Denne protokol beskriver arbejdsgangen for metabolisk mærkning af senescerende og ikke-delende celler med pulserende SILAC, ikke-målrettet massespektrometrianalyse og en strømlinet beregning af proteinhalvingstider.
Stigende beviser har vist, at akkumuleringen af senescerende celler i centralnervesystemet bidrager til neurodegenerative lidelser som Alzheimers og Parkinsons sygdomme. Cellulær ældning er en tilstand af permanent cellecyklusarrest, der typisk opstår som reaktion på udsættelse for subdødelige belastninger. Ligesom andre ikke-delende celler forbliver senescerende celler imidlertid metabolisk aktive og udfører mange funktioner, der kræver unikke transkriptionelle og translationelle krav og udbredte ændringer i de intracellulære og udskillede proteomer. At forstå, hvordan proteinsyntese og henfaldshastigheder ændres under ældning, kan belyse de underliggende mekanismer for cellulær ældning og finde potentielle terapeutiske veje til sygdomme, der forværres af senescerende celler. Dette papir beskriver en metode til proteomskala evaluering af proteinhalvingstider i ikke-delende celler ved hjælp af pulserende stabil isotopmærkning af aminosyrer i cellekultur (pSILAC) i kombination med massespektrometri. pSILAC involverer metabolisk mærkning af celler med stabile tunge isotopholdige versioner af aminosyrer. Sammen med moderne massespektrometrimetoder muliggør pSILAC måling af proteinomsætning af hundreder eller tusinder af proteiner i komplekse blandinger. Efter metabolisk mærkning kan proteinernes omsætningsdynamik bestemmes ud fra den relative berigelse af tunge isotoper i peptider detekteret ved massespektrometri. I denne protokol beskrives en arbejdsgang til generering af senescerende fibroblastkulturer og tilsvarende arresterede quiescent fibroblaster samt et forenklet, enkeltpunkt pSILAC-mærkningstidsforløb, der maksimerer dækningen af forventede proteinomsætningshastigheder. Endvidere præsenteres en pipeline til analyse af pSILAC-massespektrometridata og brugervenlig beregning af proteinnedbrydningshastigheder ved hjælp af regneark. Anvendelsen af denne protokol kan udvides ud over senescerende celler til alle ikke-delende dyrkede celler, såsom neuroner.
Senescens blev først identificeret som en tilstand af ubestemt vækstarrest udstillet af dyrkede primære celler efter at have nået replikativ udmattelse1. Det har siden vist sig, at ældning kan opstå som reaktion på adskillige cellulære fornærmelser, herunder genotoksiske, mitokondrielle og onkogene belastninger, blandt andre2. Mens ældning har flere fysiologisk vigtige roller, såsom tumorundertrykkelse og sårheling, er akkumuleringen af senescerende celler under aldring forbundet med en lang række skadelige virkninger på helbredet3, herunder flere neurodegenerative tilstande 4,5,6. Cellulær ældning forekommer i flere hjernecelletyper, herunder neuroner 7,8,9,10, astrocytter11, microglia 12 og oligodendrocytprækursorer13, og bidrager til neurodegeneration og kognitiv dysfunktion. Amyloid beta-oligomerer, et af kendetegnene ved Alzheimers sygdom14, har vist sig at fremskynde neuronal ældning 13,15,16. En øget forekomst af senescerende celler har også været forbundet med Parkinsons sygdom17, især som følge af miljømæssige stressfaktorer11,18. Det er vigtigt, at den selektive eliminering af senescerende celler i prækliniske modeller forlænger levetiden og afbøder en lang række aldersrelaterede sygdomme 3,5,12 og forbedrer kognitive underskud 8,11,12,13. Senescerende celler har således vist sig som lovende terapeutiske mål for behandling af mange aldersrelaterede tilstande.
Meget af den skadelige virkning af senescerende celler er forårsaget af den ældningsrelaterede sekretoriske fænotype (SASP), en kompleks blanding af bioaktive molekyler udskilt af senescerende celler, der kan forårsage lokal inflammation, angiogenese, ødelæggelse af den ekstracellulære matrix og udbredelse af ældning i omgivende væv 19,20,21 . SASP repræsenterer også et interessant biologisk fænomen af ældning, fordi det kræver en betydelig transkriptionel og translationel indsats under en tilstand af cellecyklusarrest. Faktisk har senescerende celler vist sig at udvise fald i ribosombiogenese 22,23,24, der skulle reducere proteinsyntesen. I stedet oversætter senescerende celler robust nogle proteiner, især SASP-faktorer, og påvirker metabolismen af omgivende væv25. Der er således stor interesse for at forstå, hvordan senescerende celler, der gennemgår en permanent cellecyklusstop, fortsætter med at opretholde proteinhomeostase, samtidig med at de robust udtrykker SASP-faktorer og andre udvalgte proteiner.
Denne metode beskriver, hvordan man bruger massespektrometri og pulserende stabil isotopmærkning af aminosyrer i cellekultur (pSILAC) til globalt at måle halveringstiderne for proteiner i senescerende celler i en proteom-bred skala. I traditionel SILAC er dyrkede celler fuldstændigt metabolisk mærket med tunge og lette ikke-radioaktive isotoper af aminosyrer til nedstrøms analyse af proteinoverflod. Denne metode er tidligere blevet anvendt til at vurdere overflodsændringer omfattende og kvantitativt i SASP af dyrkede fibroblaster26. I pSILAC er celler ligeledes metabolisk mærket med en puls af tung isotop, der følger formærkning med let isotop og derefter høstes med et eller flere tidsintervaller. Inkorporeringshastighederne for tung isotop i forhold til allerede eksisterende lysisotop bruges derefter til at beregne relative proteinomsætningshastigheder. Generelt anvendes isotoper af arginin og lysin, fordi trypsin spalter ved disse rester; således vil alle peptider fra standard fordøjelse potentielt indeholde den tunge etiket. Par af peptider, der kun adskiller sig ved tilstedeværelsen eller fraværet af tung lysin eller arginin, er kemisk identiske og kan differentieres og kvantificeres ved hjælp af et massespektrometer. Efter massespektrometrianalyse kan peptider identificeres som nyligt syntetiserede eller allerede eksisterende baseret på tilstedeværelsen eller fraværet af isotopetiketten i de resulterende peptididentifikationer. Proteinomsætningshastigheder kan derefter bestemmes ved at tilpasse forholdet mellem tunge (13 C-15N) over lette (12 C-14N) peptider for et givet protein til kinetiske modeller for eksponentiel vækst eller henfald27,28. pSILAC er blevet anvendt i flere sammenligninger af proteinomsætningshastigheder 29,30,31,32 og er i øjeblikket den mest omfattende metode med høj gennemstrømning til måling af proteinhalvingstider.
Denne protokol beskriver forberedelsen af senescerende celler parallelt med tilsvarende væksthæmmede hvilende celler i kultur efterfulgt af metabolisk mærkning med pSILAC. Celler høstes derefter, homogeniseres til lysater og behandles til massespektrometri erhvervelse og analyse. De data, der opnås fra massespektrometri, bruges derefter til at bestemme proteinhalvingstider ved hjælp af en forenklet kvantitativ metode, der anvender et enkelt tidspunkt og halveringstidsberegninger udført i et regneark. Ved hjælp af denne tilgang kan estimater af proteinhalvingstider måles på en omfattende og kvantitativ måde, der er mere autentisk for uforstyrrede cellulære forhold end protokoller, der bruger blokkere af proteinsyntese eller omsætning.
pSILAC er en kraftfuld teknik, der muliggør global kvantificering af proteinomsætningshastigheder på tværs af flere cellulære forhold. Dette papir beskriver brugen af pSILAC til at sammenligne globale proteinhaleringstider mellem senescerende og stillestående celler, herunder instruktioner til fremstilling af senescerende og stillestående celler, SILAC-mærkning og høst og i sidste ende analyse ved hjælp af DDA-massespektrometri. Derudover beskrives en totrinstest til validering af ældningsfænotypen ved hjælp af SA-βGal- og RT-qPCR-analyse af et panel af mRNA’er, der koder for ældningsrelaterede proteiner. Ud over validering af ældning med de to beskrevne tilgange kan en tredje validering af ældning udføres efter massespektrometrianalyse ved at lede efter ændringer i kendte ældningsmarkører mellem senescerende og hvilende celler på proteomisk niveau. Senescens-associerede proteiner, der forventes at være forhøjede, omfatter blandt andet p16, p21 og BCL2, beskrevet andetsteds44,45. I den ovenfor beskrevne protokol blev ioniserende stråling anvendt til induktion af ældning og serumsult for stillestående celler. Til induktion af ældning er der flere muligheder til rådighed, og der er betydelig heterogenitet blandt dem 41,42,46. I øjeblikket er der ingen senescerende metode, der betragtes som den “mest fysiologiske”, så valget af senescerende inducer er i vid udstrækning baseret på eksperimentets kontekst. Eksperimenter med det formål at angive et generelt fænomen om ældning anbefales dog at anvende mindst to forskellige senescerende inducere. At diskutere rækkevidden af ældningsparadigmer ligger uden for dette papirs anvendelsesområde, men nogle almindelige metoder til at inducere ældning omfatter udløsning af DNA-skade (IR, doxorubicin, replikativ udmattelse), ekspression af onkogene proteiner (HRAS, BRAF) og forstyrrelse af mitokondrierfunktion2.
Ud over valget af senescerende inducer er valget af kontrolceller en lige så vigtig overvejelse. Senescerende celler er per definition under ubestemt vækstarremme, så en sammenligning med andre vækstanholdte celler vælges ofte. For pSILAC er cellecyklusanholdte celler generelt at foretrække, fordi de ikke replikerer og dermed er lettere at bruge til proteinhaleringstidsberegninger47. Men da dyrkede celler ofte vil beholde nogle delende celler, er det vigtigt, at de metoder, der bruges til at inducere cellecyklusstop, producerer så homogent et svar som muligt for at minimere fejl fra celler, der stadig formerer sig. For at beregne proteinnedbrydningshastigheder for cykelceller ved hjælp af pSILAC kræves yderligere beregninger for at kompensere for den hastighed, hvormed protein fortyndes i datterceller27. Imidlertid er quiescent vækst arrest i sig selv ikke uden komplikationer. Der er to generelle metoder til cellecyklusarrest: serummangel og kontakthæmning48. Ikke alle celler kan gøres stillestående gennem kontakthæmning, selvom nogle fibroblaster har vist sig at demonstrere quiescens efter flere dages dyrkning49. Denne metode brugte serummangel, fordi den er mere almindeligt anvendt til sammenligninger af senescerende celler, selvom det kræver, at den senescerende celle på samme måde serumberøves for nøjagtige sammenligninger. Serum aktiverer mTOR-komplekset, og serumberøvelse har således flere nedstrømsvirkninger på cellen ud over cellecyklusstop50. Især har senescerende celler vist sig at vise en reduceret SASP ved serummangel eller mTOR-hæmning51,52.
Et andet vigtigt punkt at overveje i pSILAC er, hvor mange tidspunkter der skal testes. Denne protokol indsamlede celler på et enkelt tidspunkt (3 dages let eller tung mærkning), hvilket i væsentlig grad forenkler den resulterende analyse. Valget af tidspunkt bør baseres på eksperimentets mål. Til global analyse forventes 3 dage at fange et flertal af proteiner, selvom halveringstider for kortlivede proteiner, der fuldstændigt omsættes inden for 3 dage (alt lyssignal går tabt), ikke kan måles på dette tidspunkt. Omvendt er langlivede proteiner med meget lille omsætning på 3 dage også vanskelige at kvantificere og fremstår ofte som havende ekstremt store halveringstider (i rækkefølgen af uger), der typisk kun er en konsekvens af meget lidt tung signalakkumulering. På grund af det ikke-lineære forhold i forholdet mellem tunge og lette peptidsignaler versus procentdelen af nysyntetiseret protein på kortere og længere tidspunkter kunne kvantiteten af halveringstider forbedres ved at tilføje yderligere mærkningstider. For relative sammenligninger mellem to celletilstande, som i denne protokol, kan en omtrentlig halveringstid være tilstrækkelig, men yderligere tidspunkter kan bruges til at forbedre kvantitativ nøjagtighed.
Denne protokol beskriver, hvordan man udfører en ikke-målrettet DDA-baseret analyse af proteinomsætning. Proteinomsætningsberegningerne kan dog generelt anvendes på ethvert erhvervelsesskema, der er i stand til at udlede den relative overflod af tunge og lette peptidpar. For eksempel kan MS2-baserede metoder såsom datauafhængig erhvervelse (DIA/SWATH) også anvendes til beregning af omsætningshastigheder med succes53. Derudover kan andre instrumenterings- og softwarerørledninger end dem, der er beskrevet i denne protokol, bruges til at udføre DDA-analyse, proteinidentifikation og proteinkvantificering. Når du bruger proteinkvantificeringssoftwareplatforme som Skyline til at udtrække peptidspidsområder, anbefales det manuelt at inspicere ekstraherede ionkromatogrammer i dokumentarbejdsområdet, identificere toppe, der fejlagtigt var integrerede og ikke-kvantitative toppe, og kuratere dokumentet i overensstemmelse hermed. En omfattende samling af tutorials er tilgængelig online for Skyline (skyline.ms).
pSILAC repræsenterer en af de mest ideelle metoder til global kvantificering af proteinhalvingstider i dyrkede celler på grund af overlegen multiplexing (proteomdækning) og gennemstrømning. Mens pSILAC ikke giver direkte syntese- eller nedbrydningshastigheder, da ændringen i let og tungt signal skyldes et sammenløb af faktorer, er pSILAC yderst nyttigt til sammenligninger mellem tilstande og forskellige celletyper. Metoder med lav gennemstrømning falder ofte i to typer: 1) behandling af celler med cyclohexamid for at blokere proteinsyntese og høst med tidsintervaller efter tilsætning for at overvåge henfald, eller 2) behandling af celler med en hæmmer af proteinhenfald og høst med tidsintervaller efter tilsætning for at overvåge akkumuleringen af protein og dermed udlede proteinhenfaldshastigheder. Begrænsningen af begge metoder er, at sådanne behandlinger uundgåeligt vil medføre væsentlige ændringer i cellulær fysiologi. I modsætning hertil kræver pSILAC ingen væsentlig indgriben og har teoretisk ingen påviselige virkninger på cellulær fysiologi, da isotopiske aminosyrer kun adskiller sig med en enkelt neutron fra deres ikke-isotopiske modstykker. Den her beskrevne metode for pSILAC repræsenterer således en simpel protokol til global måling af de mest fysiologiske proteinhaleringstider i ikke-delende celler.
Ændringer i proteinomsætning har et tæt forhold til aldring, aldersrelaterede sygdomme, neurodegeneration og lang levetid54,55. Denne protokol beskriver en metode til at forhøre disse forhold ved at anvende stabil isotopmærkning af aminosyrer i cellekultur til måling af proteinomsætningshastigheder i ældningsceller. Imidlertid findes der adskillige analoge metoder til at udføre undersøgelser i forbindelse med aldring og neurodegeneration in vivo i hele organismer som mus. Faktisk har disse undersøgelser understreget vigtigheden af at måle proteinomsætningshastigheder i forbindelse med aldersrelaterede sygdomme 56,57,58,59.
I denne undersøgelse skilte ribosomale proteiner og proteiner, der befinder sig i det endoplasmatiske retikulum, sig ud som to kategorier af proteiner med henholdsvis nedsat og øget halveringstid i senescerende celler. Mens yderligere analyse af steady-state niveauer er nødvendig for endelige konklusioner, tyder disse resultater yderligere på, at senescerende celler unikt kan regulere translation gennem nedsat halveringstid for ribosomale proteiner. Fremadrettet vil anvendelse af stabile isotopmærkningsmetoder til at studere forholdet mellem cellulær ældning og neurodegeneration in vivo i musemodeller være en lovende udvidelse af isotopmærkningsmetoden beskrevet i denne protokol.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) og Intramural Research Program (IRP), National Institute on Aging (NIA). NB blev støttet af Longevity Impetus Grants og Office of Dietary Supplements (ODS) Scholars Program. Figur 1 blev oprettet med BioRender.com.
Acetonitrile (LC-MS grade) | Grainger | AH015 | |
Ammonium Bicarbonate | Millipore-Sigma | 9830 | |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher | 15240062 | |
BCA Assay Kit | ThermoFisher | 23227 | |
Dithiothreotol (DTT) | Sigma | D9779 | |
DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher | 12430112 | |
dNTP Mix | ThermoFisher | R0191 | |
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated | ThermoFisher | 10082147 | |
Formic Acid | Sigma | 27001 | |
Gammacel 40 Exactor | Best Theratronics | Cesium Irradiator for cells | |
GlycoBlue | ThermoFisher | AM2238 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma | I1149 | Light sensitive |
IMR-90 primary lung fibroblasts | ATCC | CCL-186 | |
iRT Kit (indexed retention time) | Biognosys | Ki-3002-2 | Indexed Retention Time Peptide Standards |
Isopropanol | ThermoFisher | 423835000 | |
Mascot | Matrix Science | Mascot Daemon 2.8 | Proteomic database searching software |
Maxima Reverse Transcritase (200 U/µL) | ThermoFisher | EP0742 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | ThermoFisher | 11140050 | |
Nano LC System | ThermoFisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
Oasis HLB Solid Phase Extraction Cartirdges | Waters | 186000383 | |
Orbitrap Mass Spectrometer | ThermoFisher | Q Exactive HF Orbitrap | |
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), 100 mM EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 327110025 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | |
Pierce SILAC Protein Quantitation Kit (Trypsin) -DMEM | ThermoFisher | A33972 | |
QuantStudio 6 Real-Time PCR System | ThermoFisher | ||
Random Hexamer Primer | ThermoFisher | SO142 | |
Senescence β-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling | 9860 | |
Skyline | University of Washington | Skyline-Daily v21.2.1.424 | Free and open source qantiative proteomic software. Available on www.skyline.ms |
Sonicator waterbath | Branson | CPX-952-516R | |
TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | Referred to as phenol in text; hazardous |
TRYPle Express | ThermoFisher | 12605010 | |
Trypsin (sequencing grade) | Promega | V5113 | |
TURBO Dnase (2U/ uL) | ThermoFisher | AM2238 | |
Urea | ThermoFisher | 29700 | |
Water (LC-MS grade) | Grainger | AH365 |