Sigma | #L3771 | |
| SyGlass software | A software that allows 3D analysis of images using virtual reality | ||
| Tris base 1 M | Bio-rad | #002009239100 | Molecular weight - 121.14 g/mol |
| Triton X-100 | ChemCruz | #sc-29112A | |
| Two photon microscope | Neurolabware | Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA) | |
| VA-044 Initiator | Wako | #011-19365 |
References
- Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).
- Ciappelloni, S., et al. Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease. Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).
- Sylvain, N. J., et al. The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573 (2021).
- Kitchen, P., et al. Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema. Cell. 181 (4), 784-799 (2020).
- Adamsky, A., et al. Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement. Cell. 174 (1), 59-71 (2018).
- Adamsky, A., Goshen, I. Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions. Neuroscience. 370, 14-26 (2018).
- Nagai, J., et al. Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits. Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
- Refaeli, R., et al. Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons. Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).
- Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human. eLife. 5, 15915 (2016).
- Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development. International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus. Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Chai, H., et al. Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
- Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).
- Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biology. 3 (5), 159 (2005).
- Ye, L., et al. Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences. Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).
- DeNardo, L. A., et al. Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval. Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).
- Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Ye, L., et al. Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences. Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
