Detta protokoll beskriver arbetsflödet för metabolisk märkning av senescenta och icke-delande celler med pulserad SILAC, oriktad masspektrometrianalys och en strömlinjeformad beräkning av proteinhalveringstider.
Monteringsbevis har visat att ackumuleringen av senescenta celler i centrala nervsystemet bidrar till neurodegenerativa störningar som Alzheimers och Parkinsons sjukdomar. Cellulär senescens är ett tillstånd av permanent cellcykelstopp som vanligtvis uppstår som svar på exponering för subletala påfrestningar. Liksom andra icke-delande celler förblir emellertid senescenta celler metaboliskt aktiva och utför många funktioner som kräver unika transkriptions- och translationella krav och utbredda förändringar i de intracellulära och utsöndrade proteomerna. Att förstå hur proteinsyntes och sönderfallshastigheter förändras under senescens kan belysa de underliggande mekanismerna för cellulär senescens och hitta potentiella terapeutiska vägar för sjukdomar som förvärras av senescenta celler. Denna uppsats beskriver en metod för proteomskala utvärdering av proteinhalveringstider i icke-delande celler med hjälp av pulserad stabil isotopmärkning av aminosyror i cellodling (pSILAC) i kombination med masspektrometri. pSILAC involverar metabolisk märkning av celler med stabila tunga isotophaltiga versioner av aminosyror. Tillsammans med moderna masspektrometrimetoder möjliggör pSILAC mätning av proteinomsättning av hundratals eller tusentals proteiner i komplexa blandningar. Efter metabolisk märkning kan omsättningsdynamiken hos proteiner bestämmas baserat på den relativa anrikningen av tunga isotoper i peptider detekterade genom masspektrometri. I detta protokoll beskrivs ett arbetsflöde för generering av senescenta fibroblastkulturer och liknande arresterade vilande fibroblaster, liksom en förenklad, engångspunkt pSILAC-märkningstidskurs som maximerar täckningen av förväntade proteinomsättningshastigheter. Vidare presenteras en pipeline för analys av pSILAC-masspektrometridata och användarvänlig beräkning av proteinnedbrytningshastigheter med hjälp av kalkylblad. Tillämpningen av detta protokoll kan utvidgas bortom senescenta celler till alla icke-delande odlade celler såsom neuroner.
Senescens identifierades först som ett tillstånd av obestämd tillväxtstopp som uppvisades av odlade primära celler efter att ha nått replikativ utmattning1. Det har sedan dess visat sig att senescens kan uppstå som svar på många cellulära förolämpningar, inklusive genotoxiska, mitokondriella och onkogena påfrestningar, bland andra2. Medan senescens har flera fysiologiskt viktiga roller, såsom tumörundertryckning och sårläkning, är ackumuleringen av senescenta celler under åldrandet associerad med en mängd skadliga effekter på hälsan3, inklusive flera neurodegenerativa tillstånd 4,5,6. Cellulär senescens förekommer i flera hjärncelltyper, inklusive neuroner 7,8,9,10, astrocyter11, mikroglia12 och oligodendrocytprekursorer13, och bidrar till neurodegeneration och kognitiv dysfunktion. Amyloid beta-oligomerer, ett av kännetecknen för Alzheimers sjukdom14, har visat sig påskynda neuronal senescens 13,15,16. En ökad förekomst av senescenta celler har också associerats med Parkinsons sjukdom17, särskilt till följd av miljöstressorer11,18. Viktigt är att den selektiva elimineringen av senescenta celler i prekliniska modeller förlänger livslängden och mildrar en mängd åldersrelaterade sjukdomar 3,5,12 och förbättrar kognitiva underskott 8,11,12,13. Senescenta celler har således framträtt som lovande terapeutiska mål för behandling av många åldersrelaterade tillstånd.
Mycket av den skadliga effekten av senescenta celler orsakas av den senescensassocierade sekretoriska fenotypen (SASP), en komplex blandning av bioaktiva molekyler utsöndrade av senescenta celler som kan orsaka lokal inflammation, angiogenes, förstörelse av den extracellulära matrisen och förökning av åldrande i omgivande vävnad 19,20,21 . SASP representerar också ett intressant biologiskt fenomen av senescens eftersom det kräver en betydande transkriptionell och translationell ansträngning under ett tillstånd av cellcykelstopp. Faktum är att senescenta celler har visat sig uppvisa minskningar i ribosobiogenes 22,23,24 som bör minska proteinsyntesen. Istället översätter senescenta celler robust vissa proteiner, särskilt SASP-faktorer, och påverkar metabolismen av omgivande vävnad25. Således finns det ett stort intresse för att förstå hur senescenta celler som genomgår ett permanent cellcykelstopp fortsätter att upprätthålla proteinhomeostas samtidigt som de robust uttrycker SASP-faktorer och andra utvalda proteiner.
Denna metod beskriver hur man använder masspektrometri och pulserad stabil isotopmärkning av aminosyror i cellodling (pSILAC) för att globalt mäta halveringstiderna för proteiner i senescenta celler i proteomomfattande skala. I traditionell SILAC är odlade celler helt metaboliskt märkta med tunga och lätta icke-radioaktiva isotoper av aminosyror för nedströms analys av proteinöverflöd. Denna metod har tidigare tillämpats för att bedöma förändringar i överflöd på ett omfattande och kvantitativt sätt i SASP för odlade fibroblaster26. I pSILAC är celler på samma sätt metaboliskt märkta med en puls av tung isotop som följer förmärkning med lätt isotop och skördas sedan med ett eller flera tidsintervaller. Inkorporeringshastigheterna för tung isotop med hänvisning till befintlig ljusisotop används sedan för att beräkna relativa proteinomsättningshastigheter. I allmänhet används isotoper av arginin och lysin eftersom trypsin klyver vid dessa rester; således kommer alla peptider från standard matsmältning potentiellt att innehålla den tunga etiketten. Par av peptider som endast skiljer sig åt genom närvaron eller frånvaron av tungt lysin eller arginin är kemiskt identiska och kan differentieras och kvantifieras med en masspektrometer. Efter masspektrometrianalys kan peptider identifieras som nysyntetiserade eller redan existerande baserat på närvaron eller frånvaron av isotopetiketten i de resulterande peptididentifieringarna. Proteinomsättningshastigheter kan sedan bestämmas genom att anpassa förhållandet mellan tunga (13 C-15N) över lätta (12 C-14N) peptider för ett givet protein till kinetiska modeller för exponentiell tillväxt eller sönderfall27,28. pSILAC har använts i flera jämförelser av proteinomsättningshastigheter 29,30,31,32 och är för närvarande den mest omfattande metoden med hög genomströmning för mätning av proteinhalveringstider.
Detta protokoll beskriver beredningen av senescenta celler parallellt med liknande tillväxtstoppade vilande celler i odling, följt av metabolisk märkning med pSILAC. Celler skördas sedan, homogeniseras till lysater och bearbetas för förvärv och analys av masspektrometri. Data som erhålls från masspektrometri används sedan för att bestämma proteinhalveringstider med hjälp av en förenklad kvantitativ metod som använder en enda tidpunkt och halveringstidsberäkningar utförda i ett kalkylblad. Med hjälp av detta tillvägagångssätt kan uppskattningar av proteinhalveringstider mätas på ett omfattande och kvantitativt sätt som är mer autentiskt för ostörda cellulära förhållanden än protokoll som använder blockerare av proteinsyntes eller omsättning.
pSILAC är en kraftfull teknik som möjliggör global kvantifiering av proteinomsättningshastigheter över flera cellulära förhållanden. Detta dokument beskriver användningen av pSILAC för att jämföra globala proteinhalveringstider mellan senescenta och vilande celler, inklusive instruktioner för beredning av senescenta och vilande celler, SILAC-märkning och skörd och slutligen analys med DDA-masspektrometri. Dessutom beskrivs ett tvåstegstest för validering av senescensfenotypen med användning av SA-βGal- och RT-qPCR-analys av en panel av mRNA som kodar för senescensassocierade proteiner. Förutom validering av åldrande med de två beskrivna metoderna kan en tredje validering av senescens utföras efter masspektrometrianalys genom att leta efter förändringar i kända senescensmarkörer mellan senescenta och vilande celler på proteomisk nivå. Senescensassocierade proteiner som förväntas vara förhöjda inkluderar bland annat p16, p21 och BCL2, som beskrivs någon annanstans44,45. I protokollet som beskrivits ovan användes joniserande strålning för induktion av åldrande och serumsvält för vilande celler. För induktion av åldrande finns det flera alternativ tillgängliga och det finns betydande heterogenitet bland dem 41,42,46. För närvarande finns det ingen senescent metod som anses vara den “mest fysiologiska”, så valet av senescent inducerare är till stor del baserat på experimentets sammanhang. Experiment med målet att ange ett allmänt fenomen om senescens rekommenderas dock att använda minst två olika senescenta inducerare. Att diskutera utbudet av senescensparadigmer ligger utanför ramen för detta papper, men några vanliga metoder för att inducera åldrande inkluderar att utlösa DNA-skador (IR, doxorubicin, replikativ utmattning), uttrycka onkogena proteiner (HRAS, BRAF) och störa mitokondriernas funktion2.
Förutom valet av senescent inducerare är valet av kontrollceller ett lika viktigt övervägande. Senescenta celler är per definition under obestämd tillväxtstopp, så en jämförelse med andra tillväxtstoppade celler väljs ofta. För pSILAC är cellcykelarresterade celler i allmänhet att föredra eftersom de inte replikerar och därmed är lättare att använda för beräkningar av proteinhalveringstiden47. Men eftersom odlade celler ofta behåller vissa delande celler är det viktigt att de metoder som används för att inducera cellcykelstopp ger ett så homogent svar som möjligt för att minimera fel från celler som fortfarande förökar sig. För att beräkna proteinnedbrytningshastigheter för cykelceller med pSILAC krävs ytterligare beräkningar för att kompensera för den hastighet med vilken protein späds ut i dotterceller27. Vilande tillväxtstopp i sig är emellertid inte utan komplikationer. Det finns två allmänna metoder för cellcykelstopp: serumbrist och kontakthämning48. Inte alla celler kan göras vilande genom kontakthämning, även om vissa fibroblaster har visat sig visa lugn efter flera dagars odling49. Denna metod använde serumbrist eftersom den oftare används för jämförelser av senescenta celler, även om det kräver att den senescenta cellen på samma sätt serumberövas för exakta jämförelser. Serum aktiverar mTOR-komplexet, och därmed har serumbrist flera nedströms effekter på cellen utöver cellcykelstopp50. I synnerhet har senescenta celler visat sig uppvisa en minskad SASP vid serumbrist eller mTOR-hämning51,52.
En annan viktig punkt att tänka på i pSILAC är hur många tidpunkter som ska testas. Detta protokoll samlade celler vid en enda tidpunkt (3 dagars lätt eller tung märkning), vilket väsentligt förenklar den resulterande analysen. Valet av tidpunkt bör baseras på experimentets mål. För global analys förväntas 3 dagar fånga en majoritet av proteinerna, men halveringstider för kortlivade proteiner som helt omsätter inom 3 dagar (all ljussignal går förlorad) kan inte mätas vid denna tidpunkt. Omvänt är långlivade proteiner med mycket liten omsättning på 3 dagar också svåra att kvantifiera och verkar ofta ha extremt stora halveringstider (i veckors ordning) som vanligtvis bara är en följd av mycket liten tung signalackumulering. På grund av det icke-linjära förhållandet i förhållandet mellan tunga och lätta peptidsignaler jämfört med andelen nysyntetiserat protein vid kortare och längre tidpunkter kan kvantitationen av halveringstider förbättras genom att lägga till ytterligare märkningstidpunkter. För relativa jämförelser mellan två celltillstånd, som i detta protokoll, kan en ungefärlig halveringstid vara tillräcklig, men ytterligare tidpunkter kan användas för att förbättra kvantitativ noggrannhet.
Detta protokoll beskriver hur man utför en oriktad DDA-baserad analys av proteinomsättning. Beräkningarna av proteinomsättningen kan emellertid tillämpas generellt på alla förvärvsscheman som kan härleda det relativa överflödet av tunga och lätta peptidpar. Exempelvis kan MS2-baserade metoder såsom dataoberoende förvärv (DIA/SWATH) också tillämpas för beräkning av omsättningshastigheter framgångsrikt53. Dessutom kan andra instrumenterings- och programvarupipelines än de som beskrivs i detta protokoll användas för att utföra DDA-analys, proteinidentifiering och proteinkvantifiering. När du använder programvaruplattformar för proteinkvantifiering som Skyline för att extrahera peptidtoppområden är det lämpligt att manuellt inspektera extraherade jonkromatogram i dokumentarbetsytan, identifiera toppar som felaktigt integrerades och icke-kvantitativa toppar och kurera dokumentet i enlighet därmed. En omfattande samling självstudier finns tillgängliga online för Skyline (skyline.ms).
pSILAC representerar en av de mest idealiska metoderna för global kvantifiering av proteinhalveringstider i odlade celler på grund av överlägsen multiplexering (proteomtäckning) och genomströmning. Medan pSILAC inte ger direkta syntes- eller nedbrytningshastigheter, eftersom förändringen i lätt och tung signal beror på ett sammanflöde av faktorer, är pSILAC mycket användbart för jämförelser mellan förhållanden och olika celltyper. Metoder med låg genomströmning faller ofta i två typer: 1) behandling av celler med cykloheximid för att blockera proteinsyntes och skörda med tidsintervall efter tillsats för att övervaka sönderfall, eller 2) behandling av celler med en hämmare av proteinförfall och skörd vid tidsintervall efter tillsats för att övervaka ackumuleringen av protein, vilket härleder proteinförfallshastigheter. Begränsningen av båda metoderna är att sådana behandlingar oundvikligen kommer att orsaka betydande förändringar i cellulär fysiologi. Däremot kräver pSILAC ingen väsentlig intervention och har teoretiskt inga detekterbara effekter på cellulär fysiologi eftersom isotopaminosyror skiljer sig med endast en enda neutron från sina icke-isotopiska motsvarigheter. Således representerar metoden som beskrivs här för pSILAC ett enkelt protokoll för global mätning av de mest fysiologiska proteinhalveringstiderna i icke-delande celler.
Förändringar i proteinomsättningen har ett nära samband med åldrande, åldersrelaterade sjukdomar, neurodegeneration och livslängd 54,55. Detta protokoll beskriver en metod för att förhöra dessa relationer genom att använda stabil isotopmärkning av aminosyror i cellodling för att mäta proteinomsättningshastigheter i senescensceller. Det finns emellertid många analoga metoder för att utföra studier i samband med åldrande och neurodegeneration in vivo i hela organismer som möss. Faktum är att dessa studier har betonat vikten av att mäta proteinomsättningshastigheter i samband med åldersrelaterade sjukdomar 56,57,58,59.
I denna studie stod ribosomala proteiner och proteiner som finns i endoplasmatisk retikulum ut som två kategorier av proteiner med minskade respektive ökade halveringstider i senescenta celler. Medan ytterligare analys av steady-state-nivåer krävs för definitiva slutsatser, tyder dessa resultat vidare på att senescenta celler unikt kan reglera översättning genom minskade halveringstider för ribosomala proteiner. Framöver kommer tillämpning av stabila isotopmärkningsmetoder för att studera förhållandet mellan cellulär senescens och neurodegeneration in vivo i musmodeller att vara en lovande förlängning av isotopmärkningsmetoden som beskrivs av detta protokoll.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) och Intramural Research Program (IRP), National Institute on Aging (NIA). OBS stöddes av Longevity Impetus Grants och Office of Dietary Supplements (ODS) Scholars Program. Figur 1 skapades med BioRender.com.
Acetonitrile (LC-MS grade) | Grainger | AH015 | |
Ammonium Bicarbonate | Millipore-Sigma | 9830 | |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher | 15240062 | |
BCA Assay Kit | ThermoFisher | 23227 | |
Dithiothreotol (DTT) | Sigma | D9779 | |
DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher | 12430112 | |
dNTP Mix | ThermoFisher | R0191 | |
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated | ThermoFisher | 10082147 | |
Formic Acid | Sigma | 27001 | |
Gammacel 40 Exactor | Best Theratronics | Cesium Irradiator for cells | |
GlycoBlue | ThermoFisher | AM2238 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma | I1149 | Light sensitive |
IMR-90 primary lung fibroblasts | ATCC | CCL-186 | |
iRT Kit (indexed retention time) | Biognosys | Ki-3002-2 | Indexed Retention Time Peptide Standards |
Isopropanol | ThermoFisher | 423835000 | |
Mascot | Matrix Science | Mascot Daemon 2.8 | Proteomic database searching software |
Maxima Reverse Transcritase (200 U/µL) | ThermoFisher | EP0742 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | ThermoFisher | 11140050 | |
Nano LC System | ThermoFisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
Oasis HLB Solid Phase Extraction Cartirdges | Waters | 186000383 | |
Orbitrap Mass Spectrometer | ThermoFisher | Q Exactive HF Orbitrap | |
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), 100 mM EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 327110025 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | |
Pierce SILAC Protein Quantitation Kit (Trypsin) -DMEM | ThermoFisher | A33972 | |
QuantStudio 6 Real-Time PCR System | ThermoFisher | ||
Random Hexamer Primer | ThermoFisher | SO142 | |
Senescence β-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling | 9860 | |
Skyline | University of Washington | Skyline-Daily v21.2.1.424 | Free and open source qantiative proteomic software. Available on www.skyline.ms |
Sonicator waterbath | Branson | CPX-952-516R | |
TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | Referred to as phenol in text; hazardous |
TRYPle Express | ThermoFisher | 12605010 | |
Trypsin (sequencing grade) | Promega | V5113 | |
TURBO Dnase (2U/ uL) | ThermoFisher | AM2238 | |
Urea | ThermoFisher | 29700 | |
Water (LC-MS grade) | Grainger | AH365 |