Ce protocole polyvalent décrit l’isolement des cellules de la crête neurale prémigratoire (CCN) par l’excision des plis neuraux crâniens des embryons de poussins. Lors du placage et de l’incubation, les NCC migrateurs émergent des explants de plis neuraux, ce qui permet d’évaluer la morphologie et la migration des cellules dans un environnement 2D simplifié.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Préparation et analyse morphologique de cultures de cellules de crête neurale crânienne de poussin
Dans cet article
Résumé
Résumé
Au cours du développement des vertébrés, les cellules de la crête neurale (NCC) migrent largement et se différencient en différents types de cellules qui contribuent à des structures telles que le squelette craniofacial et le système nerveux périphérique. Bien qu’il soit essentiel de comprendre la migration des NCC dans le contexte d’un embryon 3D, l’isolement des cellules migratrices en culture 2D facilite la visualisation et la caractérisation fonctionnelle, complétant ainsi les études embryonnaires. Le présent protocole démontre une méthode pour isoler les plis neuraux crâniens des poussins afin de générer des cultures primaires de NCC. Les NCC migrateurs émergent des explants de plis neuraux plaqués sur un substrat recouvert de fibronectine. Il en résulte des populations de CNC dispersées et adhérentes qui peuvent être évaluées par coloration et analyses morphologiques quantitatives. Cette approche de culture simplifiée est hautement adaptable et peut être combinée avec d’autres techniques. Par exemple, l’émigration NCC et les comportements migratoires peuvent être évalués par imagerie accélérée ou interrogés fonctionnellement en incluant des inhibiteurs ou des manipulations expérimentales de l’expression génique (par exemple, l’ADN, morpholino ou électroporation CRISPR). En raison de sa polyvalence, cette méthode fournit un système puissant pour étudier le développement des CNC crâniens.
Introduction
Les cellules de la crête neurale (CCN) sont une population cellulaire transitoire chez les embryons de vertébrés. Les NCC sont spécifiés aux bords de la plaque neurale et subissent une transition épithéliale vers mésenchymateuse (EMT) pour migrer du tube neural dorsal1. Après l’EMT, les NCC se dispersent largement dans l’embryon, se différenciant et contribuant à diverses structures, y compris le squelette craniofacial, les voies d’écoulement du cœur et la majorité du système nerveux périphérique2. Les changements dans la polarité cellulaire, le cytosquelette et les propriétés d’adhésion sous-tendent ce passage d’une pop....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Toute variété de races Gallus gallus peut être utilisée, y compris White Leghorn, Golden Sex Link ou Rhode Island Red. Les œufs de poule utilisés dans la présente étude étaient de diverses races et provenaient de sources multiples, y compris des fermes et des couvoirs locaux.
1. Préparation des solutions et des matériaux
- Préparer la solution de Ringer en mélangeant 123,3 mM de NaCl, 1,53 mM de CaCl2, 4,96 mM de KCl, 0,809 mM deNa2HPO 4 et 0,147 mM KH2PO 4 (voir tableau des matériaux). Ajuster le pH à 7,4 et filtrer stériliser dans des....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
La figure 1 donne un aperçu du présent protocole. Les œufs couvés ont été ouverts et le jaune, avec l’embryon à la surface, a été isolé en versant doucement dans la paume d’une main gantée (Figure 2A,B). Après avoir éliminé l’albumine (figure 2C), des cadres en papier filtre ont été appliqués sur la membrane vitelline entourant l’embryon pour faciliter la coupe et le soulèvement de l’embryon du jaune, qui commence à.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
La technique décrite ici fournit une méthode adaptable pour isoler les plis neuraux des poussins et les plaquer pour créer des cultures de CCN crâniens migrateurs. Ces cultures fournissent des conditions 2D simplifiées pour une analyse facile de la migration et de la morphologie des NCC des poussins qui peuvent compléter les méthodes d’imagerie in ovo plus difficiles sur le plan technique24,25,26. Bien que cette méthode.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Nous remercions Corinne A. Fairchild et Katie L. Vermillion, qui ont participé à l’élaboration de notre version du protocole de culture des plis neuraux crâniens des poussins.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| AxioObserver équipé d’une tête de balayage confocale LSM710 contrôlée par le logiciel ZEN 3.0 SR. | Zeiss | Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Huile DIC M27 | |
| objectif CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Plats à chambre (fond en verre, simples ou divisés) | MatTek ; Cell Vis | P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) X000NOK1OJ (Cellvis) | Chambre unique 35 mm ou 4 chambres 35 mm |
| Verre de couverture | Carolina Biological Supply Company | 633029, 633031, 633033, 633035, 633037 | cercles, 0,13&ndash ; 0,17 mm d’épaisseur, disponible en 12-25 mm de diamètre ; |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | Alternative pour milieu L15 |
| Incubateur d’œufs | Sportsman | 1502 | |
| FBS ; | Life Technologies | 10437-028 | |
| Fibronectine | Fisher Scientific | CB-40008A | |
| Papier filtre | Whatman | grade 3MM chromatographie | |
| Pince (émoussée) | Fisher Scientific ; Thomas Scientific | 08-890 (Fisher) ; 1141W97 (Thomas) | |
| Forceps (fine) | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| Image J | https://fiji.sc/ | Logiciel gratuit d’analyse d’images | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| L15 media | Invitrogen | 11415064 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| (Vectashield ou ProLong Gold) | Vector Laboratories ; Thermofisher Scientific | H-1700 (Vectashield) ; P36930 (ProLong Gold) | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Paraformaldéhyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pénicilline/streptomycine | Life Technologies | 15140-148 | 10 000 unités/mL de pénicilline ; 10 000 mg/mL de streptomycine |
| Boîtes de Pétri | VWR (ou similaire) | 60 mm, 100 mm | |
| Phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | plusieurs flurophores disponibles |
| Porte-goupille | Fine Science Tools | 26016-12 | Pour aiguille en tungstène (alternative aux ciseaux à ressort) |
| Ciseaux (dissection) | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Ciseaux à ressort | Fine Science Tools | 15000-08 | Arête de coupe de 2,5 mm (alternative à l’aiguille en tungstène) |
| Sylgard | Krayden | Sylgard 184 | |
| Filtres à seringue | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Millex-GV Unité de filtre à seringue, 0,22 & micro ; m, PVDF, 33 mm, stérilisé aux rayons gamma |
| Boîtes de culture tissulaire | Sarstedt | 83-3900 | Boîtes de culture de 35 mm pour cultures de plis neuraux en vrac |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Fil de tungstène | Variété de sources | Diamètre 0,01" pour aiguille en tungstène (alternative aux ciseaux à ressort) |
Références
- Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells. Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).
- Tang, W., Bronner, M. E. Neural crest lineage analy....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
