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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Preparación y análisis morfológico de cultivos de células de cresta neural craneal de pollo

Published: June 27, 2022 doi: 10.3791/63799
Automatic Translation
1, 2,3, 2,3, 2,3
1Department of Biology and Neuroscience Program, Hamline University, 2Department of Genetics, Cell Biology and Development, University of Minnesota, 3Developmental Biology Center, University of Minnesota

Summary

Este protocolo versátil describe el aislamiento de células de la cresta neural premigratoria (NCC) a través de la escisión de pliegues neurales craneales de embriones de pollo. Tras el recubrimiento y la incubación, las NCC migratorias emergen de los explantes del pliegue neural, lo que permite la evaluación de la morfología celular y la migración en un entorno 2D simplificado.

Abstract

Durante el desarrollo de los vertebrados, las células de la cresta neural (NCC) migran ampliamente y se diferencian en varios tipos de células que contribuyen a estructuras como el esqueleto craneofacial y el sistema nervioso periférico. Si bien es fundamental comprender la migración de NCC en el contexto de un embrión 3D, el aislamiento de células migratorias en cultivo 2D facilita la visualización y la caracterización funcional, complementando los estudios embrionarios. El presente protocolo demuestra un método para aislar los pliegues neurales craneales de los pollitos para generar cultivos primarios de NCC. Los NCC migratorios emergen de los explantes del pliegue neural colocados en un sustrato recubierto de fibronectina. Esto da como resultado poblaciones de NCC dispersas y adherentes que pueden evaluarse mediante tinción y análisis morfológicos cuantitativos. Este enfoque de cultivo simplificado es altamente adaptable y se puede combinar con otras técnicas. Por ejemplo, la emigración de NCC y los comportamientos migratorios pueden evaluarse mediante imágenes de lapso de tiempo o consultarse funcionalmente mediante la inclusión de inhibidores o manipulaciones experimentales de la expresión génica (por ejemplo, ADN, morfolino o electroporación CRISPR). Debido a su versatilidad, este método proporciona un poderoso sistema para investigar el desarrollo craneal de NCC.

Introduction

Las células de la cresta neural (NCC) son una población celular transitoria en embriones de vertebrados. Las NCC se especifican en los bordes de la placa neural y experimentan una transición epitelial-mesenquimal (EMT) para migrar desde el tubo neural dorsal1. Después de la EMT, las NCC se dispersan extensamente por todo el embrión, diferenciando y contribuyendo finalmente a varias estructuras, incluido el esqueleto craneofacial, el tracto de salida del corazón y la mayoría del sistema nervioso periférico2. Los cambios en la polaridad celular, el citoesqueleto y las propiedades de adhesión subyacen a este cambio de una población celular premigratoria a una migratoria3. El estudio de NCC EMT y la migración proporciona información sobre los mecanismos fundamentales de la motilidad celular e informa los esfuerzos para prevenir y tratar defectos de nacimiento y metástasis del cáncer.

Si bien el análisis in vivo es vital para comprender los procesos de desarrollo de NCC en un contexto embrionario, los métodos in vitro ofrecen accesibilidad visual y física que facilitan vías experimentales adicionales. En un entorno 2D simplificado, se puede evaluar la morfología de NCC, las estructuras citoesqueléticas y la distancia migrada. Además, se pueden analizar los efectos de la perturbación genética o del factor soluble sobre los comportamientos migratorios de las NCC móviles 4,5,6,7,8,9,10. Además, las NCC premigratorias o migratorias aisladas pueden ser recolectadas, agrupadas y utilizadas para metodologías de alto rendimiento para estudiar la regulación del desarrollo de las NCC a través de perfiles proteómicos, transcriptómicos y epigenómicos 7,11. Si bien hay métodos disponibles para preparar NCC craneales a partir de varios organismos modelo de desarrollo12,13,14, este artículo demuestra la mecánica del enfoque para aquellos que primero aprenden a cultivar NCC craneal a partir de embriones de pollo.

El protocolo actual describe una técnica versátil para preparar cultivos craneales de NCC de pollo (Figura 1). Debido a que los NCC migran fácilmente de los pliegues neurales explantados a un sustrato de cultivo, los NCC de los pollitos se segregan naturalmente del tejido embrionario, y los cultivos primarios se generan fácilmente. A medida que las NCC del mesencéfalo migran en masa desde los pliegues neurales craneales (en contraste con la delaminación prolongada célula por célula en el tronco15), estos cultivos consisten principalmente en células migratorias de la cresta neural craneal, con la escisión inicial del pliegue neural que proporciona un método de recolección para las NCC premigratorias. Se detalla un método básico para diseccionar y cultivar pliegues neurales craneales de pollo, y se ofrecen sugerencias para diferentes aplicaciones y variaciones de este método.

Figure 1
Figura 1: Descripción esquemática del protocolo de cultivo del pliegue neural craneal de pollo. (A,B) Los pliegues neurales craneales (delineados en azul) se extirpan de un embrión de pollo con cinco somitas (se muestra en vista dorsal en A). Bandas grises, media luna cardíaca. (C) Cuando se colocan en fibronectina, las células migratorias de la cresta neural emergen de los pliegues neurales y se dispersan sobre el sustrato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocol

Se puede usar cualquier variedad de razas Gallus gallus , incluyendo White Leghorn, Golden Sex Link o Rhode Island Red. Los huevos de gallina utilizados en el presente estudio eran de varias razas y se obtuvieron de múltiples fuentes, incluidas granjas y criaderos locales.

1. Preparación de soluciones y materiales

  1. Prepare la solución de Ringer mezclando 123,3 mM de NaCl, 1,53 mM de CaCl 2, 4,96 mM de KCl, 0,809 mM deNa2HPO 4 y 0,147 mM de KH2 PO4 (consulte la Tabla de materiales). Ajuste el pH a 7.4 y filtre esterilizar en botellas de 100 ml. Almacenar en un lugar limpio y seco. No lave los biberones con jabón (trátelos como cristalería de cultivo de tejidos).
  2. Preparar 1 mg/ml de solución madre de fibronectina (FN) (ver Tabla de materiales) disolviendo FN en solución estéril de Ringer y almacenar en alícuotas de 100 μL a -80 °C (estable durante al menos 4 años).
  3. Prepare medios de cultivo completos complementando los medios L15 con 0,8% de L-glutamina, 0,08% de penicilina/estreptomicina, 10% de FBS y 10% de extracto de embrión de pollo12. Almacenar 3 ml de alícuotas y almacenar a -20 °C o -80 °C.
    NOTA: Si los cultivos se incuban en una incubadora de CO2, DMEM/F12 debe sustituirse por L15, que está amortiguado para el aire.
  4. Preparar solución de paraformaldehído al 4% en 1x PBS. Ajuste el pH a 7.4. Cree 10 ml de alícuotas y guárdelas a -20 °C.
    PRECAUCIÓN: El paraformaldehído debe manipularse en una campana extractora.
  5. Prepare marcos de soporte de papel de filtro (rectángulos de papel de aproximadamente 1 cm x 1,5 cm con dos o tres orificios perforados superpuestos en el eje largo).
    1. Perfore agujeros a lo largo del borde de un trozo grande de papel de filtro con un punzón estándar de tres agujeros, corte / recorte el borde perforado en una tira y luego corte la tira entre los orificios en rectángulos ~ 1.5 cm de longitud. Filtrar en autoclave los papeles antes de su uso (opcional).
  6. Reúna herramientas de disección, incluyendo pinzas finas (# 5), pinzas romas, tijeras de disección, tijeras de resorte y agujas de tungsteno afiladas16.

2. Incubación embrionaria

  1. Obtener óvulos fertilizados de cualquiera de las fuentes mencionadas anteriormente.
  2. Coloque los huevos fertilizados en posición vertical (eje largo del huevo vertical con el extremo puntiagudo hacia abajo / lado romo hacia arriba) dentro de una incubadora humidificada a 38 ° C (100 ° F).
  3. Incubar hasta que se hayan formado de cuatro a siete somitas (etapas 8+-9)17, lo que toma aproximadamente 35 h.
    NOTA: El tiempo de incubación puede variar significativamente dependiendo de la cepa, la edad de las gallinas, la temporada, etc., y debe determinarse experimentalmente. Los temporizadores de salida programables son útiles para iniciar la incubación durante la noche para obtener el tiempo deseado.
  4. Después de retirarlos de la incubadora, rocíe bien los huevos con etanol al 70% y déjelos secar para desinfectar las cáscaras.
    NOTA: Los embriones se pueden recolectar inmediatamente, pero dejar que los huevos se enfríen a temperatura ambiente disminuye la fragilidad de las yemas y la pérdida de embriones durante la recolección.

3. Preparación de platos de cultivo

  1. Seleccione las placas de cultivo de pliegues neuronales (consulte la Tabla de materiales) apropiadas para la aplicación posterior.
    1. Para cultivos que se fijarán y teñirán, use cubreobjetos de vidrio colocados en platos de cultivo de tejidos de pocillos múltiples.
      NOTA: Los cubreobjetos que coinciden con el tamaño del pozo se moverán menos con la mezcla de fluidos, lo que hace que los explantes tengan menos probabilidades de desplazarse y más probabilidades de adherirse al cubreobjetos en lugar del fondo del plato.
    2. Seleccione platos de cámara simple o cámara dividida con fondo de vidrio (consulte la Tabla de materiales) para obtener imágenes en vivo con un microscopio invertido.
    3. Para obtener imágenes en vivo en un microscopio vertical o estéreo, use placas de cultivo de tejidos ópticamente apropiadas de 6, 12 o 24 pocillos.
    4. Seleccione platos de cultivo de tejido plástico para la recolección masiva de células migratorias de la cresta neural para análisis de alto rendimiento.
  2. Agregue 10 U/ml de penicilina y 10 μg/ml de estreptomicina a un frasco de 100 ml de solución estéril de Ringer (por ejemplo, 100 μL de 10.000 U/ml de penicilina y 10.000 μg/ml de estreptomicina, para producir P/S de Ringer). Use el P/S de Ringer dentro de 1 semana.
  3. Descongelar una alícuota de 1 mg/ml de FN en hielo. Diluir con P/S de Ringer a una concentración de 10-100 μg/ml de FN.
  4. Pipet suficiente solución FN para cubrir el fondo del pozo o plato. Por ejemplo, 100 μL por pocillo en una placa de 24 pocillos, 500 μL para una placa de 35 mm.
  5. Reemplace la tapa e incube los platos o platos con solución FN en una incubadora humidificada (o una bandeja cubierta con toallas de papel empapadas en agua destilada) a 38 °C (100 °F) durante al menos 1 h mientras disecciona los pliegues neuronales.

4. Aislamiento de embriones de pollo

  1. Tenga cuidado de mantener la orientación del huevo (el embrión flota hasta la parte superior de la yema durante la incubación). Use tijeras o pinzas romas para hacer un pequeño agujero en la cáscara, aproximadamente 1/4-1/3 del camino a lo largo del huevo.
    1. Inserte cuidadosamente la punta de las tijeras o pinzas romas en el orificio pequeño, asegurándose de no interrumpir la yema, y corte a través de la cáscara del huevo alrededor del huevo, quitando la parte superior de la cáscara del huevo (Figura 2A).
  2. Coloque el embrión para el aislamiento.
    NOTA: Si el embrión no está idealmente ubicado en la copa de la cáscara, use pinzas romas para girar cuidadosamente la yema, de modo que el embrión esté en la parte superior. Alternativamente, vierta la yema en una mano enguantada y ahuecada, teniendo cuidado de no romper la yema y permitiendo que la albúmina se drene (Figura 2B). Luego, el embrión se puede colocar moviendo la yema de mano en mano.
  3. Prepare el embrión usando suavemente el borde plano de pinzas romas cerradas para limpiar cualquier exceso de albúmina que quede en la superficie de la yema que cubre el embrión (Figura 2C). El exceso de albúmina también se puede eliminar con una presión suave con un limpiaparabrisas de tareas delicadas.
    NOTA: Una vez que se elimina la albúmina, la superficie de la yema debe aparecer texturizada en lugar de lisa. Si no se elimina suficiente albúmina, se inhibirá la adhesión del soporte del papel de filtro en la sección 4, paso 4.
  4. Use fórceps para colocar un marco de soporte de papel de filtro sobre el embrión, con el embrión en la ventana del marco. Presione suavemente el papel de filtro para adherirlo a la yema.
  5. Corte alrededor del exterior del marco de papel de filtro con tijeras de disección (Figura 2D). Use fórceps o puntas de tijera para agarrar el borde del marco y levantar suavemente el embrión lejos de la yema (Figura 2E). Levantar en ángulo ayudará a extraer el embrión limpiamente de la yema.
  6. Coloque el embrión con el marco de papel con el lado hacia abajo (el embrión ventral hacia arriba) en una placa de Petri de 60 mm o 100 mm llena de P/S de Ringer (Figura 2F). Mantenga el plato de embriones en hielo si se recolecta para una aplicación posterior sensible al ARN o a las proteínas.
    NOTA: Si no se colocan los embriones con el lado ventral hacia arriba, se corre el riesgo de desprenderlos de sus marcos de papel. Se pueden recolectar múltiples embriones y almacenarlos en el P/S de Ringer durante hasta 1 h antes de pasar a los pasos de disección del pliegue neural.

5. Disección de pliegues neurales

  1. Transfiera un embrión a un plato limpio que contenga la solución P/S de Ringer y enjuague el embrión sosteniendo el marco del papel de filtro con pinzas y agitando suavemente hacia adelante y hacia atrás para eliminar cualquier yema que oscurezca la vista del embrión. Cambie el P / S del Ringer o transfiéralo a un plato fresco si se vuelve turbio.
  2. Coloque el lado dorsal/marco del embrión hacia arriba bajo un microscopio de disección. Dejando el embrión en el marco de papel para mantenerlo tenso y mantenido en su lugar, retire la membrana vitelina usando fórceps para exponer los pliegues neurales.
    NOTA: Si el embrión se cae del marco de papel, se puede colocar plano en el plato o fijarse a un plato recubierto de silgard18 para su disección.
  3. Usando tijeras de resorte o una aguja de tungsteno afilada, extirpe cuidadosamente los pliegues neurales del mesencéfalo. Incluye tejido caudal a las vesículas ópticas en expansión y rostral al cerebro posterior, donde las constricciones rombomeras apenas comienzan a aparecer (la media luna cardíaca también es un indicador útil, Figura 3B, C). Tenga cuidado de extirpar el aspecto más dorsal del pliegue neural con un tubo neural contaminante mínimo y ectodermo no neural (Figura 3C).
  4. Transfiera los pliegues neurales a un plato limpio que contenga P/S de Ringer utilizando una pipeta P20 o una pipeta Pasteur de vidrio estéril enjuagada con P/S de Ringer de yema (esto bloquea el plástico o el vidrio para evitar que el tejido se pegue). Almacene los pliegues recolectados en hielo mientras disecciona pliegues adicionales.

6. Plegado de pliegues neurales

  1. Descongelar una alícuota de medios de cultivo completos (sección 1, paso 3). Añadir 100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina y filtrar esterilizar. Mantenga los medios preparados a 37-38 °C mientras realiza otros pasos.
  2. Retire las placas de cultivo de la incubadora (sección 3, paso 5). Con una pipeta o pipeta Pasteur, retire la solución FN de cubreobjetos, platos o pocillos. Después de enjuagar el sustrato recubierto con FN con P/S de Ringer, agregue un volumen apropiado de medios de cultivo completos a los platos o pocillos (500 μL para pocillos en una placa de 24 pocillos, 2 ml para una placa de 35 mm o una placa de seis pocillos).
    NOTA: Los volúmenes más pequeños pueden conservar reactivos costosos (por ejemplo, tan bajos como 200 μL para una placa de 24 pocillos), pero aseguran que el plato esté lo suficientemente humidificado para evitar la evaporación.
  3. Usando un pipete p20 o p200, primero, enjuague la punta de la pipeta con yema Ringer's P/S para bloquear el plástico y evitar que el tejido se pegue. Luego, transfiera los pliegues neurales aislados a los cubreobjetos recubiertos de FN, teniendo cuidado de transferir la menor cantidad posible de P / S de Ringer. Coloque los pliegues hacia el centro del cubrecubierta recubierto de FN.
    NOTA: Uno o unos pocos pliegues neurales se pueden chapar en un cubreobjetos de 12 mm en un pocillo de 19 mm, hasta 50 en una placa de 35 mm.
  4. Después de dejar que los explantes se asienten durante 10-15 minutos, colóquelos en una cámara humidificada a 38 ° C (100 ° F) llevando lenta y cuidadosamente las placas de cultivo con pliegues neurales plateados. Esto minimizará el desplazamiento de los pliegues neuronales en los pozos, asegurando que permanezcan dispersos y se adhieran a cualquier cubreobjetos.
    NOTA: Cuando se usa L15 (no DMEM), los platos de cultivo de explantes también se pueden incubar en una incubadora de huevos usando una bandeja cubierta con toallas de papel humedecidas.
  5. Incubar cultivos de pliegues neurales en la incubadora humidificada durante la duración de la migración activa (alrededor de 16-20 h en total, Figura 4).

7. Fijación y tinción de NCC migratorias cultivadas para análisis morfológico

  1. Retire los medios de cultivo con una pipeta Pasteur y enjuague los pocillos con 1x PBS esterilizado por filtro.
  2. Añadir paraformaldehído al 4% durante 15 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Es posible que sea necesario determinar experimentalmente el tiempo de fijación. También es posible agregar paraformaldehído directamente al medio durante 10 minutos (50:50), eliminar y reemplazar con paraformaldehído al 4% sin diluir durante 10 minutos para retener estructuras celulares más delicadas.
  3. Retire el paraformaldehído y enjuague tres veces con 1x PBS.
  4. Tinción fija NCC con un tinte apropiado para la evaluación morfológica. Como ejemplo, la tinción con faloidina conjugada verde de Oregón se detalla aquí.
    NOTA: La visualización del citoesqueleto de actina con faloidina19 revela la complejidad estructural de la NCC migratoria con intensidad de tinción relativamente uniforme; Sin embargo, la faloidina puede no resaltar todas las áreas celulares. También se pueden usar colorantes que marcan la membrana plasmática (por ejemplo, aglutinina de germen de trigo o DiI) o citoplasma, pero complican la imagen de protuberancias finas en relación con el cuerpo celular que se tiñe brillantemente. Además, la inmunofluorescencia puede realizarse simultáneamente para marcar células de la cresta neural con HNK-1 o para determinar la localización subcelular de una proteína de interés 7,20.
    1. Retire el enjuague final de PBS y agregue PBS + 0.5% Triton X-100 (PBST) + 5% de suero (FBS o de otro animal apropiado para costarse con un anticuerpo) para cubrir los cubreobjetos e incubar durante 10 minutos en una coctelera de plataforma a temperatura ambiente.
    2. Pipet 200 nM de faloidina conjugada Oregon Green (diluida en PBST + suero al 5%) sobre una superficie lisa (como una película flexible de sellado de parafina) para cada cubreobjetos. Para un cubreobjetos de 12 mm, pipetear un volumen de 30 μL.
    3. Usando un par de fórceps, retire el cubreobjetos del suero PBST + 5%, asegurándose de mantener la orientación de las células hacia arriba. Toque brevemente el borde del cubreobjetos con un limpiaparabrisas de tareas delicadas para absorber el exceso de líquido.
    4. Coloque suavemente cada cubreobjetos de la celda hacia abajo sobre la gota de faloidina diluida. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Mantenga los cubreobjetos en la oscuridad durante la tinción (cubra con un plato cubierto de papel de aluminio o colóquelos en un cajón).
    5. Durante la incubación, añadir PBST a los pocillos de la placa de cultivo (750 μL de PBST por cada pocillo de una placa de 24 pocillos).
    6. Después del período de incubación, levante los cubreobjetos de la solución de tinción y colóquelos de nuevo en la placa de cultivo, volteando el cubreobjetos para que el lado de la celda esté hacia arriba. Asegúrese de que el cubreobjetos esté cubierto con PBST y colóquelo en un agitador de plataforma durante 10 minutos, manteniendo los cubreobjetos cubiertos y en la oscuridad. Retire PBST y repita este paso dos veces, para un total de tres lavados de 10 minutos.
    7. Coloque una gota (por cubreobjetos) de medios de montaje (consulte la Tabla de materiales) en un portaobjetos de microscopio. El volumen de 25 μL funciona bien para un cubreobjetos de 12 mm.
    8. Después del lavado final con PBST, toque el borde del cubreobjetos con un limpiaparabrisas de tareas delicadas para eliminar el exceso de líquido, haciendo un seguimiento del lado de la celda del cubreobjetos.
    9. Monte el lado de la celda del cubreobjetos hacia abajo bajando lentamente el cubreobjetos en ángulo sobre el medio de montaje para evitar la creación de burbujas. Permita que los medios se configuren antes de la creación de imágenes.

8. Evaluación morfológica de las NCC migratorias cultivadas

  1. Imágenes de celdas teñidas y expórtalas como archivos .tiff.
    NOTA: Un objetivo de 40x funciona bien para los cultivos de imágenes, pero los objetivos que van desde 10x (para capturar todo un campo de NCC migratorios) hasta 100x (NCC individuales) se pueden usar para recopilar imágenes para la evaluación morfológica. Las imágenes en el presente estudio fueron capturadas utilizando una plataforma de imágenes multimodales invertidas (ver Tabla de Materiales).
  2. Cargue las imágenes en un software de análisis de imágenes (ImageJ21, consulte Tabla de materiales). Haga clic en Imagen > Duplicar para crear una segunda copia de cada imagen para usar para el análisis, dejando así el original sin editar, ya que la mayoría del procesamiento de imágenes no se puede revertir.
  3. Haga clic en Imagen > Ajustar > brillo / contraste y use barras deslizantes para ajustar el brillo o contraste de las imágenes.
  4. Convierta las imágenes a escala de grises siguiendo los pasos a continuación.
    1. Si las imágenes se exportan en RGB, se cargarán en RGB como un canal combinado. Para separar las imágenes, haga clic en Imagen > color > Canales divididos para adquirir imágenes en escala de grises de un solo canal.
    2. Si las imágenes ya están separadas, vaya a Imagen > Tipo > 8 bits para convertir el archivo a escala de grises.
  5. Haga clic en Imagen > Ajustar > umbral para convertir a una imagen binaria donde los píxeles se identifican como celdas (primer plano; negro) o fondo (blanco). Use la barra deslizante y/o haga clic en Auto para seleccionar la configuración de Umbral que define claramente las celdas del fondo.
    1. Si las celdas se superponen o la tinción no es continua, puede ser necesario procesar más utilizando las funciones Cuenca hidrográfica o Orificios de relleno22. Esto separará las células entre sí o llenará los vacíos dentro de las celdas a analizar. Haga clic en Procesar > binario > Hacer binario para convertir primero la imagen en un formato binario de 8 bits. Luego haga clic en Procesar > Cuenca > binaria o Rellenar agujeros.
      NOTA: El software se ajustará mejor a las señales que deben separarse o completarse, que se pueden ajustar aún más utilizando complementos si es necesario.
  6. Seleccione las medidas que desea capturar. Haga clic en Analizar > establecer medidas y marque las casillas Descriptores de forma para el análisis de Circularidad (circo), relación de aspecto (AR), redondez (redondeo) y solidez.
    NOTA: También se pueden incluir otras mediciones, como Área y Perímetro, dependiendo del tipo de análisis necesario.
  7. Haga clic en Analizar > Analizar partículas, y establezca los parámetros desde el menú " Analizar partículas".
    1. En "Tamaño", calcule aproximadamente qué tan grandes son las celdas o partículas de interés en píxeles, ya que la señal de fondo o los restos de celda más pequeños también se incluirán si el parámetro Tamaño permanece establecido en 0-Infinito (por ejemplo, establecido como 500-Infinito en la Figura 5).
      NOTA: El ajuste del tamaño a un rango más estrecho puede excluir partículas más pequeñas o más grandes que las necesarias para el análisis.
    2. En "Circularidad", deje en 0-1.0 para medir todas las formas de celda en la imagen.
    3. En "Mostrar", seleccione Contornos desnudos en el menú desplegable para inspeccionar los contornos de celda seleccionados con la función "Analizar partículas". Escanee los contornos para asegurarse de que se distinguen las celdas superpuestas, pero que las celdas no se dividen innecesariamente. Además, marque las casillas de menú para "Mostrar resultados", "Resumir" y "Agregar al administrador".
  8. Una vez que se hayan establecido todos los parámetros, haga clic en Aceptar.
    NOTA: Aparecerán cuatro ventanas separadas, que muestran (1) los contornos desnudos de las celdas identificadas en la imagen, (2) las celdas contadas en la imagen, (3) los resultados de las mediciones de cada celda y (4) un resumen del número total de celdas contadas y sus mediciones promediadas.
    1. Si se contaron los desechos, las celdas superpuestas se contaron como una, las celdas individuales se contaron como múltiplos o muchas celdas se omitieron del recuento, vuelva a la imagen original sin editar, haga otro duplicado y ajuste "Umbral" u otros parámetros.

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Representative Results

En la figura 1 se muestra una descripción general del protocolo actual. Los huevos incubados se abrieron y la yema, con el embrión en la superficie, se aisló vertiendo suavemente en la palma de una mano enguantada (Figura 2A, B). Después de eliminar la albúmina (Figura 2C), se aplicaron marcos de papel de filtro a la membrana vitelina que rodea el embrión para facilitar el corte y la elevación del embrión de la yema, que comienza a derramarse una vez que se cortan las membranas de la yema (Figura 2D, E).

Figure 2
Figura 2: Aislamiento de cuatro a siete embriones de pollo somita. Los huevos fertilizados se incubaron durante 35 h. Se abrió un huevo con pinzas romas (A), y la yema se vertió en una mano enguantada (B). El exceso de albúmina se eliminó (C) para que un soporte de papel de filtro (D, recuadro) se adhiriera a la yema. El embrión se cortó de la yema (D), se levantó (E) y se colocó en el P/S (F) de Ringer. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Después de enjuagar el embrión y pasar a limpiar el P/S de Ringer, los pliegues neurales fueron visibles en los embriones aislados (Figura 3A). Estos pliegues contienen células de la cresta neural craneal premigratorias. Una vez extirpados de un embrión (Figura 3B, C) y recolectados (Figura 3D), los pliegues neurales aislados se pueden colocar en placas para crear cultivos migratorios de NCC.

Figure 3
Figura 3: Disección de pliegues neurales dorsales de pollo. Trabajando en el P / S de Ringer, se usaron tijeras de resorte para extirpar los pliegues neuronales. (A) Vista dorsal del embrión, anterior hacia la parte superior de la figura. Los pliegues neurales parecen más opacos que el tejido circundante. Los pliegues neurales del mesencéfalo se encuentran posteriores a los lóbulos ópticos (rosa) y anteriores a la media luna cardíaca (amarillo). (B) Vista dorsal del embrión después de que se extirparon los pliegues neurales, mostrando los límites de la escisión. (C) Vista lateral del embrión con pliegues neurales eliminados. La técnica de disección elimina el tubo neural dorsal, evitando estructuras de tubos ventrales y no neurales. (D) P.S aislados en el P/S de Ringer. Barra de escala = 300 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Cuando los pliegues neurales se colocaron en FN, los NCC comenzaron a emerger de los explantes de pliegues neurales adherentes dentro de las 3-4 h de la incubación (Figura 4A), y la migración se completó después de aproximadamente 20 h (Figura 4B). La tinción de HNK-1, que marca las NCC migratorias20, fue evidente en la mayoría de las células del cultivo (Figura 4D). Un resultado negativo ocurrió cuando los pliegues neurales no se adhirieron al cubreobjetos, o ningún NCC emigró del explante (datos no mostrados). Los NCC se analizaron fijando los cultivos, teñiendo actina filamentosa y realizando varias mediciones en ImageJ para evaluar la morfología y migración de NCC (Figura 5). El área promedio de las 69 celdas analizadas fue de 802.11 ± 69.65 μm 2, con un rango de 60.27-2664.53 μm2, distribuidos como se muestra en el gráfico de barras y el diagrama de violín (Figura 5C). La circularidad (fórmula: circularidad = 4π (área/perímetro²)), una medida que refleja la protuberancia de una célula, osciló entre 0,101 y 0,875, con un promedio de 0,38 ± 0,15. Los valores más bajos indican una forma alargada, mientras que un valor de 1 indica un círculo perfecto. Como es evidente en el diagrama del violín, la mayoría de las células exhiben una forma alargada (Figura 5D). Otra medida de la forma de la celda es la relación de aspecto (AR), que es el eje principal de la celda dividido por el eje menor. Un valor AR de 1 indica una forma simétrica23. Los NCC migratorios en este campo tuvieron un AR promedio de 2.13 ± 0.11, con valores que variaron de 1.14-5.59 (Figura 5E). Usando estas medidas cuantitativas de la morfología NCC, se pueden hacer comparaciones rigurosas entre las condiciones experimentales y diferentes estudios publicados.

Figure 4
Figura 4: Los NCC migratorios emergen de pliegues neurales cultivados. Imágenes de campo claro de pliegues neurales plateados después de 3 h de incubación (A) y 20 h de incubación (B). Barra de escala = 200 μm. (C,D) El pliegue neural se dispersa en gran medida después de 20 h de incubación, pero está presente residualmente en el lado derecho de estas imágenes. Barra de escala = 500 μm. Las NCC migratorias son visibles con tinción DAPI (C) y HNK-1 (D). La inmunotinción de HNK-1 confirma que las células cultivadas son NCC migratorias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Evaluación morfológica de NCC migratorias cultivadas. (A) Tinción con faloidina de actina filamentosa en NCC migrada de un pliegue neural después de 20 h en cultivo. Barra de escala = 50 μm. (B) Imagen de umbral con celdas que aparecen en negro y el fondo blanco. Los contornos amarillos rodean los objetos contados como celdas, y las celdas están numeradas. (C-E) Opciones gráficas para mostrar datos de evaluación morfológica. Se crearon gráficos de barras y gráficos de violín a partir de mediciones de las 69 celdas que se muestran en el panel B para representar el área (μm2, C), la circularidad (D) y la relación de aspecto (E) de las celdas medidas. Los gráficos de barras muestran valores promedio con barras de error que representan el error estándar de la media a la izquierda de cada panel. Las tramas de violín se crearon con app.rawgraphs.io. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La técnica descrita aquí proporciona un método adaptable para aislar los pliegues neurales de los pollitos y colocarlos en placas para crear cultivos de NCC craneales migratorios. Estos cultivos proporcionan condiciones 2D simplificadas para un fácil análisis de la migración y morfología de NCC de los pollitos que pueden complementar los métodos de imagen in ovo más desafiantes técnicamente24,25,26. Si bien este método in vitro es relativamente simple, los resultados consistentes dependen de óvulos y reactivos de alta calidad. Además, debido a la variabilidad inherente de los cultivos, la reproducibilidad requiere repetición experimental y cuantificación.

La adhesión de los pliegues neurales a la FN es esencial para la migración de NCC en cultivo. Ocasionalmente, los explantes no se adhieren correctamente, y el pliegue neural flotará o producirá nulos/pocas NCC migratorias. Esto puede suceder cuando un pliegue neural craneal no aterriza cortado con el lado hacia abajo; Trate de orientar los explantes en el recipiente de cultivo antes de la incubación y déjelos reposar durante 10-15 minutos antes de moverlos. Sin embargo, debido a la mezcla de fluidos durante la transferencia a la incubadora, algunos pliegues neurales inevitablemente se adherirán de manera subóptima de vez en cuando. Cuando la adhesión y la migración son problemáticas para todo un experimento, esto puede reflejar FN antiguo (use una alícuota nueva de -80 °C para cada experimento), medio de cultivo con componentes caducados (almacene los medios preparados en alícuotas del tamaño de un experimento a -20 °C y agregue antibiótico fresco en el momento de su uso) o el uso de cubreobjetos no apropiados para el cultivo celular (por ejemplo, las células no se adherirán a los cubreobjetos para la histología). Una incubadora contaminada también puede hacer que fallen experimentos completos de cultivo de NCC.

Además de producir NCC dispersas en cultivo y permitir el análisis de la morfología migratoria de NCC, este protocolo también es un punto de partida para muchos otros experimentos. Los explantes chapados en cubreobjetos también pueden procesarse para inmunofluorescencia (después de la sección 7, paso 3) para determinar la localización subcelular de una proteína de interés7. Si bien el análisis de la morfología y la distancia de migración son posibles en cultivos fijos, como se describe aquí, las imágenes de lapso de tiempo de NCC durante la incubación del cultivo (sección 6, paso 5) permiten la recopilación de datos adicionales sobre la direccionalidad y la persistencia de la migración y la dinámica de la motilidad celular (mediciones de protrusión de la membrana, adhesión, etc.) 14,24,27. La manipulación genética transitoria de embriones puede lograrse mediante electroporación18,28 de reactivos (morfolinos29, construcciones de expresión de ADN o vectores CRISPR30) en la etapa 4+17 de Hamburger y Hamilton. Estos embriones electroporados se pueden utilizar en el protocolo para crear cultivos migratorios NCC con pérdida de función o sobreexpresión de genes de interés. El análisis funcional también se puede lograr añadiendo inhibidores químicos a los medios de cultivos NCC 7,27 (sección 6, paso 2). El perfil a nivel poblacional de los NCC mediante análisis a nivel de ómica requiere la recolección de NCC como materia prima 7,11,31. Si bien los marcadores se han utilizado para aislar NCC a través de la clasificación celular activada por fluorescencia31, esto requiere un equipo especializado de citometría de flujo y disociación enzimática de las células. Seguir los métodos descritos aquí para extirpar cuidadosamente los pliegues neurales dorsales (minimizando la recolección del tubo neural ventral y las células del ectodermo no neural) proporciona un método económico para recolectar NCC premigratorias11 (sección 5, paso 4). La recolección de NCC después de la dispersión en cultivo (sección 6, paso 5) proporciona una población relativamente pura de NCC migratorias naturalmente segregadas para su posterior análisis (tinción HNK-1, un marcador de NCC migratorias, en la mayoría de las células cultivadas en la Figura 4D;como en 7). Finalmente, estas variaciones se pueden usar en combinación. Por ejemplo, la inmunofluorescencia o la imagen de lapso de tiempo pueden ser utilizadas para evaluar los efectos de las manipulaciones de la expresión génica o la adición de inhibidores27. En general, este protocolo adaptable y económico proporciona los medios para evaluar la morfología de las NCC migratorias craneales de tipo salvaje en cultivo con múltiples modificaciones potenciales para lograr varios objetivos experimentales.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Acknowledgments

Agradecemos a Corinne A. Fairchild y Katie L. Vermillion, quienes participaron en el desarrollo de nuestra versión del protocolo de cultivo del pliegue neural craneal del pollo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AxioObserver equipped with an LSM710 confocal scan head controlled by ZEN 3.0 SR software  Zeiss Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective
CaCl2 Sigma-Aldrich C3306
Chamber dishes (glass bottom, single or divided) MatTek; Cell Vis P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis)
X000NOK1OJ (Cellvis)		 Single chamber 35 mm or 4 chamber 35 mm
Cover glass Carolina Biological Supply Company 633029, 633031, 633033, 633035, 633037 circles, 0.13–0.17 mm thickness, available in 12-25 mm diameter 
DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 11320033 Alternative for L15 media
Egg incubator Sportsman 1502
FBS  Life Technologies 10437-028
Fibronectin Fisher Scientific CB-40008A
Filter paper Whatman grade 3MM chromatography
Forceps (blunt) Fisher Scientific; Thomas Scientific 08-890 (Fisher);1141W97 (Thomas)
Forceps (fine) Fine Science Tools 11252-20 Dumont #5
Image J https://fiji.sc/ Free image analysis software
KCl Sigma-Aldrich P3911
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662
L15 media Invitrogen 11415064
L-glutamine Invitrogen 25030
Mounting Media (Vectashield or ProLong Gold) Vector Laboratories; Thermofisher Scientific H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold)
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S9638
NaCl Sigma-Aldrich S9888
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin/streptomycin Life Technologies 15140-148 10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 mg/mL Streptomycin
Petri Dishes VWR (or similar) 60 mm, 100 mm
Phalloidin Sigma-Aldrich P1951 multiple flurophores available
Pin holder Fine Science Tools 26016-12 For tungsten needle (alternative for spring scissors)
Scissors (dissection) Fine Science Tools 14061-10
Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08 2.5 mm cutting edge (alternative for tungsten needle)
Sylgard Krayden Sylgard 184
Syringe Filters Sigma-Aldrich SLGVM33RS Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized
Tissue culture dishes Sarstedt 83-3900 35 mm culture dishes for bulk neural fold cultures
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Tungsten wire Variety of sources 0.01" diameter for tungsten needle (alternative for spring scissors)

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References

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Biología del desarrollo Número 184
Preparación y análisis morfológico de cultivos de células de cresta neural craneal de pollo
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Jacques-Fricke, B. T., Roffers-Agarwal, J., Gustafson, C. M., Gammill, L. S. Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures. J. Vis. Exp. (184), e63799, doi:10.3791/63799 (2022).

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