Summary
이 다목적 프로토콜은 병아리 배아에서 두개골 신경 주름의 절제를 통해 이식 신경 볏 세포 (NCC)의 분리를 설명합니다. 도금 및 배양 시 이동 NCC가 신경 접힘 외식편에서 나와 단순화된 2D 환경에서 세포 형태 및 이동을 평가할 수 있습니다.
Abstract
척추 동물이 발달하는 동안 신경 볏 세포 (NCC)는 광범위하게 이동하여 두개 안면 골격 및 말초 신경계와 같은 구조에 기여하는 다양한 세포 유형으로 분화합니다. 3D 배아의 맥락에서 NCC 이동을 이해하는 것이 중요하지만 2D 배양에서 이동 세포를 분리하면 시각화 및 기능적 특성화가 촉진되어 배아 연구를 보완할 수 있습니다. 본 프로토콜은 일차 NCC 배양물을 생성하기 위해 병아리 두개골 신경 주름을 단리하는 방법을 보여줍니다. 이동 NCC는 피브로넥틴으로 코팅된 기질에 도금된 신경 접힘 외식편에서 나옵니다. 그 결과 염색 및 정량적 형태학적 분석으로 평가할 수 있는 분산되고 부착된 NCC 집단이 생성됩니다. 이 단순화된 문화 접근 방식은 적응력이 뛰어나며 다른 기술과 결합할 수 있습니다. 예를 들어, NCC 이민 및 이동 행동은 타임 랩스 이미징에 의해 평가되거나 유전자 발현의 억제제 또는 실험적 조작 (예 : DNA, 모르 폴리 노 또는 CRISPR 전기 천공)을 포함하여 기능적으로 질의 될 수 있습니다. 다양성 때문에이 방법은 두개골 NCC 발달을 조사하기위한 강력한 시스템을 제공합니다.
Introduction
신경 볏 세포 (NCC)는 척추 동물 배아의 일시적인 세포 집단입니다. NCC는 신경판의 경계에 지정되며 등쪽 신경관1에서 이동하기 위해 상피에서 중간엽으로의 전이(EMT)를 겪습니다. EMT 후, NCC는 배아 전체에 광범위하게 분산되어 궁극적으로 두개 안면 골격, 심장의 유출로 및 대부분의 말초 신경계를 포함한 다양한 구조를 구별하고 기여합니다2. 세포 극성, 세포 골격 및 접착 특성의 변화는 이동 전 세포 집단에서 이동 세포 집단으로의 이러한 변화의 기초가됩니다3. NCC EMT 및 이동을 연구하면 세포 운동성의 기본 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하고 선천적 결함 및 암 전이를 예방하고 치료하기위한 노력을 알 수 있습니다.
생체 내 분석은 배아 맥락에서 NCC 발달 과정을 이해하는 데 필수적이지만 시험관 내 방법은 추가적인 실험 경로를 용이하게 하는 시각적 및 물리적 접근성을 제공합니다. 단순화된 2D 환경에서는 NCC 형태, 세포골격 구조 및 이동한 거리를 평가할 수 있습니다. 또한, 운동성 NCC의 이동 행동에 대한 유전 적 또는 용해성 인자 섭동의 영향을 분석 할 수 있습니다 4,5,6,7,8,9,10. 또한, 분리 된 예비 또는 이동 NCC는 단백질체, 전사체 및 후성 유전체 프로파일 링 7,11을 통해 NCC의 발달 조절을 연구하기위한 고 처리량 방법론에 수집, 풀링 및 사용될 수 있습니다. 다양한 발달 모델 유기체12,13,14로부터 두개골 NCC를 준비하는 방법을 사용할 수 있지만, 이 기사는 병아리 배아에서 두개골 NCC를 배양하는 방법을 처음 배우는 사람들을 위한 접근 방식의 메커니즘을 보여줍니다.
현재 프로토콜은 병아리 두개골 NCC 배양을 준비하기 위한 다목적 기술을 설명합니다(그림 1). NCC는 이식된 신경 주름에서 배양 기질로 쉽게 이동하기 때문에 병아리 NCC는 배아 조직에서 자연적으로 분리되고 1차 배양이 쉽게 생성됩니다. 중뇌 NCC가 두개골 신경 주름으로부터 한꺼번에 이동함에 따라 (몸통15의 연장 된 세포 별 박리와는 대조적으로), 이들 배양은 주로 이동 두개골 신경 볏 세포로 구성되며, 초기 신경 접힘 절제는 예비 NCC에 대한 수집 방법을 제공한다. 병아리 두개골 신경 주름을 해부하고 배양하는 기본 방법이 자세히 설명되어 있으며이 방법에 대한 다양한 응용 및 변형에 대한 제안이 제공됩니다.
그림 1: 병아리 두개골 신경접힘 배양 프로토콜의 개략도. (A,B) 두개골 신경 주름 (파란색 윤곽선)은 5 개의 체세포가있는 병아리 배아에서 절제됩니다 (A의 등쪽 보기에 표시). 회색 밴드, 심장 초승달. (C) 피브로넥틴에 도금하면 이동 신경 볏 세포가 신경 주름에서 나와 기질 상으로 분산됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
화이트 레그혼, 골든 섹스 링크 또는로드 아일랜드 레드를 포함한 다양한 갈 루스 갈 루스 품종을 사용할 수 있습니다. 본 연구에 사용 된 닭고기 달걀은 다양한 품종이었으며 지역 농장과 부화장을 포함한 여러 출처에서 얻었습니다.
1. 용액 및 재료 준비
- 123.3 mM NaCl, 1.53 mMCaCl2, 4.96 mM KCl, 0.809 mM Na2HPO4, 및 0.147 mM KH2PO4를 혼합하여 링거 용액을 준비합니다(재료 표 참조). pH를 7.4로 조정하고 100mL 병에 필터 멸균합니다. 깨끗하고 건조한 곳에 보관하십시오. 비누로 병을 씻지 마십시오 (조직 배양 유리 제품으로 처리).
- FN을 멸균 링거 용액에 용해시켜 1mg/mL 원액 피브로넥틴(FN)( 재료 표 참조)을 준비하고 -80°C에서 100μL 분취량으로 보관합니다(최소 4년 동안 안정).
- L15 배지에 0.8% L-글루타민, 0.08% 페니실린/스트렙토마이신, 10% FBS 및 10% 병아리 배아 추출물12를 보충하여 완전한 배양 배지를 준비합니다. 3mL 분취량을 만들고 -20 °C 또는 -80 °C에서 보관하십시오.
참고: 배양물을 CO2 인큐베이터에서 배양하는 경우 DMEM/F12 를 공기로 완충된 L15로 대체해야 합니다. - 1x PBS에서 4% 파라포름알데히드 용액을 준비합니다. pH를 7.4로 조정합니다. 10mL 분취량을 만들어 -20°C에서 보관합니다.
주의 : 파라 포름 알데히드는 흄 후드에서 취급해야합니다. - 여과지 지지 프레임(장축에 겹치는 두 개 또는 세 개의 천공 구멍이 있는 약 1cm x 1.5cm 직사각형 용지)을 준비합니다.
- 표준 3구멍 펀치를 사용하여 큰 여과지의 가장자리를 따라 구멍을 뚫고 펀칭된 가장자리를 스트립으로 자르거나 다듬은 다음 구멍 사이의 스트립을 직사각형 ~ 1.5cm 길이로 자릅니다. 사용하기 전에 오토클레이브 여과지(옵션).
- 가는 집게, 무딘 집게, 해부 가위, 스프링 가위, 날카로운 텅스텐 바늘을 포함한 해부 도구를 모으십시오16.
2. 배아 배양
- 위에서 언급 한 출처 중 하나에서 수정란을 얻으십시오.
- 수정란을 38°C(100°F)의 가습 인큐베이터 내부에 수직 위치(뾰족한 끝이 아래로/뭉툭한 쪽이 위로 향하도록 계란의 장축)에 놓습니다.
- 4-7 개의 체세포가 형성 될 때까지 배양하십시오 (8 +-9 단계)17, 약 35 시간이 걸립니다.
알림: 배양 시간은 균주, 암탉의 나이, 계절 등에 따라 크게 다를 수 있으며 실험적으로 결정해야 합니다. 프로그래밍 가능한 출구 타이머는 원하는 타이밍을 얻기 위해 야간에 배양을 시작하는 데 유용합니다. - 인큐베이터에서 꺼낸 후 계란에 70 % 에탄올을 완전히 뿌리고 건조시켜 껍질을 소독하십시오.
알림: 배아는 즉시 수집 할 수 있지만 계란을 실온으로 식히면 노른자의 취약성과 수집 중 배아 손실이 줄어 듭니다.
3. 문화 요리 준비
- 다운스트림 응용 분야에 적합한 신경 접힘 배양 접시( 재료 표 참조)를 선택하십시오.
- 고정되고 염색 될 배양의 경우 멀티 웰 조직 배양 접시에 놓인 유리 커버 슬립을 사용하십시오.
알림: 웰 크기와 일치하는 커버슬립은 유체 혼합으로 덜 움직이므로 체외이식편이 이동할 가능성이 줄어들고 접시 바닥이 아닌 커버슬립에 부착될 가능성이 높아집니다. - 유리 바닥 단일 챔버 또는 분할된 챔버 접시( 재료 표 참조)를 선택하여 도립 현미경을 사용한 라이브 이미징을 수행합니다.
- 정립 또는 실체 현미경에서 라이브 이미징을 하려면 광학적으로 적합한 6웰, 12웰 또는 24웰 조직 배양 플레이트를 사용하십시오.
- 고처리량 분석을 위해 이동하는 신경 볏 세포의 대량 수집을 위해 플라스틱 조직 배양 접시를 선택하십시오.
- 고정되고 염색 될 배양의 경우 멀티 웰 조직 배양 접시에 놓인 유리 커버 슬립을 사용하십시오.
- 멸균 링거 용액 100mL 병에 10 U / mL의 페니실린과 10 μg / mL의 스트렙토 마이신을 추가합니다 (예 : 10,000 U / mL 페니실린 100 μL 및 10,000 μg / mL 스트렙토 마이신, 링거 P / S를 만들기 위해). 1주일 이내에 링거의 P/S를 사용하십시오.
- 얼음에서 FN 1mg/mL의 분취량을 해동합니다. 링거의 P/S로 FN 10-100μg/mL의 농도로 희석합니다.
- 우물이나 접시의 바닥을 덮기에 충분한 FN 용액을 피펫하십시오. 예를 들어, 24웰 플레이트의 경우 웰당 100μL, 35mm 접시의 경우 500μL입니다.
- 뚜껑을 교체하고 신경 주름을 해부하면서 38 ° C (100 ° F)의 가습 인큐베이터 (또는 증류수에 적신 종이 타월이있는 덮은 트레이)에서 FN 용액으로 접시 또는 접시를 1 시간 이상 배양합니다.
4. 병아리 배아의 분리
- 계란의 방향을 유지하도록주의하십시오 (배아는 부화 중에 노른자 꼭대기로 떠 다닙니다). 가위 또는 무딘 집게를 사용하여 달걀 길이의 약 1/4-1/3 정도 떨어진 껍질에 작은 구멍을 뚫습니다.
- 가위 끝이나 무딘 집게를 작은 구멍에 조심스럽게 삽입하여 노른자를 방해하지 않도록하고 달걀 주위의 달걀 껍질을 잘라 달걀 껍질의 상단을 제거합니다 (그림 2A).
- 격리를 위해 배아를 배치하십시오.
알림: 배아가 껍질 컵에 이상적으로 위치하지 않으면 무딘 집게를 사용하여 노른자를 조심스럽게 돌려 배아가 맨 위에 오도록하십시오. 또는 노른자를 컵이 달린 손에 붓고 노른자가 깨지지 않도록 주의하고 알부민이 배출되도록 합니다(그림 2B). 그런 다음 노른자를 손에서 손으로 움직여 배아를 배치 할 수 있습니다. - 닫힌 무딘 집게의 평평한 가장자리를 사용하여 배아를 덮고 있는 노른자 표면에 남아 있는 과도한 알부민을 닦아내어 배아를 준비합니다(그림 2C). 과도한 알부민은 섬세한 작업 와이퍼로 부드러운 압력을 사용하여 제거 할 수도 있습니다.
알림: 알부민이 제거되면 노른자 표면이 매끄럽지 않고 질감이 있어야 합니다. 충분한 알부민을 닦아내지 못하면 섹션 4, 단계 4에서 지지된 여과지의 접착이 저해된다. - 집게를 사용하여 배아 위에 여과지 지지 프레임을 놓고 배아는 프레임 창에 놓습니다. 여과지를 부드럽게 눌러 노른자에 부착시킵니다.
- 해부 가위로 여과지 프레임 외부를 자릅니다(그림 2D). 집게 또는 가위 팁을 사용하여 프레임의 가장자리를 잡고 배아를 노른자에서 부드럽게 들어 올립니다 (그림 2E). 비스듬히 들어 올리면 노른자에서 배아를 깨끗하게 제거하는 데 도움이됩니다.
- 종이 프레임 면이 아래로(배아 복부 쪽이 위로) 배아를 Ringer의 P/S로 채워진 60mm 또는 100mm 페트리 접시에 놓습니다(그림 2F). RNA 또는 단백질에 민감한 다운스트림 적용을 위해 수집하는 경우 배아 접시를 얼음 위에 보관하십시오.
알림: 배아를 복부 쪽이 위로 향하게 놓지 않으면 종이 프레임에서 분리될 위험이 있습니다. 여러 배아를 수집하여 신경 접힌 해부 단계로 이동하기 전에 최대 1시간 동안 링거의 P/S에 보관할 수 있습니다.
5. 신경 주름 해부
- 배아를 Ringer의 P/S 용액이 담긴 깨끗한 접시에 옮기고 여과지 프레임을 집게로 잡고 앞뒤로 부드럽게 휘둘러 배아의 시야를 가리는 노른자를 제거하여 배아를 헹굽니다. 링거의 P/S를 교환하거나 흐려지면 신선한 접시에 옮깁니다.
- 해부 현미경 아래에서 배아 등쪽/프레임 쪽이 위로 향하도록 배치합니다. 배아를 종이 프레임에 올려 팽팽하게 유지하고 제자리에 고정시킨 다음 집게를 사용하여 유리막을 제거하여 신경 주름을 노출시킵니다.
참고: 배아가 종이 프레임에서 떨어지면, 배아를 접시에 평평하게 놓거나 해부를 위해 실가드 코팅 접시(18 )에 고정할 수 있다. - 스프링 가위 또는 날카로운 텅스텐 바늘을 사용하여 중뇌 신경 주름을 조심스럽게 절제하십시오. 확장 시신경 소포에 조직 꼬리를 포함하고 마름모꼴 수축이 막 나타나기 시작한 뒷뇌에 주둥이를 포함합니다(심장 초승달도 유용한 지표입니다(그림 3B,C). 최소한의 오염 신경관과 비신경 외배엽으로 신경 주름의 등쪽 가장 측면을 절제하도록 주의하십시오(그림 3C).
- P20 피펫터 또는 노른자 링거 P/S로 헹구어 멸균 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 링거 P/S가 포함된 깨끗한 접시에 신경 주름을 옮깁니다(이렇게 하면 조직이 달라붙는 것을 방지하기 위해 플라스틱이나 유리가 차단됨). 추가 주름을 해부하면서 수집 된 주름을 얼음에 보관하십시오.
6. 신경 주름 도금
- 완전한 배양 배지의 부분 표본을 해동합니다(섹션 1, 3단계). 100 U/mL의 페니실린과 100 μg/mL의 스트렙토마이신을 추가하고 필터 살균합니다. 다른 단계를 수행하는 동안 준비된 매체를 37-38 ° C에 보관하십시오.
- 인큐베이터에서 배양 접시를 제거하십시오 (섹션 3, 5 단계). 피펫터 또는 파스퇴르 피펫을 사용하여 커버슬립, 접시 또는 우물에서 FN 용액을 제거합니다. FN 코팅 기판을 Ringer's P/S로 헹군 후 적절한 양의 완전한 배양 배지를 접시 또는 웰에 추가합니다(24웰 플레이트의 웰의 경우 500μL, 35mm 접시의 경우 2mL 또는 6웰 플레이트).
참고: 부피가 작으면 값비싼 시약(예: 24웰 플레이트의 경우 200μL)을 보존할 수 있지만 증발을 방지하기 위해 접시가 충분히 가습되도록 합니다. - p20 또는 p200 피펫터를 사용하여 먼저 노른자 링거의 P/S로 피펫 팁을 헹구어 플라스틱을 막고 조직이 달라붙는 것을 방지합니다. 그런 다음 분리된 신경 주름을 FN 코팅 커버슬립에 옮기고 가능한 한 적은 Ringer의 P/S를 전달하도록 주의하십시오. 접힌 부분을 FN 코팅 커버슬립의 중앙을 향해 놓습니다.
알림: 하나 또는 몇 개의 신경 주름은 19mm 웰의 12mm 커버슬립에 도금할 수 있으며 35mm 플레이트에는 최대 50개까지 도금할 수 있습니다. - 체외이식편이 10-15분 동안 가라앉도록 한 후, 도금된 신경 주름이 있는 배양 접시를 천천히 조심스럽게 운반하여 38°C(100°F)의 가습 챔버에 넣습니다. 이렇게하면 우물에서 신경 주름의 이동을 최소화하여 분산된 상태를 유지하고 덮개 슬립에 부착할 수 있습니다.
알림: L15(DMEM 아님)를 사용하는 경우 식체이식편 배양 접시를 적신 종이 타월이 있는 덮개가 있는 트레이를 사용하여 계란 인큐베이터에서 배양할 수도 있습니다. - 활성 이동 기간 동안 가습 된 인큐베이터에서 신경 폴드 배양을 배양합니다 (총 약 16-20 시간, 그림 4).
7. 형태학적 분석을 위한 배양된 이동 NCC의 고정 및 염색
- 파스퇴르 피펫으로 배양 배지를 제거하고 필터 멸균된 1x PBS로 웰을 헹굽니다.
- 실온에서 4 분 동안 15 % 파라 포름 알데히드를 첨가하십시오.
알림: 고정 시간은 실험적으로 결정해야 할 수 있습니다. 또한 파라포름알데히드를 10분(50:50) 동안 배지에 직접 첨가하고, 제거한 후 희석되지 않은 4% 파라포름알데히드로 10분 동안 교체하여 보다 섬세한 세포 구조를 유지할 수도 있습니다. - 파라포름알데히드를 제거하고 1x PBS로 3회 헹굽니다.
- 형태학적 평가를 위해 고정된 NCC를 적절한 염료로 염색합니다. 예를 들어, 오레곤 그린 공액 팔로이딘을 사용한 염색이 여기에 자세히 설명되어 있습니다.
참고 : phalloidin19로 액틴 세포 골격을 시각화하면 비교적 균일 한 염색 강도를 가진 이동 NCC의 구조적 복잡성이 드러납니다. 그러나 팔로이딘은 모든 세포 영역을 강조 표시하지 않을 수 있습니다. 원형질막(예: 밀 배아 응집소 또는 DiI) 또는 세포질을 표지하는 염료도 사용할 수 있지만 밝게 염색되는 세포체에 비해 미세한 돌출부의 이미징을 복잡하게 만듭니다. 또한, 면역 형광은 신경 볏 세포를 HNK-1로 표지하거나 관심 단백질의 세포 내 국소화를 결정하기 위해 동시에 수행 될 수있다 7,20.- 최종 PBS 린스를 제거하고 PBS + 0.5% 트리톤 X-100(PBST) + 5% 혈청(FBS 또는 항체로 공동 염색하기에 적합한 다른 동물로부터)을 추가하여 커버슬립을 덮고 실온에서 플랫폼 쉐이커에서 10분 동안 인큐베이션합니다.
- 각 커버슬립에 대해 매끄러운 표면(예: 유연한 파라핀 밀봉 필름)에 오레곤 그린 공액 팔로이딘(PBST + 5% 혈청으로 희석)의 200nM을 피펫합니다. 12mm 커버슬립의 경우 30μL 부피를 피펫팅합니다.
- 한 쌍의 집게를 사용하여 PBST + 5 % 혈청에서 커버 슬립을 제거하여 세포의 방향이 위쪽을 향하도록 유지합니다. 커버슬립의 가장자리를 섬세한 작업 와이퍼에 짧게 대면 과도한 액체를 배출합니다.
- 각 커버슬립 셀 면을 아래로 향하게 하여 희석된 팔로이딘 방울에 부드럽게 놓습니다. 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 염색하는 동안 커버 슬립을 어둠 속에 보관하십시오 (알루미늄 호일로 덮인 접시로 덮거나 서랍에 넣으십시오).
- 인큐베이션 동안, PBST를 배양 접시의 웰에 첨가한다(24-웰 플레이트의 각 웰에 대해 750 μL의 PBST).
- 배양 기간이 끝나면 염색 용액에서 커버슬립을 들어 올려 배양 접시에 다시 넣고 커버슬립을 뒤집어 세포 쪽이 위로 오도록 합니다. 커버슬립이 PBST로 덮여 있는지 확인하고 플랫폼 셰이커에 10분 동안 놓고 커버슬립을 덮고 어두운 곳에 두십시오. PBST를 제거하고 이 단계를 두 번 반복하여 총 3회 10분 세척합니다.
- 현미경 슬라이드에 장착 미디어( 재료 표 참조)를 한 방울(커버슬립당)로 놓습니다. 25μL 부피는 12mm 커버슬립에 적합합니다.
- PBST로 최종 세척한 후 커버슬립의 가장자리를 섬세한 작업 와이퍼에 접촉하여 커버슬립의 셀 쪽을 추적하면서 과도한 액체를 제거합니다.
- 기포가 생기지 않도록 커버슬립을 장착 매체 위로 비스듬히 천천히 내려 커버슬립 셀 면을 아래로 향하게 장착합니다. 이미징하기 전에 미디어를 설정합니다.
8. 배양 철새 NCC의 형태 학적 평가
- 염색된 세포를 이미지화하고 .tiff 파일로 내보냅니다.
참고: 40x 대물렌즈는 이미징 배양에 적합하지만 10x(이동 NCC의 전체 필드를 캡처하기 위해)에서 100x(단일 NCC)에 이르는 대물렌즈를 사용하여 형태학적 평가를 위한 이미지를 수집할 수 있습니다. 본 연구의 이미지는 역 다중 모드 이미징 플랫폼을 사용하여 캡처되었습니다 ( 재료 표 참조). - 이미지를 이미지 분석 소프트웨어에 업로드합니다(ImageJ21, 재료 표 참조). 이미지 > 복제 를 클릭하여 분석에 사용할 각 이미지의 두 번째 복사본을 만들어 대부분의 이미지 처리를 되돌릴 수 없으므로 원본을 편집하지 않은 상태로 둡니다.
- 이미지 > > 밝기/대비 조정을 클릭하고 슬라이딩 막대를 사용하여 이미지의 밝기 또는 대비를 조정합니다.
- 아래 단계에 따라 이미지를 회색조로 변환합니다.
- 이미지를 RGB로 내보내면 RGB로 병합된 채널로 업로드됩니다. 이미지를 분리하려면 [ 이미지 > 컬러] > [채널 분할 ]을 클릭하여 단일 채널 회색조 이미지를 획득합니다.
- 이미지가 이미 분리 된 경우 이미지 > 유형 > 8 비트 로 이동하여 파일을 회색조로 변환하십시오.
- 이미지 > > 임계값 조정을 클릭하여 픽셀이 셀(전경, 검정) 또는 배경(흰색)으로 식별되는 이진 이미지로 변환합니다. 슬라이딩 막대를 사용하거나 자동 을 클릭하여 배경에서 셀을 명확하게 정의하는 임계값 설정을 선택합니다.
- 세포가 겹치거나 염색이 연속적이지 않은 경우, 유역 또는 구멍 채우기 기능(22)을 사용하여 추가로 처리해야 할 수 있다. 이렇게 하면 세포가 서로 분리되거나 분석할 세포 내의 간격이 채워집니다. > 바이너리 처리 > 바이너리 만들기를 클릭하여 먼저 이미지를 8비트 바이너리 형식으로 변환합니다. 그런 다음 > 이진 > 유역 또는 구멍 채우기를 클릭합니다.
알림: 소프트웨어는 신호를 분리하거나 채워야 하는 위치에 가장 적합하며 필요한 경우 플러그인을 사용하여 추가로 조정할 수 있습니다.
- 세포가 겹치거나 염색이 연속적이지 않은 경우, 유역 또는 구멍 채우기 기능(22)을 사용하여 추가로 처리해야 할 수 있다. 이렇게 하면 세포가 서로 분리되거나 분석할 세포 내의 간격이 채워집니다. > 바이너리 처리 > 바이너리 만들기를 클릭하여 먼저 이미지를 8비트 바이너리 형식으로 변환합니다. 그런 다음 > 이진 > 유역 또는 구멍 채우기를 클릭합니다.
- 캡처할 측정값을 선택합니다. 분석 > 측정 설정을 클릭하고 원형도(원형), 종횡비(AR), 진원도(원형) 및 견고성 분석을 위한 모양 설명자 상자를 선택합니다.
참고: 필요한 분석 유형에 따라 면적 및 둘레와 같은 다른 측정도 포함될 수 있습니다. - 입자 분석 > 분석을 클릭하고 "입자 분석" 메뉴에서 매개변수를 설정합니다.
- "Size"에서 Size 매개 변수가 0-무한대로 설정된 경우(예: 그림 5에서 500-Infinity로 설정됨) 배경 신호 또는 더 작은 셀 조각도 포함되므로 관심 있는 셀 또는 입자의 크기를 픽셀 단위로 대략적으로 추정합니다.
참고: 크기를 더 좁은 범위로 조정하면 분석에 필요한 것보다 작거나 큰 입자를 제외할 수 있습니다. - "원형도"에서 0-1.0으로 두어 이미지의 모든 셀 모양을 측정합니다.
- "표시"의 드롭 다운 메뉴에서 베어 윤 곽선을 선택하여 "입자 분석"기능으로 선택한 셀 윤곽선을 검사합니다. 윤곽선을 스캔하여 겹치는 셀이 구별되지만 셀이 불필요하게 분할되지 않는지 확인합니다. 또한 "결과 표시", "요약" 및 "관리자에 추가"에 대한 메뉴 상자를 선택합니다.
- "Size"에서 Size 매개 변수가 0-무한대로 설정된 경우(예: 그림 5에서 500-Infinity로 설정됨) 배경 신호 또는 더 작은 셀 조각도 포함되므로 관심 있는 셀 또는 입자의 크기를 픽셀 단위로 대략적으로 추정합니다.
- 모든 매개 변수가 설정되면 확인을 클릭하십시오.
참고: (1) 이미지에서 식별된 셀의 윤곽선, (2) 이미지에서 카운트된 셀, (3) 각 셀의 측정 결과, (4) 카운트된 셀의 총 수 및 평균 측정값에 대한 요약을 보여주는 4개의 개별 창이 나타납니다.- 파편이 계산된 경우, 겹치는 셀은 하나로 계산되거나, 단일 셀은 배수로 계산되거나, 많은 셀이 카운트에서 생략된 경우, 편집되지 않은 원본 이미지로 돌아가서 다른 복제본을 만들고 "임계값" 또는 기타 매개변수를 조정합니다.
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Representative Results
현재 프로토콜의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 배양 된 알을 열고, 표면에 배아가있는 노른자를 장갑을 낀 손바닥에 부드럽게 부어 분리했습니다 (그림 2A, B). 알부민을 제거한 후(그림 2C), 여과지 프레임을 배아를 둘러싸고 있는 노른자 막에 적용하여 노른자에서 배아를 쉽게 자르고 들어 올렸으며, 이는 난황막이 절단되면 유출되기 시작합니다(그림 2D, E).
그림 2: 4-7개의 소마이트 병아리 배아의 분리. 수정란을 35시간 동안 배양하였다. 무딘 집게 (A)로 계란을 열고 노른자를 장갑을 낀 손 (B)에 부었다. 과량의 알부민은 여과지 지지체(D, 삽입물)가 노른자에 부착되도록 제거하였다(C). 배아는 노른자(D)에서 잘라내어 떼어내고(E) 링거의 P/S(F)에 넣었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
배아를 헹구고 Ringer의 P/S를 청소하기 위해 이동한 후, 분리된 배아에서 신경 주름이 보였습니다(그림 3A). 이 주름에는 이동 전 두개골 신경 볏 세포가 포함되어 있습니다. 배아에서 절제하고(그림 3B, C) 수집하면(그림 3D), 분리된 신경 주름을 도금하여 이동 NCC 배양을 만들 수 있습니다.
그림 3: 병아리 등쪽 신경 주름의 해부. Ringer의 P / S에서 일하면서 스프링 가위를 사용하여 신경 주름을 절제했습니다. (A) 배아 등쪽보기, 그림의 상단을 향해 앞쪽. 신경 주름은 주변 조직보다 더 불투명하게 보입니다. 중뇌 신경 주름은 시엽 뒤쪽 (분홍색)과 심장 초승달 (노란색) 앞쪽에 있습니다. (B) 신경 주름이 제거 된 후 배아의 등쪽 모습, 절제 경계를 보여줍니다. (C) 신경 주름이 제거 된 배아의 측면보기. 해부 기술은 등쪽 신경관을 제거하여 복부 및 비신경관 구조를 피합니다. (D) 링거의 P/S에서 분리된 신경 주름 스케일 바 = 300 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
신경 주름이 FN에 도금되었을 때, NCC는 배양 후 3-4 시간 이내에 부착 된 신경 폴드 외식 편에서 나오기 시작했으며 (그림 4A), 약 20 시간 후에 이동이 완료되었습니다 (그림 4B). 이동하는 NCC20을 표지하는 HNK-1 염색은 배양에서 대부분의 세포에서 분명했습니다(그림 4D). 신경 주름이 커버 슬립에 부착되지 않았거나 외식편에서 NCC가 이동하지 않았을 때 음성 결과가 발생했습니다 (데이터는 표시되지 않음). NCC는 배양물을 고정하고, 필라멘트 액틴을 염색하고, ImageJ에서 다양한 측정을 수행하여 NCC 형태 및 이동을 평가하여 분석했습니다(그림 5). 분석 된 69 개의 세포의 평균 면적은 802.11 ± 69.65 μm 2 였고 범위는 60.27-2664.53 μm2였으며 막대 그래프 및 바이올린 플롯 (그림 5C)과 같이 분포했습니다. 세포의 돌출도를 반영하는 측정 값인 원형도(공식: 원형도 = 4π(면적/둘레²))는 0.101-0.875 범위였으며 평균 0.38± 0.15였습니다. 값이 낮을수록 길쭉한 모양을 나타내고 값 1은 완벽한 원을 나타냅니다. 바이올린 플롯에서 분명히 알 수 있듯이 대부분의 세포는 길쭉한 모양을 나타냅니다 (그림 5D). 셀 모양의 또 다른 척도는 종횡비(AR)로, 이는 셀의 장축을 보조 축으로 나눈 값입니다. AR 값 1은 대칭 형상23을 나타냅니다. 이 분야의 이동 NCC는 평균 AR이 2.13 ± 0.11이며 값은 1.14-5.59입니다 (그림 5E). NCC 형태학의 이러한 정량적 측정을 사용하여 실험 조건과 다른 발표 된 연구간에 엄격한 비교를 할 수 있습니다.
그림 4: 이동성 NCC는 배양된 신경 주름에서 나온다. 3시간의 배양(A) 및 20시간의 배양(B) 후 도금된 신경 주름의 명시야 이미지. 스케일 바 = 200 μm. (씨,디) 신경 폴드는 20 시간의 배양 후에 크게 분산되지만 이러한 이미지의 오른쪽에 남아 있습니다. 스케일 바 = 500 μm. 이동 NCC는 DAPI(C) 및 HNK-1 염색(D)으로 볼 수 있습니다. HNK-1 면역염색은 배양된 세포가 이동하는 NCC임을 확인한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 배양 된 철새 NCC의 형태 학적 평가. (A) NCC에서 필라멘트 액틴의 팔로이딘 염색은 배양에서 20시간 후에 신경 접힘으로부터 이동하였다. 스케일 바 = 50 μm. (B) 셀이 검은 색으로 나타나고 배경이 흰색으로 나타나는 임계 값 이미지. 노란색 윤곽선은 셀로 계산된 개체를 둘러싸고 셀에 번호가 매겨집니다. (씨-에) 형태학적 평가 데이터를 표시하는 그래프 옵션. 막대 그래프 및 바이올린 플롯은 측정된 세포의 면적(μm2, C), 원형도(D) 및 종횡비(E)를 나타내기 위해 패널 B에 표시된 69개 세포의 측정으로부터 생성되었습니다. 막대 그래프는 각 패널의 왼쪽에 평균의 표준 오차를 나타내는 오차 막대와 함께 평균값을 표시합니다. 바이올린 플롯은 app.rawgraphs.io 로 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 기술은 병아리 신경 주름을 분리하고 철새 두개골 NCC의 배양을 만들기 위해 도금하는 적응 가능한 방법을 제공합니다. 이러한 배양은 병아리 NCC 이동 및 형태를 쉽게 분석할 수 있는 단순화된 2D 조건을 제공하며, 이는 ovo 이미징 방법24,25,26에서 기술적으로 더 어려운 것을 보완할 수 있습니다. 이 시험관 내 방법은 비교적 간단하지만 일관된 결과는 고품질 계란과 시약에 달려 있습니다. 또한 배양의 고유 한 가변성으로 인해 재현성에는 실험적 반복 및 정량이 필요합니다.
FN에 대한 신경 주름의 접착은 배양에서 NCC 이동에 필수적입니다. 때때로, 체외 이식편이 제대로 부착되지 않을 것이고, 신경 폴드가 떠내려가거나 이동 NCC가 없거나 거의 생성되지 않을 것입니다. 이것은 두개골 신경 접힘이 잘린 면이 아래로 향하지 않을 때 발생할 수 있습니다. 배양 전에 배양 용기에서 체외 이식편의 방향을 잡고 이동하기 전에 10-15분 동안 정착되도록 합니다. 그러나 인큐베이터로 옮기는 동안 유체 혼합으로 인해 일부 신경 주름은 필연적으로 때때로 차선책으로 부착됩니다. 전체 실험에서 접착 및 이동이 문제가 되는 경우 이는 오래된 FN(모든 실험에 대해 -80°C의 새로운 분취량 사용), 만료된 성분이 있는 배양 배지(-20°C에서 실험 크기의 분취량으로 준비된 배지를 저장하고 사용 시 새 항생제 추가) 또는 세포 배양에 적합하지 않은 커버슬립 사용(예: 세포는 조직학을 위해 커버 슬립에 부착되지 않습니다). 오염된 인큐베이터는 또한 전체 NCC 배양 실험이 실패할 수 있습니다.
배양에서 분산된 NCC를 생성하고 이동 NCC 형태를 분석할 수 있는 것 외에도 이 프로토콜은 다른 많은 실험의 출발점이기도 합니다. 커버슬립에 플레이팅된 체외이식편은 또한 관심있는 단백질의 세포하 국소화를 결정하기 위해 면역형광법(섹션 7, 단계 3 이후)을 위해 처리될 수 있다7. 여기에 설명된 대로 고정 배양에서 형태 및 이동 거리 분석이 가능하지만 배양 배양 중 NCC의 타임랩스 이미징(섹션 6, 5단계)을 통해 이동의 방향성 및 지속성 및 세포 운동성의 역학(막 돌출, 접착력 등의 측정)에 대한 추가 데이터 수집이 가능합니다. 14,24,27. 배아의 일시적인 유전자 조작은 햄버거 및 해밀턴 단계 4+17에서 시약(모르폴리노 29, DNA 발현 구축물 또는 CRISPR 벡터30)의 전기천공18,28에 의해 달성될 수 있다. 이러한 전기 천공 된 배아는 프로토콜에서 기능 상실 또는 관심 유전자의 과발현을 갖는 이동 NCC 배양을 만드는 데 사용될 수 있습니다. 기능 분석은 NCC 배양물 7,27의 배지에 화학 억제제를 첨가함으로써 달성 될 수있다 (섹션 6, 단계 2). -omics 수준 분석을 통한 NCC의 인구 수준 프로파일 링은 NCC를 원료로 수집해야합니다 7,11,31. 마커는 형광-활성화 세포 분류(31)를 통해 NCC를 분리하는데 사용되었지만, 이를 위해서는 특수한 유세포분석 장비 및 세포의 효소적 해리가 필요하다. 등쪽 신경 주름을 조심스럽게 절제하기 위해 여기에 설명된 방법에 따라(복부 신경관 및 비신경 외배엽 세포의 수집을 최소화함) 예비 NCC(11)를 수집하는 저렴한 방법을 제공합니다(섹션 5, 단계 4). 배양물에 분산된 후 NCC를 수집하면(섹션 6, 단계 5) 추가 분석을 위해 자연적으로 분리된 이동 NCC의 비교적 순수한 집단을 공급합니다(그림 4D의 대부분의 배양 세포에서 이동 NCC의 마커인 HNK-1 염색;도 7에서와 같이). 마지막으로, 이러한 변형은 조합하여 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 면역형광 또는 타임-랩스 이미징을 사용하여 유전자 발현 조작 또는 억제제27의 첨가의 효과를 평가할 수 있다. 전반적으로, 이 적응 가능하고 저렴한 프로토콜은 다양한 실험 목표를 달성하기 위해 여러 잠재적 수정을 통해 배양에서 야생형 두개골 이동 NCC의 형태를 평가하는 수단을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
병아리 두개골 신경구 배양 프로토콜 버전 개발에 참여한 Corinne A. Fairchild와 Katie L. Vermillion에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AxioObserver equipped with an LSM710 confocal scan head controlled by ZEN 3.0 SR software | Zeiss | Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Chamber dishes (glass bottom, single or divided) | MatTek; Cell Vis | P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) X000NOK1OJ (Cellvis) |
Single chamber 35 mm or 4 chamber 35 mm |
| Cover glass | Carolina Biological Supply Company | 633029, 633031, 633033, 633035, 633037 | circles, 0.13–0.17 mm thickness, available in 12-25 mm diameter |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | Alternative for L15 media |
| Egg incubator | Sportsman | 1502 | |
| FBS | Life Technologies | 10437-028 | |
| Fibronectin | Fisher Scientific | CB-40008A | |
| Filter paper | Whatman | grade 3MM chromatography | |
| Forceps (blunt) | Fisher Scientific; Thomas Scientific | 08-890 (Fisher);1141W97 (Thomas) | |
| Forceps (fine) | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| Image J | https://fiji.sc/ | Free image analysis software | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| L15 media | Invitrogen | 11415064 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Mounting Media (Vectashield or ProLong Gold) | Vector Laboratories; Thermofisher Scientific | H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold) | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-148 | 10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 mg/mL Streptomycin |
| Petri Dishes | VWR (or similar) | 60 mm, 100 mm | |
| Phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | multiple flurophores available |
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | For tungsten needle (alternative for spring scissors) |
| Scissors (dissection) | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | 2.5 mm cutting edge (alternative for tungsten needle) |
| Sylgard | Krayden | Sylgard 184 | |
| Syringe Filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Tissue culture dishes | Sarstedt | 83-3900 | 35 mm culture dishes for bulk neural fold cultures |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Tungsten wire | Variety of sources | 0.01" diameter for tungsten needle (alternative for spring scissors) |
References
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