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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Preparação e Análise Morfológica das Culturas celulares da crista neural do pintinho

Published: June 27, 2022 doi: 10.3791/63799
Automatic Translation
1, 2,3, 2,3, 2,3
1Department of Biology and Neuroscience Program, Hamline University, 2Department of Genetics, Cell Biology and Development, University of Minnesota, 3Developmental Biology Center, University of Minnesota

Summary

Este protocolo versátil descreve o isolamento das células de crista neural pré-cardíaca (NCCs) através da excisão de dobras neurais cranianas de embriões de filhotes. Após o revestimento e a incubação, as DCNT migratórias emergem das explicações da dobra neural, permitindo a avaliação da morfologia celular e da migração em um ambiente 2D simplificado.

Abstract

Durante o desenvolvimento de vertebrados, as células da crista neural (NCCs) migram extensivamente e se diferenciam em vários tipos celulares que contribuem para estruturas como o esqueleto craniofacial e o sistema nervoso periférico. Embora seja fundamental compreender a migração do NCC no contexto de um embrião 3D, isolar células migratórias na cultura 2D facilita a visualização e a caracterização funcional, complementando estudos embrionários. O presente protocolo demonstra um método para isolar as dobras neurais cranianas de filhotes para gerar culturas primárias de NCC. NCCs migratórios emergem de explanações de dobra neural banhadas em um substrato revestido de fibronectina. Isso resulta em populações dispersas e aderentes da NCC que podem ser avaliadas por coloração e análises morfológicas quantitativas. Essa abordagem de cultura simplificada é altamente adaptável e pode ser combinada com outras técnicas. Por exemplo, a emigração ncc e comportamentos migratórios podem ser avaliados por imagens de lapso de tempo ou funcionalmente consultados por incluir inibidores ou manipulações experimentais da expressão genética (por exemplo, DNA, morfolino ou eletroporação CRISPR). Devido à sua versatilidade, este método fornece um poderoso sistema para investigar o desenvolvimento craniano do NCC.

Introduction

As células da crista neural (NCCs) são uma população celular transitória em embriões vertebrados. Os NCCs são especificados nas bordas da placa neural e passam por uma transição epitelial-mesenquimal (EMT) para migrar do tubo neural dorsal1. Após o EMT, os NCCs se dispersam extensivamente por todo o embrião, finalmente diferenciando e contribuindo para várias estruturas, incluindo o esqueleto craniofacial, o trato de saída do coração e a maioria do sistema nervoso periférico2. Mudanças na polaridade celular, no citoesqueleto e nas propriedades de adesão subjacentes a essa mudança de uma pré-conferência para uma população celular migratória3. Estudar o NCC EMT e a migração fornece insights sobre mecanismos fundamentais da motilidade celular e informa os esforços para prevenir e tratar defeitos congênitos e metástase do câncer.

Embora a análise in vivo seja vital para a compreensão dos processos de desenvolvimento do NCC em um contexto embrionário, os métodos in vitro oferecem acessibilidade visual e física que facilitam caminhos experimentais adicionais. Em um ambiente 2D simplificado, pode-se avaliar morfologia NCC, estruturas citoesqueletal e distância migrada. Além disso, podem ser analisados os efeitos da perturbação genética ou solúvel dos fatores em comportamentos migratórios das NCCs motile. Além disso, podem ser coletadas, coletadas e utilizadas NCCs pré-escolares isolados ou migratórias para metodologias de alto rendimento para estudar a regulação do desenvolvimento de DCNT através de perfis proteômicos, transcriômicos e epigenômicos 7,11. Enquanto os métodos estão disponíveis para a preparação de NCCs cranianas de vários organismos modelo de desenvolvimento 12,13,14, este artigo demonstra a mecânica da abordagem para aqueles que primeiro aprendem a cultivar ncc cranial a partir de embriões de filhotes.

O protocolo atual descreve uma técnica versátil para o preparo de culturas de NCC cranianos filhotes (Figura 1). Como os NCCs migram prontamente de dobras neurais explantadas para um substrato cultural, os NCCs de pintinhos naturalmente se segregam do tecido embrionário, e as culturas primárias são facilmente geradas. À medida que as NCCs de cérebro médio migram em massa a partir das dobras neurais cranianas (em contraste com a delaminação prolongada, célula por célula no tronco15), essas culturas consistem principalmente de células de crista neural craniana migratória, com excisão inicial de dobra neural fornecendo um método de coleta para DCNT pré-proporcionatórias. Um método básico para dissecar e cultivo de dobras neurais cranianas de filhotes é detalhado, e sugestões para diferentes aplicações e variações sobre este método são oferecidas.

Figure 1
Figura 1: A visão geral esquemática do protocolo de cultura da dobra neural do filhote. (A,B) As dobras neurais cranianas (delineadas em azul) são extirpadas de um embrião de filhote com cinco somites (mostrados na visão dorsal em A). Bandas cinzentas, crescente cardíaco. (C) Quando banhadas em fibronectina, as células da crista neural migratória emergem das dobras neurais e se dispersam no substrato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocol

Qualquer variedade de raças gallus gallus pode ser usado, incluindo White Leghorn, Golden Sex Link, ou Rhode Island Red. Os ovos de galinha utilizados no presente estudo foram de várias raças e obtidos de múltiplas fontes, incluindo fazendas e incubatórios locais.

1. Preparação de soluções e materiais

  1. Prepare a solução do Ringer misturando 123,3 mM NaCl, 1,53 mM CaCl2, 4,96 mM KCl, 0,809 mM Na2HPO4 e 0,147 mM KH2PO4 (ver Tabela de Materiais). Ajuste o pH para 7,4 e o filtro esteriliza em garrafas de 100 mL. Guarde em um local limpo e seco. Não lave garrafas com sabão (trate como vidro de cultura tecidual).
  2. Prepare a solução de estoque de 1 mg/mL fibronectina (FN) (ver Tabela de Materiais) dissolvendo a FN na solução estéril ringer e armazenar em 100 alíquotas de μL a -80 °C (estável por pelo menos 4 anos).
  3. Prepare a mídia cultura completa complementando a mídia L15 com 0,8% L-glutamina, 0,08% penicilina/estreptomicina, 10% FBS e 10% extrato de embrião12. Crie alíquotas de 3 mL e armazene a -20 °C ou -80 °C.
    NOTA: Se as culturas forem incubadas em uma incubadora de CO2 , o DMEM/F12 precisa ser substituído por L15, que é tamponado para ar.
  4. Prepare 4% de solução paraformaldeída em 1x PBS. Ajuste o pH para 7,4. Crie alíquotas de 10 mL e armazene-as a -20 °C.
    ATENÇÃO: O paraformaldeído deve ser tratado em um capô de fumaça.
  5. Prepare quadros de suporte de papel do filtro (aproximadamente 1 cm x 1,5 cm retângulos de papel com dois ou três orifícios perfurados sobrepostos no eixo longo).
    1. Furque os furos ao longo da borda de um grande pedaço de papel filtro usando um soco padrão de três furos, corte/corte a borda perfurada em uma tira e, em seguida, corte a tira entre os orifícios em retângulos ~ 1,5 cm de comprimento. Papéis de filtro autoclave antes do uso (opcional).
  6. Reúna ferramentas de dissecção, incluindo fórceps finos (#5), fórceps contundentes, tesoura de dissecção, tesoura de mola e agulhas de tungstênio afiadas16.

2. Incubação de embriões

  1. Obter óvulos fertilizados de qualquer uma das fontes mencionadas acima.
  2. Coloque os ovos fertilizados em posição vertical (eixo longo da vertical do ovo com a extremidade pontuda para baixo/lado contundente para cima) dentro de uma incubadora umidificada a 38 °C (100 °F).
  3. Incubar até quatro a sete somites (estágios 8+-9)17, que leva aproximadamente 35 h.
    NOTA: O tempo de incubação pode variar significativamente dependendo da cepa, idade das galinhas, estação, etc., e deve ser determinado experimentalmente. Os temporizadores de tomada programáveis são úteis para iniciar a incubação durante a noite para obter o tempo desejado.
  4. Depois de remover da incubadora, pulverize minuciosamente os ovos com 70% de etanol e deixe-os secar para desinfetar as conchas.
    NOTA: Os embriões podem ser coletados imediatamente, mas deixar os ovos esfriarem à temperatura ambiente diminui a fragilidade das gemas e a perda de embriões durante a coleta.

3. Preparação de pratos culturais

  1. Selecione pratos de cultura de dobra neural (ver Tabela de Materiais) apropriados para a aplicação a jusante.
    1. Para culturas que serão fixadas e manchadas, use tampas de vidro colocadas em pratos de cultura de tecido multi-poço.
      NOTA: Deslizamentos que combinam com o tamanho do poço se moverão menos com a mistura de fluidos, tornando as explanações menos propensas a mudar e mais propensas a aderir ao deslizamento de tampas em vez do fundo do prato.
    2. Selecione câmara única de fundo de vidro ou pratos de câmara dividido (ver Tabela de Materiais) para imagens ao vivo com um microscópio invertido.
    3. Para imagens ao vivo em um microscópio vertical ou estéreo, use placas de cultura de tecido opticamente adequadas de 6, 12 ou 24 poços.
    4. Selecione pratos de cultura de tecido plástico para a coleta em massa de células de crista neural migratórias para análises de alto rendimento.
  2. Adicione 10 U/mL de penicilina e 10 μg/mL de estreptomicina a uma garrafa de 100 mL de solução estéril ringer (por exemplo, 100 μL de 10.000 U/mL penicilina e 10.000 μg/m streLptomicina, para fazer Ringer's P/S). Use o P/S do Ringer dentro de uma semana.
  3. Descongele uma alíquota de 1 mg/mL de FN no gelo. Diluir com p/s de Ringer a uma concentração de 10-100 μg/mL de FN.
  4. Pipet solução FN suficiente para cobrir o fundo do poço ou prato. Por exemplo, 100 μL por poço em uma placa de 24 poços, 500 μL para um prato de 35 mm.
  5. Substitua a tampa e incuba pratos ou pratos com solução FN em uma incubadora umidificada (ou uma bandeja coberta com toalhas de papel destiladas em água) a 38 °C (100 °F) por pelo menos 1 h enquanto disseca dobras neurais.

4. Isolamento de embriões de filhotes

  1. Tome cuidado para manter a orientação do ovo (o embrião flutua até o topo da gema durante a incubação). Use tesoura ou força-tarefa contundente para fazer um pequeno furo na casca, cerca de 1/4-1/3 do caminho para baixo do comprimento do ovo.
    1. Insira cuidadosamente a ponta da tesoura ou as fórceps contundentes no pequeno orifício, garantindo não interromper a gema, e corte através da casca de ovo ao redor do ovo, removendo a parte superior da casca de ovo (Figura 2A).
  2. Posicione o embrião para isolamento.
    NOTA: Se o embrião não estiver localizado idealmente no copo da casca, use fórceps contundentes para girar cuidadosamente a gema, de modo que o embrião esteja no topo. Alternativamente, despeje a gema em uma mão enluvada, com uma mão enluvada, tomando cuidado para não quebrar a gema e permitindo que a albumina escorra (Figura 2B). Em seguida, o embrião pode ser posicionado movendo a gema de mão em mão.
  3. Prepare o embrião usando suavemente a borda plana de fórceps fechados para limpar qualquer excesso de albumina que permaneça na superfície da gema cobrindo o embrião (Figura 2C). O excesso de albumina também pode ser removido usando pressão suave com um limpador de tarefas delicado.
    NOTA: Uma vez que a albumina é limpa, a superfície da gema deve parecer texturizada em vez de lisa. A falha em limpar a albumina suficiente inibirá a adesão do suporte de papel filtro na seção 4, etapa 4.
  4. Use fórceps para colocar uma estrutura de suporte de papel filtro sobre o embrião, com o embrião na janela do quadro. Pressione suavemente o papel do filtro para aderir à gema.
  5. Corte ao redor da parte externa do quadro de papel do filtro com a tesoura de dissecção (Figura 2D). Use fórceps ou pontas de tesoura para agarrar a borda da armação e levantar suavemente o embrião para longe da gema (Figura 2E). Levantar-se em um ângulo ajudará a remover o embrião limpamente da gema.
  6. Coloque o embrião com o lado do quadro de papel para baixo (lado ventral do embrião para cima) em uma placa de Petri de 60 mm ou 100 mm preenchida com P/S de Ringer (Figura 2F). Mantenha o prato de embriões no gelo se coletar para uma aplicação a jusante sensível à proteína ou RNA.
    NOTA: A falha em colocar os embriões do lado ventral para cima corre o risco de descolá-los de seus quadros de papel. Vários embriões podem ser coletados e armazenados em P/S de Ringer por até 1 h antes de se mover para as etapas de dissecção da dobra neural.

5. Dissecando dobras neurais

  1. Transfira um embrião para um prato limpo contendo a solução P/S de Ringer e enxágue o embrião segurando o quadro de papel do filtro com fórceps e deslizando suavemente para frente e para trás para limpar qualquer gema que obscureça a visão do embrião. Troque o P/S do Ringer ou transfira para um prato fresco se ficar nublado.
  2. Posicione o lado dorsal/quadro do embrião sob um microscópio dissecando. Deixando o embrião na moldura do papel para mantê-lo esticado e mantido no lugar, remova a membrana vitelline usando fórceps para expor as dobras neurais.
    NOTA: Se o embrião cair da moldura do papel, ele pode ser colocado plano no prato ou preso a um prato revestido de sílgard18 para dissecção.
  3. Usando uma tesoura de mola ou uma agulha de tungstênio afiada, extirpara cuidadosamente as dobras neurais do cérebro médio. Inclua tecido caudal para as vesículas ópticas em expansão e rostral para o cérebro traseiro, onde constrições de rommbomere estão apenas começando a aparecer (o crescente cardíaco também é um indicador útil, Figura 3B,C). Tome cuidado para extirir o aspecto mais dorsal da dobra neural com tubo neural contaminante mínimo e ectoderme não neural (Figura 3C).
  4. Transfira as dobras neurais para um prato limpo contendo P/S de Ringer usando um pipettor P20 ou uma pipeta pasteur de vidro estéril lavada com P/S de gema (isso bloqueia o plástico ou o vidro para evitar que o tecido grude). Armazene dobras coletadas no gelo enquanto disseca dobras adicionais.

6. Emplacando dobras neurais

  1. Descongele uma alíquota completa de mídia de cultura completa (seção 1, passo 3). Adicione 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina e esterilizar filtro. Mantenha a mídia preparada a 37-38 °C enquanto realiza outras etapas.
  2. Remova pratos de cultura da incubadora (seção 3, passo 5). Usando um pipettor ou pipeta Pasteur, remova a solução FN de tampas, pratos ou poços. Depois de enxaguar o substrato revestido de FN com P/S de Ringer, adicione um volume apropriado de mídia de cultura completa aos pratos ou poços (500 μL para poços em uma placa de 24 poços, 2 mL para um prato de 35 mm ou uma placa de seis poços).
    NOTA: Volumes menores podem preservar reagentes caros (por exemplo, tão baixos quanto 200 μL para uma placa de 24 poços), mas certifique-se de que o prato é suficientemente umidificado para evitar a evaporação.
  3. Usando um pipettor p20 ou p200, primeiro, enxágue a ponta da pipeta com p/s de gema para bloquear o plástico e evitar que o tecido grude. Em seguida, transfira as dobras neurais isoladas para as tampas revestidas de FN, tomando o cuidado de transferir o menor P/S de Ringer possível. Coloque as dobras em direção ao centro da tampa revestida de FN.
    NOTA: Uma ou algumas dobras neurais podem ser emplacar em uma tampa de 12 mm em um poço de 19 mm, até 50 em uma placa de 35 mm.
  4. Depois de permitir que as explantas se contentem com 10-15 min, coloque-as em uma câmara umidificada a 38 °C (100 °F) carregando lentamente e cuidadosamente os pratos da cultura com dobras neurais banhadas. Isso minimizará a mudança das dobras neurais nos poços, garantindo que elas permaneçam dispersas e aderam a quaisquer deslizamentos de cobertura.
    NOTA: Ao usar L15 (não DMEM), os pratos de cultura de explanta também podem ser incubados em uma incubadora de ovos usando uma bandeja coberta com toalhas de papel umedecidos.
  5. Incubar culturas de dobra neural na incubadora umidificada durante a duração da migração ativa (cerca de 16-20 h no total, Figura 4).

7. Fixação e coloração de DCNT migratórios cultivados para análise morfológica

  1. Remova a mídia de cultura com uma pipeta Pasteur e enxágue os poços com 1x PBS esterilizado por filtro.
  2. Adicione 4% de paraformaldeído por 15 minutos à temperatura ambiente.
    NOTA: O tempo de fixação pode precisar ser determinado experimentalmente. Também é possível adicionar paraformaldeído diretamente à mídia por 10 minutos (50:50), remover e substituir por paraformaldeído não diluído por 10 minutos para reter estruturas celulares mais delicadas.
  3. Remova o paraformaldeído e enxágue três vezes com 1x PBS.
  4. NCCs fixos de manchas com um corante apropriado para avaliação morfológica. Como exemplo, a coloração com a faloideia conjugada de Oregon Green é detalhada aqui.
    NOTA: Visualizar o citoesqueleto de actina com faloideína19 revela a complexidade estrutural do NCC migratório com intensidade de coloração relativamente uniforme; no entanto, a faloideina pode não destacar todas as áreas celulares. Corantes que rotulam a membrana plasmática (por exemplo, agglutina de germe de trigo ou DiI) ou citoplasma também podem ser usados, mas complicam a imagem de saliências finas em relação ao corpo celular brilhantemente manchador. Além disso, a imunofluorescência pode ser realizada simultaneamente para rotular células de crista neural com HNK-1 ou determinar a localização subcelular de uma proteína de interessede 7,20.
    1. Remova o pbs final enxaguar e adicionar PBS + 0,5% Triton X-100 (PBST) + 5% de soro (FBS ou de outro animal apropriado para costaining com um anticorpo) para cobrir as tampas e incubar por 10 minutos em um agitador de plataforma à temperatura ambiente.
    2. Pipet 200 nM de Oregon Green conjugado fálice (diluído em PBST + 5% de soro) em uma superfície lisa (como filme flexível de vedação de parafina) para cada deslizamento de cobertura. Para um deslizamento de cobertura de 12 mm, pipeta um volume de 30 μL.
    3. Utilizando um par de fórceps, remova o deslizamento do soro PBST + 5%, garantindo manter a orientação das células voltadas para cima. Toque brevemente na borda da tampa para um delicado limpador de tarefas para afastar o excesso de líquido.
    4. Coloque suavemente cada lado da célula de deslizamento para baixo na gota de faloideína diluída. Incubar por 30 minutos à temperatura ambiente. Mantenha as tampas no escuro durante a coloração (cubra com um prato coberto de papel alumínio ou coloque em uma gaveta).
    5. Durante a incubação, adicione PBST aos poços do prato de cultura (750 μL de PBST para cada poço de um prato de 24 poços).
    6. Após o período de incubação, levante as tampas da solução de coloração e coloque-as de volta no prato de cultura, lançando o deslizamento de cobertura para que o lado da célula seja para cima. Certifique-se de que o deslizamento de tampas esteja coberto com PBST e coloque em um agitador de plataforma por 10 minutos, mantendo as tampas cobertas e no escuro. Remova o PBST e repita esta etapa duas vezes, para um total de três lavagens de 10 minutos.
    7. Coloque uma gota (por deslizamento de cobertura) da mídia de montagem (ver Tabela de Materiais) em um slide de microscópio. O volume de 25 μL funciona bem para uma mancha de cobertura de 12 mm.
    8. Após a lavagem final com PBST, toque na borda da tampa para um delicado limpador de tarefas para remover o excesso de líquido, mantendo o controle do lado da célula do deslizamento de tampa.
    9. Monte o lado da célula de deslizamento para baixo, baixando lentamente a mancha de cobertura em um ângulo para a mídia de montagem para evitar a criação de bolhas. Permita que a mídia seja definida antes da imagem.

8. Avaliação morfológica de DCNT migratórias cultivadas

  1. Células manchadas de imagem e exportam como arquivos .tiff.
    NOTA: Um objetivo de 40x funciona bem para culturas de imagem, mas objetivos que variam de 10x (para capturar todo um campo de NCCs migratórias) a 100x (NCCs únicos) podem ser usados para coletar imagens para avaliação morfológica. As imagens do presente estudo foram capturadas por meio de uma plataforma de imagem multimodal invertida (ver Tabela de Materiais).
  2. Carregue as imagens em um software de análise de imagem (ImageJ21, ver Tabela de Materiais). Clique em Imagem > Duplicar para criar uma segunda cópia de cada imagem a ser usada para análise, deixando assim o original não editada, pois a maioria do processamento de imagem não pode ser revertida.
  3. Clique em Imagem > Ajuste > Brilho/Contraste e use barras deslizantes para ajustar o brilho ou contraste das imagens.
  4. Converta as imagens em escala de cinza seguindo os passos abaixo.
    1. Se as imagens forem exportadas em RGB, elas serão enviadas em RGB como um canal mesclado. Para separar as imagens, clique em Image > Color > Split Channels para adquirir imagens em escala de cinza de um único canal.
    2. Se as imagens já estiverem separadas, vá para Image > Type > de 8 bits para converter o arquivo em escala de cinza.
  5. Clique em Imagem > Ajuste > Limiar para converter em uma imagem binária onde os pixels são identificados como células (primeiro plano; preto) ou fundo (branco). Use a barra deslizante e/ou clique em Auto para selecionar a configuração Limiar que define claramente células a partir do plano de fundo.
    1. Se as células estiverem sobrepostas ou a coloração não for contínua, pode ser necessário processar ainda mais usando as funções de Watershed ou Fill Holes22. Isso separará células umas das outras ou preencherá lacunas dentro das células a serem analisadas. Clique em Process > Binary > Make Binary para converter a imagem pela primeira vez em um formato binário de 8 bits. Em seguida, clique em Processar > Bacia hidrográfica > binária ou preencher buracos.
      NOTA: O software fará o seu melhor ajuste para onde os sinais precisam ser separados ou preenchidos, o que pode ser ajustado ainda mais usando plug-ins, se necessário.
  6. Selecione as medidas a serem capturadas. Clique em Analisar > definir medidas e verifique as caixas de descritores de forma para análise de Circularidade (Circ.), Proporção (AR), Arredondamento (Rodada) e Solidez.
    NOTA: Outras medidas também podem ser incluídas, como Área e Perímetro, dependendo do tipo de análise necessária.
  7. Clique em Analisar > Analisar partículas e definir os parâmetros do menu "Analisar partículas".
    1. Em "Tamanho", aproximadamente estima o tamanho das células ou partículas de interesse em pixels, pois o sinal de fundo ou detritos celulares menores também serão incluídos se o parâmetro Tamanho permanecer definido em 0-Infinity (por exemplo, definido como 500-Infinito na Figura 5).
      NOTA: Ajustar o tamanho a uma faixa mais apertada pode excluir partículas menores ou maiores do que as necessárias para análise.
    2. Em "Circularidade", deixe em 0-1.0 para medir todas as formas celulares na imagem.
    3. Em "Mostrar", selecione Contornos Nus do menu suspenso para inspecionar os contornos celulares selecionados com a função "Analisar partículas". Escaneie os contornos para garantir que as células sobrepostas sejam distinguidas, mas as células não são divididas desnecessariamente. Além disso, verifique as caixas de menu para "Resultados de exibição", "Resumo" e "Adicionar ao Gerente".
  8. Uma vez definidos todos os parâmetros, clique em Ok.
    NOTA: Quatro janelas separadas aparecerão, mostrando (1) os contornos nus das células identificadas na imagem, (2) as células contadas na imagem, (3) os resultados das medições de cada célula e (4) um resumo do número total de células contadas e suas medidas médias.
    1. Se os detritos fossem contados, as células sobrepostas eram contadas como uma, células únicas eram contadas como múltiplos, ou muitas células eram omitidas da contagem, voltavam à imagem original, não editada, faziam outra duplicata e ajustavam "Limiar" ou outros parâmetros.

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Representative Results

Uma visão geral do presente protocolo é mostrada na Figura 1. Os ovos incubados foram abertos, e a gema, com o embrião na superfície, foi isolada por suavemente derramar na palma de uma mão enluvada (Figura 2A,B). Depois de limpar a albumina (Figura 2C), as molduras de papel do filtro foram aplicadas na membrana da gema ao redor do embrião para facilitar o corte e o levantamento do embrião da gema, que começa a derramar quando as membranas da gema são cortadas (Figura 2D,E).

Figure 2
Figura 2: Isolamento de quatro a sete embriões de filhotes de somite. Os ovos fertilizados foram incubados por 35 h. Um ovo foi aberto com fórceps contundentes (A), e a gema foi derramada em uma mão enluvada (B). O excesso de albumina foi removido (C) para que um suporte de papel filtro (D, inset) aderisse à gema. O embrião foi cortado da gema (D), retirado (E) e colocado no P/S (F) de Ringer. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Após enxaguar o embrião e mover-se para limpar o P/S de Ringer, as dobras neurais eram visíveis nos embriões isolados (Figura 3A). Estas dobras contêm células de crista neural craniana pré-diagratórias. Uma vez extirpadas de um embrião (Figura 3B,C) e coletadas (Figura 3D), dobras neurais isoladas podem ser banhadas para criar culturas migratórias de NCC.

Figure 3
Figura 3: Dissecção de dobras neurais dorsais de filhotes. Trabalhando no P/S de Ringer, as tesouras de mola foram usadas para extirperar dobras neurais. (A) Visão dorsal do embrião, anterior ao topo da figura. As dobras neurais parecem mais opacas do que o tecido circundante. As dobras neurais do cérebro médio estão posteriores aos lóbulos ópticos (rosa) e anteriores ao crescente cardíaco (amarelo). (B) Visão dorsal do embrião após a retirada das dobras neurais, mostrando limites de excisão. (C) Visão lateral do embrião com dobras neurais removidas. A técnica de dissecção remove o tubo neural dorsal, evitando estruturas de tubos ventral e não neurais. (D) Dobras neurais isoladas na barra de escala P/S. ringer = 300 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Quando as dobras neurais foram banhadas em FN, os NCCs começaram a emergir de explantas de dobra neural aderentes dentro de 3-4 h de incubação (Figura 4A), e a migração foi concluída após aproximadamente 20 h (Figura 4B). A coloração HNK-1, que rotula NCCs migratórios20, foi aparente na maioria das células da cultura (Figura 4D). Um resultado negativo ocorreu quando as dobras neurais não aderiram ao deslizamento de cobertura, ou nenhum NCC emigrou da explanta (dados não mostrados). As NCCs foram analisadas por meio da fixação das culturas, coloração para atonascesso filamentosa e realização de diversas medições no ImageJ para avaliar a morfologia e migração do NCC (Figura 5). A área média das 69 células analisadas foi de 802,11 ± 69,65 μm2, com intervalo de 60,27-2664,53 μm2, distribuídos como mostrado no gráfico de barras e enredo de violino (Figura 5C). Circularidade (fórmula: circularidade = 4π (área/perímetro²)), medida que reflete a saliência de uma célula, variou de 0,101-0,875, com média de 0,38 ± 0,15. Valores mais baixos indicam uma forma alongada, enquanto um valor de 1 indica um círculo perfeito. Como evidente na trama do violino, a maioria das células exibe uma forma alongada (Figura 5D). Outra medida de forma celular é a proporção (AR), que é o eixo principal da célula dividida pelo eixo menor. Um valor AR de 1 indica uma forma simétrica23. As DCNT migratórias nesse campo apresentaram ar médio de 2,13 ± 0,11, com valores variando de 1,14 a 5,59 (Figura 5E). Utilizando essas medidas quantitativas da morfologia do NCC, comparações rigorosas podem ser feitas entre condições experimentais e diferentes estudos publicados.

Figure 4
Figura 4: Os CCN migratórios emergem de dobras neurais cultivadas. Imagens de Brightfield de dobras neurais banhadas após 3 h de incubação (A) e 20 h de incubação (B). Barra de escala = 200 μm. (C,D) A dobra neural é em grande parte dispersa após 20 h de incubação, mas residualmente presente no lado direito dessas imagens. Barra de escala = 500 μm. Os NCCs migratórios são visíveis com a coloração DAPI (C) e HNK-1 (D). A imunostaining HNK-1 confirma que as células cultivadas são NCCs migratórias. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Avaliação morfológica de DCNT migratórias cultivadas. (A) A coloração de falo de fisomante actina em NCCs migrou de uma dobra neural após 20 h na cultura. Barra de escala = 50 μm. (B) Imagem limiar com células aparecendo preto e o fundo branco. Contornos amarelos cercam objetos contados como células, e as células são numeradas. (C-E) Opções de grafação para exibir dados de avaliação morfológica. Gráficos de barras e tramas de violino foram criados a partir de medições das 69 células mostradas no painel B para retratar a área (μm2, C), circularidade (D) e proporção (E) das células medidas. Os gráficos de barras mostram valores médios com barras de erro representando o erro padrão da média à esquerda de cada painel. As tramas de violino foram criadas com app.rawgraphs.io. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A técnica descrita aqui fornece um método adaptável de isolar as dobras neurais de filhotes e emplacando-as para criar culturas de NCCs cranianas migratórias. Essas culturas fornecem condições 2D simplificadas para fácil análise da migração e morfologia do NCC que podem complementar mais tecnicamente desafiadores nos métodos de imagem ovo 24,25,26. Embora este método in vitro seja relativamente simples, os resultados consistentes dependem de ovos e reagentes de alta qualidade. Além disso, devido à variabilidade inerente das culturas, a reprodutibilidade requer repetição experimental e quantitação.

A adesão das dobras neurais à FN é essencial para a migração do NCC na cultura. Ocasionalmente, as explicações não aderirão adequadamente, e a dobra neural flutuará para longe ou produzirá NCCs migratórios. Isso pode acontecer quando uma dobra neural craniana não aterrissa lateralmente para baixo; tente orientar as explantas no vaso cultural antes da incubação e permitir que elas se contentem com 10-15 min antes de movê-las. No entanto, devido à mistura de fluidos durante a transferência para a incubadora, algumas dobras neurais inevitavelmente aderirão sub-idealmente de tempos em tempos. Quando a adesão e a migração são problemáticas para um experimento inteiro, isso pode refletir fn antigo (usar uma alíquota fresca a partir do -80 °C para cada experimento), meio de cultura com componentes vencidos (armazenar mídia preparada em alíquotas do tamanho de experimento a -20 °C e adicionar antibiótico fresco no momento do uso) ou uso de clipes de cobertura não apropriados para a cultura celular (por exemplo, as células não aderirão a tampas para histologia). Uma incubadora contaminada também pode fazer com que experimentos de cultura ncc inteiros falhem.

Além de produzir NCCs dispersos na cultura e permitir a análise da morfologia migratória do NCC, este protocolo também é um ponto de partida para muitos outros experimentos. Explanações banhadas em tampas também podem ser processadas para imunofluorescência (após a seção 7, etapa 3) para determinar a localização subcelular de uma proteína de interesse7. Embora a análise da morfologia e da distância migratória sejam possíveis em culturas fixas, como descrito aqui, a imagem de lapso de tempo de NCCs durante a incubação da cultura (seção 6, etapa 5) permite a coleta adicional de dados sobre direcionalidade e persistência da migração e dinâmica da motilidade celular (medidas de saliência de membrana, adesão, etc.) 14,24,27. A manipulação genética transitória de embriões pode ser alcançada por eletroporação18,28 de reagentes (morpholinos29, construtos de expressão de DNA, ou vetores CRISPR30) no estágio 4+17 de Hamburger e Hamilton. Esses embriões eletroporados podem então ser usados no protocolo para criar culturas migratórias de NCC com perda de função ou superexpressão de genes de interesse. A análise funcional também pode ser alcançada adicionando inibidores químicos à mídia das culturas NCC 7,27 (seção 6, etapa 2). O perfil populacional de DCNT por meio de análises de nível de omices requer a coleta de DCNT como matéria-prima 7,11,31. Embora os marcadores tenham sido usados para isolar as NCCs através da triagem celular ativada por fluorescência31, isso requer equipamento especializado de citometria de fluxo e dissociação enzimática das células. Seguir os métodos descritos aqui para extirver cuidadosamente as dobras neurais dorsais (minimizando a coleta do tubo neural ventral e células ectoderme não neurais) fornece um método barato para coletar NCCs pré-proporcionais11 (seção 5, passo 4). A coleta de NCCs após a dispersão na cultura (seção 6, etapa 5) fornece uma população relativamente pura de NCCs naturalmente segregados e migratórios para análise posterior (coloração HNK-1, um marcador de NCCs migratórias, na maioria das células cultivadas na Figura 4D; como em7). Finalmente, essas variações podem ser usadas em combinação. Por exemplo, a imunofluorescência ou a imagem de lapso de tempo podem ser usadas para avaliar os efeitos das manipulações de expressão genética ou a adição de inibidores27. No geral, este protocolo adaptável e barato fornece os meios para avaliar a morfologia de NCCs migratórias cranianas de tipo selvagem na cultura com múltiplas modificações potenciais para alcançar vários objetivos experimentais.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse.

Acknowledgments

Agradecemos a Corinne A. Fairchild e Katie L. Vermillion, que participaram do desenvolvimento da nossa versão do protocolo de cultura de dobra neural craniana.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AxioObserver equipped with an LSM710 confocal scan head controlled by ZEN 3.0 SR software  Zeiss Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective
CaCl2 Sigma-Aldrich C3306
Chamber dishes (glass bottom, single or divided) MatTek; Cell Vis P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis)
X000NOK1OJ (Cellvis)		 Single chamber 35 mm or 4 chamber 35 mm
Cover glass Carolina Biological Supply Company 633029, 633031, 633033, 633035, 633037 circles, 0.13–0.17 mm thickness, available in 12-25 mm diameter 
DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 11320033 Alternative for L15 media
Egg incubator Sportsman 1502
FBS  Life Technologies 10437-028
Fibronectin Fisher Scientific CB-40008A
Filter paper Whatman grade 3MM chromatography
Forceps (blunt) Fisher Scientific; Thomas Scientific 08-890 (Fisher);1141W97 (Thomas)
Forceps (fine) Fine Science Tools 11252-20 Dumont #5
Image J https://fiji.sc/ Free image analysis software
KCl Sigma-Aldrich P3911
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662
L15 media Invitrogen 11415064
L-glutamine Invitrogen 25030
Mounting Media (Vectashield or ProLong Gold) Vector Laboratories; Thermofisher Scientific H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold)
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S9638
NaCl Sigma-Aldrich S9888
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin/streptomycin Life Technologies 15140-148 10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 mg/mL Streptomycin
Petri Dishes VWR (or similar) 60 mm, 100 mm
Phalloidin Sigma-Aldrich P1951 multiple flurophores available
Pin holder Fine Science Tools 26016-12 For tungsten needle (alternative for spring scissors)
Scissors (dissection) Fine Science Tools 14061-10
Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08 2.5 mm cutting edge (alternative for tungsten needle)
Sylgard Krayden Sylgard 184
Syringe Filters Sigma-Aldrich SLGVM33RS Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized
Tissue culture dishes Sarstedt 83-3900 35 mm culture dishes for bulk neural fold cultures
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Tungsten wire Variety of sources 0.01" diameter for tungsten needle (alternative for spring scissors)

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Biologia do Desenvolvimento Edição 184
Preparação e Análise Morfológica das Culturas celulares da crista neural do pintinho
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Jacques-Fricke, B. T., Roffers-Agarwal, J., Gustafson, C. M., Gammill, L. S. Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures. J. Vis. Exp. (184), e63799, doi:10.3791/63799 (2022).

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