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Bioengineering

Fabrication et caractérisation de nano-matrice Janus Base couche par couche pour favoriser la régénération du cartilage

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/63984
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Connecticut
* These authors contributed equally

Summary

Ce protocole décrit l’assemblage d’un échafaudage de nanomatrice de base Janus (JBNm) couche par couche en ajoutant des nanotubes de base Janus (JBNts), de la matriline-3 et du facteur de croissance transformant bêta-1 (TGF-β1) séquentiellement. Le JBNm a été fabriqué et caractérisé; De plus, il a montré une excellente bioactivité, encourageant les fonctions cellulaires telles que l’adhésion, la prolifération et la différenciation.

Abstract

Divers échafaudages de biomatériaux ont été développés pour guider l’adhésion cellulaire et la prolifération dans l’espoir de promouvoir des fonctions spécifiques pour des utilisations in vitro et in vivo . L’ajout de facteurs de croissance dans ces échafaudages de biomatériaux est généralement effectué pour fournir un environnement de culture cellulaire optimal, médiant la différenciation cellulaire et ses fonctions ultérieures. Cependant, les facteurs de croissance d’un échafaudage de biomatériau conventionnel sont généralement conçus pour être libérés lors de l’implantation, ce qui pourrait entraîner des effets secondaires involontaires sur les tissus ou les cellules environnantes. Ici, la nano-matrice de base Janus (JBNm) inspirée de l’ADN a réussi à obtenir un microenvironnement hautement localisé avec une structure couche par couche pour des constructions de tissus cartilagineux autosuffisantes. Les JBNms sont auto-assemblés à partir de nanotubes de base Janus (JBNts), de matriline-3 et de facteur de croissance transformant bêta-1 (TGF-β1) via la bioaffinité. Le JBNm a été assemblé à un rapport TGF-β1:matriline-3:JBNt de 1:4:10, car c’est le rapport déterminé auquel l’assemblage approprié dans la structure couche par couche pourrait se produire. Tout d’abord, la solution TGF-β1 a été ajoutée à la solution matriline-3. Ensuite, ce mélange a été pipeté plusieurs fois pour assurer une homogénéité suffisante avant l’ajout de la solution JBNt. Cela a formé le JBNm couche par couche, après avoir pipeté plusieurs fois à nouveau. Diverses expériences ont été réalisées pour caractériser la structure JBNm couche par couche, JBNts seuls, matriline-3 seul et TGF-β1 seul. La formation de JBNm a été étudiée avec des spectres d’absorption UV-Vis, et la structure du JBNm a été observée avec la microscopie électronique à transmission (TEM). Comme l’échafaudage innovant JBNm couche par couche est formé à l’échelle moléculaire, le colorant fluorescent marqué JBNm a pu être observé. Le TGF-β1 est confiné dans la couche interne du JBNm injectable, ce qui peut empêcher la libération de facteurs de croissance dans les zones environnantes, favoriser la chondrogenèse localisée et promouvoir un microenvironnement antihypertrophique.

Introduction

Les échafaudages en ingénierie tissulaire jouent un rôle essentiel dans la fourniture d’un soutien structurel pour la fixation cellulaire et le développement ultérieurdes tissus 1. En règle générale, les constructions tissulaires conventionnelles sans aucun échafaudage reposent sur l’environnement de culture cellulaire et ont ajouté des facteurs de croissance pour arbitrer la différenciation cellulaire. De plus, cet ajout de molécules bioactives dans les échafaudages est souvent l’approche privilégiée pour guider la différenciation et la fonctioncellulaires 2,3. Certains échafaudages peuvent imiter le microenvironnement biochimique des tissus natifs indépendamment, tandis que d’autres peuvent influencer directement les fonctions cellulaires via des facteurs de croissance. Cependant, les chercheurs rencontrent souvent des difficultés dans la sélection d’échafaudages qui pourraient affecter positivement l’adhésion, la croissance et la différenciation cellulaires, tout en fournissant un soutien structurel optimal et une stabilité sur une longue période 4,5. Les molécules bioactives sont souvent faiblement liées à l’échafaudage, ce qui entraîne une libération rapide de ces protéines lors de l’implantation, ce qui entraîne leur libération dans des endroits indésirables. Cela aboutit à des effets secondaires sur des tissus ou des cellules qui n’ont pas été intentionnellement ciblés 6,7.

Les échafaudages sont généralement faits de matériaux polymères. La nano-matrice de base Janus (JBNm) est une plate-forme d’échafaudage biomimétique créée avec une nouvelle méthode couche par couche pour la construction autonome de tissus cartilagineux8. Ces nouveaux nanotubes inspirés de l’ADN ont été nommés nanotubes de base Janus (JBNts), car ils imitent correctement la structure et la chimie de surface du collagène trouvé dans la matrice extracellulaire (ECM). Avec l’ajout de molécules bioactives, telles que la matriline-3 et le facteur de croissance transformant bêta-1 (TGF-β1), le JBNm peut créer un microenvironnement optimal qui peut ensuite stimuler la fonctionnalité cellulaire et tissulaire souhaitée9.

Les JBNt sont de nouveaux nanotubes dérivés de versions synthétiques de la nucléobase adénine et thymine. Les JBNts sont formés par auto-assemblage10; Six nucléobases synthétiques se lient pour former un anneau, et ces anneaux subissent des interactions d’empilement π-π pour créer un nanotube de 200 à 300 μm de longueur11. Ces nanotubes sont structurellement similaires aux protéines de collagène; En imitant un aspect du microenvironnement cartilagineux natif, il a été démontré que les JBNt fournissent un site de fixation favorable pour les chondrocytes et les cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh)11,12,13,14. Parce que les nanotubes subissent un auto-assemblage et ne nécessitent aucune sorte d’initiateur (comme la lumière UV), ils montrent un potentiel passionnant en tant qu’échafaudage injectable pour les zones de défauts difficiles à atteindre15.

La matriline-3 est une protéine structurelle de la matrice extracellulaire présente dans le cartilage. Cette protéine joue un rôle important dans la chondrogenèse et le bon fonctionnement du cartilage16,17. Récemment, il a été inclus dans des échafaudages de biomatériaux, encourageant la chondrogenèse sans hypertrophie 9,18,19. En incluant cette protéine dans le JBNm, les cellules cartilagineuses sont attirées par un échafaudage qui contient des composants similaires à ceux de son microenvironnement natif. De plus, il a été démontré que la matriline-3 est nécessaire pour une signalisation correcte du TGF-β1 dans les chondrocytes20. Les facteurs de croissance fonctionnent comme des molécules de signalisation, provoquant la croissance spécifique d’une certaine cellule ou tissu. Ainsi, pour obtenir une régénération optimale du cartilage, la matriline-3 et le TGF-β1 sont des composants essentiels du JBNm. L’ajout de TGF-β1 dans l’échafaudage couche par couche peut favoriser davantage la régénération du cartilage dans une construction tissulaire. Le TGF-β1 est un facteur de croissance utilisé pour favoriser le processus de guérison des défauts ostéochondrals, favorisant la prolifération et la différenciation des chondrocytes et des hMSC21,22. Ainsi, le TGF-β1 joue un rôle clé dans la régénération du cartilage JBNm (J/T/M JBNm)23, favorisant une bonne croissance surtout lorsqu’il est localisé dans les couches JBNm.

Comme mentionné précédemment, les facteurs de croissance sont généralement assemblés à l’extérieur des échafaudages sans méthodes spécifiques d’incorporation. Ici, avec la nano-architecture précisément conçue des biomatériaux, le JBNm a été développé pour un ciblage spécifique des cellules et des tissus prévus. Le JBNm est composé de TGF-β1 collé sur les surfaces JBNt dans la couche interne et de matriline-3 adhérée sur les surfaces JBNt dans la couche externe24,25. L’incorporation de TGF-β1 dans la couche interne de la structure couche par couche permet un microenvironnement très localisé le long des fibres JBNm, créant une construction tissulaire homéostatique avec une libération beaucoup plus lente de la protéine12. L’injectabilité du JBNm en fait une construction de tissu cartilagineux idéale pour diverses applications futures de biomatériaux26.

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Protocol

1. Synthèse des JBNts

  1. Préparer le monomère JBNt en utilisant des méthodes précédemment publiées, impliquant la synthèse d’une variété de composés12.
  2. Purifier le monomère JBNt brut après sa synthèse par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) à l’aide d’une colonne en phase inverse. Utilisez le solvant A : 100 % d’eau, le solvant B : 100 % d’acétonitrile et le solvant C : solution aqueuse HCl avec pH = 1. Utilisez un débit de 3 mL/min. Collecter le plus grand pic obtenu en CLHP à 7,2 min.

2. Fabrication pour JBNt/Matn1/TGF-β1 (Vidéo 1)

REMARQUE: La vidéo 1 montre que le JBNm est un solide injectable formé dans un environnement physiologique (solution d’eau, pas de lumière UV, pas d’additifs chimiques et pas de chauffage), qui est également d’inspiration biologique.

  1. Ajouter 8 μL de TGF-β1 à 1 mg/mL de TGF-β1 en suspension dans H2O à32μL de 1 mg/mL de matriline-3 en suspension dansH2O. Pipette pour assurer un bon mélange de ces protéines.
  2. Ajouter 80 μL de 1 mg/mL de JBNts en suspension dansH2Oà la solution TGF-β1/matriline-3. Pipeter à plusieurs reprises pour assurer un bon mélange. La présence de floccules blancs peut être observée immédiatement après l’ajout de JBNts, indiquant la formation du JBNm (Vidéo 1).

3. Observation d’échantillons à absorption ultraviolet-visible (UV-Vis)

NOTE: Les spectres d’absorption UV-Vis ont été étudiés pour caractériser l’assemblage du JBNm. Cette mesure a été analysée pour quatre catégories: JBNts seul, matriline-3 seul, TGF-β1 seul et JBNm couche par couche, composé des trois parties. Toutes les concentrations initiales sont en suspension dansH2O.

  1. Pour le groupe JBNt, ajouter 5 μL de 1 mg/mL de JBNts à 50 μL deH2Opour obtenir une solution de 90,9 μg/mL.
  2. Pour le groupe matriline-3, ajouter 40 μL de matriline-3 à 10 μg/mL de matriline-3 à 15 μL deH2Opour obtenir une solution de 7,3 μg/mL.
  3. Pour le groupe TGF-β1, ajouter 10 μL de TGF-β1 à 45 μL deH2Opour obtenir une solution de 1,8 μg/mL.
  4. Pour le groupe JBNm, ajouter 40 μL de matriline-3 à 10 μg/mL de 10 μg/mL de Tgf-β1. Agiter pour assurer un mélange approprié, puis ajouter 5 μL de JBNts à 1 mg/mL à la solution, en pipetant plusieurs fois pour mélanger l’échantillon.
  5. À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurer le spectre d’absorption de chaque groupe.

4. Mesure du potentiel zêta des échantillons

NOTE: Le potentiel zêta a été analysé pour mieux prédire comment le JBNm interagirait avec les tissus in vivo . Trois groupes ont été mesurés : la matriline-3 seule, la matriline-3 avec TGF-β1, et le JBNm couche par couche complète.

  1. Pour le groupe matriline-3, ajouter 160 μL de matriline-3 à 10 mg/mL de matriline-3 à 640 μL deH2Opour obtenir une solution de 800 μL.
  2. Pour le composé matriline-3/TGF-β1, ajouter 160 μL de 10 μg/mL de matriline-3 à 40 μL de 10 μg/mL de TGF-β1. Pipeter à plusieurs reprises pour assurer une homogénéité adéquate. Ensuite, ajoutez-le à 600 μL deH2O, ce qui donne une solution de 800 μL.
  3. Pour le groupe JBNm, ajouter 160 μL de matriline-3 à 10 μg/mL de TGF-β1 à 40 μL de TGF-β1 à 10 μg/mL. Pipette plusieurs fois pour mélanger les protéines. Ensuite, ajouter 20 μL de JBNts à 1 mg/mL à la solution et à la pipette pour assurer l’homogénéité. Enfin, ajoutez la solution JBNm à 580 μL deH2Opour obtenir une solution de 800 μL.
  4. Mesurez les valeurs de potentiel zêta pour les trois groupes.

5. Préparation de la nano-matrice JBNt/matrilin-3 pour la microscopie électronique à transmission (MET)

NOTE: La caractérisation TEM est effectuée pour caractériser la morphologie des JBNts et JBNm.

  1. Insérez deux grilles dans un nettoyeur plasma pour nettoyer correctement les grilles avant la coloration négative des JBNts et JBNm selon les protocoles publiés et les protocoles du fabricant12.
  2. Créer une solution de 200 μg/mL de JBNt en mélangeant 10 μL de JBNts à 1 mg/mL avec 40 μL d’eau distillée.
  3. Mélanger 30 μL de matriline-3 à 100 μg/mL avec 20 μL de TGF-β1 à 100 μg/mL et à la pipette plusieurs fois. Ajouter 10 μL de 1 mg/mL de JBNts au mélange matriline-3/TGF-β1 pour préparer l’échantillon de JBNm. Encore une fois, pipette à plusieurs reprises.
  4. Ajouter 3 μL de la solution JBNt (200 μg/mL) et 3 μL de la solution JBNm sur des grilles séparées, et laisser agir 2 min.
  5. Rincer chaque grille avec 100 μL de solution d’acétate d’uranyle (0,5%). Utilisez des papiers filtres pour éliminer l’excès de solution et permettre aux grilles de sécher à l’air.
  6. Utiliser un microscope électronique à transmission pour observer et caractériser correctement les échantillons, comme publié précédemment11,12.

6. Mesure des spectres d’absorption des protéines marquées par fluorescence

NOTE: La structure de JBNm est vérifiée en observant les structures du JBNm avec une analyse spectrale d’absorption.

  1. Étiquetez le TGF-β1 à l’aide d’un kit de marquage des protéines en suivant les instructions du fabricant. Ajouter 20 μL de TGF-β1 marqué à 25 μL deH2Opour obtenir une solution d’essai de 8,9 μg/mL.
  2. Étiquetez la matriline-3 à l’aide d’un kit d’étiquetage séparé. Ajouter 20 μL de matriline-3 marquée à 80 μg/mL deH2Opour obtenir une solution d’essai de 36 μg/mL.
    REMARQUE : Le marquage par colorant fluorescent du TGF-β1 a donné une concentration finale de 20 μg/mL, tandis que le marquage de la matriline-3 a donné une concentration finale de 80 μg/mL.
  3. Mélanger 20 μL de 80 μg/mL de matriline-3 marquée avec 20 μL de TGF-β1 marqué à 20 μg/mL et 5 μL deH2O, ce qui donne un composé TGF-β1/matriline-3 marqué. Pipeter le mélange plusieurs fois pour mélanger.
  4. Ajouter 5 μL de 1 mg/mL de JBNts à 40 μL deH2O, ce qui donne une solution de 111 μg/mL.
  5. Ajouter 20 μL de TGF-β1 marqué à 20 μL de matriline-3 marqué 80 μg/mL et pipette plusieurs fois. Ajouter 5 μL de JBNts à 1 mg/mL à la solution marquée de TGF-β1/matriline-3 et pipeter à plusieurs reprises pour bien mélanger le composé.
    REMARQUE : Les concentrations finales des échantillons de JBNt, de TGF-β1 marqué et de matriline-3 marquée étaient de 111 μg/mL, 8,9 μg/mL et 36 μg/mL, respectivement.
  6. Transférer chaque groupe d’échantillons (c.-à-d. TGF-β1 marqué (étape 6.1), matriline-3 marqué (étape 6.2), marqué TGF-β1/matrilin-3 (étape 6.3), JBNts (étape 6.4), JBNm (étape 6.5)) dans leur propre puits d’une plaque noire de 384 puits.
  7. Chargez la plaque noire à 384 puits dans un lecteur de microplaques multimode et prenez des mesures aux longueurs d’onde d’excitation de 488 nm et 555 nm en suivant le protocole du fabricant.

7. Essai de la fonction biologique in vitro

  1. Test d’adhérence cellulaire sur chambres de verre de couverture pré-revêtues
    1. Préparez deux verres de couverture chambrés avec cinq groupes d’échantillons, car un verre de couverture est utilisé pour chaque type de cellule.
    2. Ajouter 1,25 μL de 1 mg/mL de JBNts à 198,75 μL d’eau distillée, ce qui donne une solution de 6,25 μg/mL.
    3. Ajouter 10 μL de matriline-3 à 10 μg/mL de matriline-3 à 190 μL d’eau distillée, ce qui donne une solution de 0,5 μg/mL.
    4. Ajouter 2,5 μL de TGF-β1 à 197,5 μg/mL d’eau distillée, ce qui donne une solution de 0,125 μg/mL.
    5. Pour le groupe JBNm, ajouter 10 μL de matriline-3 à 10 μg/mL de matriline-3 à 2,5 μL de 10 μg/mLTGF-β1 et pipeter à plusieurs reprises. Ajouter 1,25 μL de JBNts à une concentration de 1 mg/mL à la solution de mélange et à la pipette. Enfin, ajoutez 186,25 μL d’eau distillée pour obtenir une solution de 200 μL de JBNm.
      1. Pour le groupe témoin, utiliser 200 μL d’eau distillée.
    6. Ajouter chaque groupe d’échantillons dans son propre puits d’un verre à couvercle chambré no 1.5. Placez le verre de couverture dans un congélateur à -80 °C pendant 1 h, puis lyophilisez-le avec un instrument lyophiliseur.
    7. Ensemencer des cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh) et des cellules chondrocytaires humaines (10 000 cellules par puits) dans chaque puits des verres de couverture chambrés préparés.
    8. Incuber les deux verres de couverture pendant 4 h dans un incubateur à 37 °C. Ensuite, aspirez le milieu de culture cellulaire et rincez deux fois avec du PBS.
    9. Fixer les cellules avec 4% de paraformaldéhyde pendant 5 min, puis prélever et rincer les échantillons avec du PBS. Rincer l’échantillon une deuxième fois pour éliminer complètement le paraformaldéhyde à 4%.
    10. Incuber les cellules avec 100 μL de Triton-X à 0,1% pendant 10 min et laver avec du PBS. Ajouter 100 μL de rhodamine-phalloïdine 0,165 μM à chaque puits. Attendez 30 minutes, puis lavez à nouveau avec PBS.
    11. Ajouter 0,1 μg/mL de DAPI à chaque puits pour colorer les noyaux. Attendez 5 minutes et rincez les puits avec du PBS deux fois.
    12. Utilisez un microscope confocal spectral pour observer la morphologie cellulaire et capturer des images fluorescentes.
    13. De plus, analysez le nombre de cellules et la morphologie à l’aide d’un logiciel de traitement d’images. Ouvrez le logiciel et chargez les images. Ajoutez une barre d’échelle et calibrez le logiciel. Comptez le nombre de cellules dans une zone donnée pour chaque échantillon. Ensuite, utilisez l’outil de mesure pour collecter des données sur la morphologie cellulaire de chaque échantillon.
  2. Prolifération cellulaire
    1. Préparer trois plaques non traitées de 96 puits, en ajoutant cinq groupes d’échantillons à chacune.
      1. Pour le groupe JBNt, ajouter 3,75 μL de 1 mg/mL de JBNts à 596,25 μL d’eau distillée, ce qui donne une solution de 600 μL de JBNt à une concentration de 6,25 μg/mL.
      2. Pour le groupe TGF-β1, ajouter 7,5 μL de TGF-β1 à 592,5 μL d’eau distillée, ce qui donne une solution d’essai de 0,125 μg/mL.
      3. Pour le groupe matriline-3, ajouter 30 μL de matriline-3 à 10 μg/mL de matriline-3 à 570 μL d’eau distillée, ce qui donne une solution d’essai de 0,5 μg/mL.
      4. Pour le groupe JBNm, mélanger 7,5 μL de TGF-β1 à 10 μg/mL avec 30 μL de matriline-3 à 10 μg/mL et une pipette plusieurs fois, puis ajouter 3,75 μL de JBNts à 1 mg/mL à la solution.
      5. Diluer la solution de JBNm avec 558,75 μL d’eau distillée pour obtenir les concentrations finales de 6,25 μg/mL, 0,125 μg/mL et 0,5 μg/mL, respectivement, pour les échantillons de JBNt, TGF-β1 et matrilin-3.
      6. Pour le groupe témoin, utiliser 600 μL d’eau distillée.
    2. Diviser chaque groupe d’échantillons en six puits (échantillon de 100 μL par puits).
    3. Placer les trois plaques contenant tous les échantillons dans un congélateur à -80 °C pendant 1 h, puis lyophiliser avec un instrument lyophilisant.
    4. Ensemencer les CSMh sur ces plaques, chacune recevant une suspension cellulaire de 100 μL (par puits) contenant 5 000 cellules. Incuber les trois plaques à 37 °C pendant 1 jour, 3 jours ou 5 jours à 5% CO2.
    5. Ajouter 10 μL de solution CCK-8 à chaque puits avec les cellules et incuber à 37 °C pendant 2 h supplémentaires.
    6. Mesurez les valeurs d’absorption de chaque puits avec des lecteurs de microplaques multimodes à 450 nm.
    7. Ensemencer un gradient connu de CSMh sur une plaque de 96 puits et incuber pendant 4 h. Utilisez le test CCK-8 pour mesurer les valeurs d’absorption du nombre connu de cellules et générer une courbe standard.
    8. Calculer la prolifération cellulaire à l’aide de la courbe standard d’absorption.
  3. Essai de stabilité
    REMARQUE : Une trousse ELISA humaine ciblant le TGF-β1 a été utilisée pour déterminer le pourcentage de libération de TGF-β1 du JBNm dans un hydrogel d’agarose.
    1. Préparer l’agarose à 2 % en ajoutant 400 mg de poudre d’agarose à 20 mL de PBS et en la chauffant jusqu’à 100 °C pour dissoudre complètement la poudre d’agarose.
    2. Préparez le JBNm à l’intérieur de l’hydrogel d’agarose à 2% refroidi.
      1. Combiner 10 μL de 10 μg/mL de TGF-β1, 40 μL de 10 μg/mL de matriline-3, 5 μL de 1 mg/mL de JBNts et 195 μL de PBS. Mélanger cette solution avec 250 μL d’agarose à 2%, créant l’hydrogel JBNm.
    3. Ajoutez 500 μL de PBS, en l’utilisant comme solution de libération, et assurez-vous de le changer tous les 3 jours. Conservez chaque solution libérée et laissez reposer l’échantillon pendant 15 jours.
    4. Utilisez un kit ELISA pour tester chacune des solutions de libération capturées, en suivant les instructions du fabricant.
      NOTA: En soustrayant la quantité de TGF-β1 rejetée dans le PBS de la valeur de charge théorique de 100%, la quantité restante de TGF-β1 peut être déterminée.
  4. Analyse de différenciation cellulaire avec PCR26.
    1. Préparer sept groupes d’échantillons avec chaque échantillon contenant 20 μL de suspension cellulaire (4 x 104 cellules), 30 μL de la solution spécifique (ou PBS, selon le groupe d’échantillon) et 50 μL de 2 % en poids d’agarose.
      1. Pour le groupe TGF-β1, ajouter 5 μL de TGF-β1 à 25 μL de PBS, ce qui donne une solution de 1,6 μg/mL.
      2. Pour le groupe matriline-3, ajouter 20 μL de matriline-3 à 10 μg/mL de PBS, ce qui donne une solution de 6,7 μg/mL.
      3. Pour le groupe JBNt, ajouter 2,5 μL de 1 mg/mL de JBNts à 27,5 μL de PBS, ce qui donne une solution de 83,3 μg/mL.
      4. Pour le groupe J/T/M JBNm, ajouter 10 μL de matriline-3 à 10 μg/mL de TGF-β1 à 5 μL de TGF-β1 à 10 μg/mL et pipeter de haut en bas pour mélanger la solution. Ensuite, ajoutez 2,5 μL de 1 mg/mL de JBNts et pipette à nouveau. Enfin, diluer avec 2,5 μL de PBS.
      5. Pour chaque groupe témoin, utiliser 30 μL de PBS comme échantillon.
    2. Ajouter 0,5 mL de milieu de culture cellulaire à chaque puits, en veillant à le remplacer tous les 3 jours.
      1. Pour le groupe témoin positif, utiliser un milieu chondrogène hMSC disponible dans le commerce contenant du TGF-β1 ajouté. Ce TGF-β1 supplémentaire est égal à la quantité dans les groupes TGF-β1 et J/T/M JBNm.
      2. Pour l’un des groupes témoins négatifs, utiliser un milieu chondrogène hMSC commercial qui ne contient pas de TGF-β1. Pour l’autre groupe témoin négatif, utiliser un milieu de culture cellulaire DMEM contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS).
      3. Pour tous les autres groupes, utiliser un milieu de culture cellulaire chondrogène hMSC commercial sans TGF-β1.
    3. Culture des échantillons pendant 15 jours.
    4. Extraire l’ARN des échantillons et effectuer une PCR pour étudier la différenciation des échantillons comme décrit précédemment26.
  5. Immunomarquage pour le dosage d’expression du collagène de type X
    1. Préparer sept échantillons à base d’agarose de la même manière que la différenciation cellulaire avec la section de la méthode PCR (étape 7.4).
    2. Culture des échantillons pendant 15 jours.
    3. Fixez les échantillons avec 4% de formaldéhyde pendant 1 jour, faites tremper dans une solution de saccharose à 30% pendant une nuit, puis congelez toute la nuit à -80 °C avec de l’azote liquide. Fixez les échantillons à l’aide du réactif composé (OCT) à température de coupe optimale, un mélange de glycols et de résines solubles dans l’eau, à -10 °C.
    4. Utiliser un microtome cryostat pour obtenir des sections congelées de 20 μm d’épaisseur de chaque échantillon.
    5. Colorer chaque section avec un anticorps anti-collagène X avec une dilution de 1:800 et un anticorps secondaire de marquage fluorescent dilué avec du PBS, selon les protocoles du fabricant.
    6. Observez chaque section avec un microscope confocal, en utilisant une excitation de 488 nm et un grossissement de 40x sur l’oculaire.

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Representative Results

Conformément au protocole, les JBNt ont été synthétisés avec succès et caractérisés par absorption UV-Vis et MET. Le JBNm est un échafaudage solide injectable qui subit un processus biomimétique rapide. Après l’ajout de JBNts à un mélange de solution de TGF-β1/matriline-3 dans un environnement physiologique, un échafaudage solide à mailles blanches a été formé indiquant l’assemblage réussi de JBNm, comme le montre la figure 1. Cela a été démontré dans les méthodes de caractérisation.

Dans des conditions physiologiques, la matriline-3 est chargée négativement en raison de son point isoélectrique27 (Figure 2A). Après l’ajout de la solution TGF-β1 à la solution de matriline-3, le potentiel zêta du composé TGF-β1/matrilin-3 a augmenté à une valeur presque neutre, indiquant que les deux protéines étaient liées par des interactions de charge. Comme le montre la figure 2A, le potentiel zêta de JBNm est le plus élevé des trois groupes en raison des JBNts, car le point isoélectrique de la chaîne latérale de la lysine est d’environ 9,74 dans un environnement physiologique. L’augmentation des valeurs de potentiel zêta du JBNm indique l’assemblage réussi de sa structure couche par couche.

Les spectres d’absorption UV-Vis (Figure 2B) clarifient la formation de la structure intérieure hiérarchique couche par couche du JBNm. Les cycles aromatiques des chaînes latérales de lysine et des JBNts ont contribué aux deux pics d’absorption à 220 nm et 280 nm, respectivement. La diminution de la valeur d’absorption a été observée après l’ajout de TGF-β1, ce qui indique que la liaison se produit entre le TGF-β1 et le JBNts. Après l’ajout de JBNts à la matriline-3, une diminution plus évidente de l’intensité d’absorption des pics a été observée, indiquant une fois de plus une liaison réussie entre la matriline-3 et les JBNts. De même, après l’ajout de JBNts à un mélange de TGF-β1/matriline-3, le JBNm s’est formé et les pics d’absorption ont diminué en intensité. Le pic d’absorption de JBNm est plus proche de la ligne matrilin-3/JBNts que de la droite TGF-β1/JBNts, ce qui indique que les JBNts préfèrent se lier à la matriline-3, formant une structure externe couche par couche avec matrilin-3 tandis que TGF-β1 réside dans la couche interne. La TEM est utilisée pour caractériser la morphologie des JBNts et des JBNm (Figure 2C). Après combinaison avec des protéines, d’épais faisceaux de JBNm ont été observés formant une structure d’échafaudage.

La microscopie à fluorescence a confirmé la présence de la structure couche par couche (Figure 3A) et a démontré la coupe transversale du JBNm. Après avoir marqué TGF-β1 et matriline-3, il a été observé que la matriline-3 fluorescente rouge enveloppe les faisceaux JBNt, formant la couche externe du JBNm. Sur la figure 3B, le TGF-β1 fluorescent vert a formé une couche interne, contribuant à la capacité de stocker les facteurs de croissance et permettant la localisation du TGF-β1. La figure 3C montre le processus de transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) entre les protéines marquées par un colorant fluorescent caractérisé par des spectres de fluorescence, avec des pics d’émission à 520 nm et 570 nm pour les groupes TGF-β1 et matriline-3 marqués, respectivement28. Après l’ajout de JBNts selon le protocole, la structure couche par couche est formée; des pics ont été observés à 520 nm et 570 nm pour le groupe JBNm, indiquant une liaison et un assemblage réussis des protéines et des JBNts.

De plus, l’effet du JBNm sur l’adhésion des CSMh et la prolifération cellulaire a été exploré. Comme le montre la figure 4, la densité d’adhérence cellulaire du JBNm revêtu sur la surface des verres de couverture chambrés a été déterminée. Le JBNm a montré que les CSMh étaient regroupées le long de lui-même (Figure 4A), tandis que moins de cellules adhéraient aux JBNts. Cependant, pour les autres groupes, les CSMh étaient réparties uniformément sans alignement par rapport au groupe JBNm. L’alignement des cellules, ainsi que la taille des cellules sur le JBNm, ont démontré que les JBNt jouaient un rôle dans l’adhésion cellulaire, tandis que les protéines du JBNm augmentaient l’affinité de l’adhésion cellulaire (Figure 4B,C).

Après le jour 1 de culture cellulaire avec le JBNm, le JBNts, la matriline-3 seule, le TGF-β1 seul et le contrôle négatif, les groupes JBNm et TGF-β1 ont montré une prolifération cellulaire significative par rapport aux autres groupes. Lorsque la durée de la culture cellulaire a été augmentée à 3 et 5 jours, les groupes JBNm et TGF-β1 ont démontré une prolifération cellulaire encore plus accrue, comme le montre la figure 5. Une étude fonctionnelle à long terme a été réalisée pour déterminer la différenciation des CSMh avec JBNm et sans JBNm (témoin négatif). Après 15 jours, une coloration bleue alcian améliorée a été observée, indiquant une chondrogenèse des CSMh se développant aux côtés de JBNm26. Ainsi, les cellules préféraient les JBNts du JBNm. Cela était probablement dû à sa structure imitant l’ADN et à sa capacité à être désassemblé en unités à petites molécules, ces dernières pouvant être déclenchées par un faible pH ou une activité enzymatique suffisante (comme l’absorption par les cellules)14,29.

Vidéo 1 : Enregistrement vidéo de l’assemblage JBNm. Cet enregistrement décrit la formation des JBNts, de la matriline-3 et du TGF-β1 dans le JBNm. Ce chiffre a été modifié à partir de Zhou et al. (2021)26. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Figure 1
Figure 1 : Illustration schématique de la structure chimique des JBNts, du J/T/M JBNm et de la capacité chondrogénique du J/T/M J/M JBNt. (A) La structure chimique des JBNts, mettant en évidence leur formation du monomère à l’anneau de rosette en passant par JBNt. (B) Les composants qui composent le J/T/M JBNm, ainsi que la façon dont ils s’assemblent dans le JBNm. (C ) Schéma de culture de cellules souches mésenchymateuses humaines sur le J/T/M JBNm. Ce chiffre a été modifié à partir de Zhou et al. (2021)26. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Caractérisation matérielle du J/T/M JBNm. (A) Spectres zêta de potentiel zêta de la matriline-3 seule, du composé TGF-β1/matrilin-3 et du J/T/M JBNm. (B) Spectres d’absorption UV-Vis des JBNts seuls, de la matriline-3 seule, du TGF-β1 seul, du composé matrilin-3/JBNts, du composé TGF-β1/JBNts et du J/T/M JBNm. (C ) Images des JBNt seules et du J/T/M JBNm obtenues par microscopie électronique à transmission (MET). Ce chiffre a été modifié à partir de Zhou et al. (2021)26. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Imagerie confocale fluorescente et spectres de fluorescence de J/T/M JBNm. (A) Image confocale 3D du J/T/M JBNm, avec matriline-3 marquée fluorescente rouge et TGF-β1 marquée fluorescente verte. (B) Images confocales 2D de J/T/M JBNm, avec matrilin-3 marquée fluorescente rouge, TGF-β1 marqué fluorescent vert et une version fusionnée. (C) Spectres de fluorescence de divers composés pour caractériser le processus FRET entre les protéines marquées. Ce chiffre a été modifié à partir de Zhou et al. (2021)26. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Analyse de la culture de cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh). (A) Images de microscopie optique de hMSC avec TGF-β1, matriline-3 et JBNts, cultivées sur un gel d’agarose. (B) Images de microscopie confocale de hMSC cultivées sur le verre de couverture chambré recouvert de divers composants JBNm. (C) Graphique du nombre de cellules adhérentes par millimètre carré pour chaque groupe. Les barres d’erreur indiquent les écarts-types. (D) Graphique de la longueur du grand axe de la cellule en μm par groupe. Les barres d’erreur indiquent les écarts-types. Note: N ≥ 3, *P< 0,05, **P< 0,01, ***P< 0,001, ****P< 0,0001 (par rapport aux témoins négatifs, NC). Ce chiffre a été modifié à partir de Zhou et al. (2021)26. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Comparaison du nombre de cellules pour différents groupes entre les jours 1, 3 et 5. Statistiques sur le nombre de cellules des CSMh après culture avec différents matériaux les jours 1, 3 et 5. Les barres d’erreur indiquent les écarts-types. Note: N = 6, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Ce chiffre a été modifié à partir de Zhou et al. (2021)26. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

L’objectif de cette étude est de développer une plateforme d’échafaudage biomimétique, le JBNm, pour surmonter les limites des constructions tissulaires conventionnelles qui reposent sur des environnements de culture cellulaire pour arbitrer la différenciation cellulaire. Le JBNm est un échafaudage de structure couche par couche pour une construction de tissu cartilagineux autonome. La conception innovante est basée sur de nouveaux nanomatériaux inspirés de l’ADN, les JBNts. Le JBNm, composé de JBNts30, TGF-β1 et matrilin-3, est assemblé par une nouvelle technique couche par couche où l’auto-assemblage de l’échafaudage était contrôlé au niveau moléculaire. L’assemblage de JBNm a été observé et caractérisé par mesure du potentiel zêta, absorption UV-Vis, TEM et analyse spectrale de fluorescence.

Les spectres UV-Vis de la figure 2B (étape 3) ont démontré la formation de l’intérieur hiérarchique couche par couche du JBNm. Une différence dans les pics d’absorbance peut être observée en raison d’une différence d’affinité de liaison. Plus d’interactions majeures se produisent entre JBNts et matriline-3 qu’entre JBNts et TGF-β1, ce qui indique que les JBNts imitent les protéines de collagène en termes de morphologie fibreuse et de chimie de surface de la lysine. Cette technique est nécessaire pour observer la liaison des JBNts à la matriline-3 plutôt qu’au TGF-β1, permettant l’encapsulation du TGF-β1 et fournissant ainsi une libération lente de TGF-β1 dans le tissu environnant. L’étape la plus critique dans le développement du JBNm est la combinaison des protéines avec les JBNts. TGF-β1 et matriline-3 doivent être ajoutés avant l’ajout de JBNts pour observer le plein effet du phénomène FRET entre la matriline-3 marquée et TGF-β1. La limitation de cette technique provient de la séquence d’addition incorrecte des protéines et des nanotubes, ce qui entraîne des mesures variées. Il s’agit d’une étape importante pour la formation de JBNm pour les études futures et, par conséquent, sera appliquée aux futures fabrications et études JBNm.

La matriline-3 est une protéine très négative, tandis que le TGF-β1 est une protéine légèrement neutre, comme le montre la figure 2A. La différence de charge a été observée pour déterminer la liaison de ces protéines. À partir de l’état de charge négative de la matriline-3, le potentiel zêta a augmenté à une valeur presque neutre après l’ajout de TGF-β1 (Figure 2A). Cette étape est importante pour déterminer la première couche interne de l’échafaudage biomimétique et pour indiquer que la combinaison des deux protéines se fait par interaction de charge. Après l’ajout de JBNts, qui est la deuxième étape de la fabrication de JBNm, le potentiel zêta de JBNm a été mesuré à ~10 ± 5 mV (Figure 2A). Parce que les JBNt sont très positifs, la charge de JBNm a été observée pour augmenter comme prévu. La détermination des charges avec un potentiel zêta est donc importante pour observer la formation de JBNm étape par étape via des interactions de charge. Semblable à la spectroscopie UV-Vis, la séquence d’addition est importante dans cette étape, et un ordre d’addition incorrect peut entraîner des mesures variées. De même, il est important de pipeter le mélange de haut en bas avant la mesure.

Ensuite, TGF-β1 et matriline-3 sont marqués de manière à ce que le développement de JBNm puisse être observé avec la microscopie confocale et l’analyse spectrale de fluorescence avec des lecteurs de microplaques multimodes. Les échantillons ont été excités avec un laser de 488 nm et ont montré des pics d’émission à 520 nm et 570 nm (Figure 3). Aucun pic d’émission n’a été observé pour les JBNt seuls parce qu’ils ne sont pas étiquetés. Le FRET s’est produit du donneur TGF-β1 à l’accepteur de matriline-3, réduisant ainsi le pic d’émission à 520 nm et augmentant le pic d’émission à 570 nm; les deux composantes sont distantes de 10 nm, ce qui permet au phénomène FRET de se produire. Par conséquent, l’assemblage de JBNm est basé sur des processus spatiaux (c’est-à-dire la distance physique) ainsi que sur des interactions de charge. L’étape la plus critique dans le développement de JBNm est la séquence d’ajout; Le TGF-β1 et la matriline-3 doivent être ajoutés avant l’ajout des JBNt pour observer le plein effet du phénomène FRET. Un grossissement d’au moins 40x sur l’oculaire est nécessaire pour observer le JBNm fluorescent. La limite de cette technique est que les JBNt ne sont pas marqués et, par conséquent, ne peuvent pas être observés avec la microscopie confocale. Cependant, la technique de marquage des protéines peut être appliquée au marquage JBNt avec quelques modifications pour des applications futures.

JBNm peut aider les fonctions cellulaires, telles que l’adhésion cellulaire et la prolifération cellulaire. Dans cette étude, les CSMh ont été cultivées (à partir de 5 000 cellules) sur différents matériaux (JBNm, JBNts, TGF-β1, matriline-3 et témoins négatifs sans additifs) pour comparer le nombre de cellules après incubation pendant 1, 3 et 5 jours en utilisant une solution CCK-8, en suivant les protocoles exacts du fabricant pour déterminer la prolifération cellulaire. JBNm, en particulier en présence de TGF-β1, et TGF-β1 seul a montré une prolifération cellulaire significative par rapport aux trois autres groupes. Les JBNts imitent morphologiquement le collagène dans l’ECM tandis que la matriline-3 est une protéine spécifique du cartilage, ce qui entraîne une activité de prolifération cellulaire accrue après incubation à 37 °C pendant 3 et 5 jours (Figure 5). Le JBNm a montré un grand potentiel pour servir d’échafaudage d’ingénierie tissulaire injectable et biomimétique pour surmonter les limites des constructions cellulaires traditionnelles pour diverses applications futures en tant que biomatériaux29,31. JBNm imite morphologiquement l’ECM cartilagineux, fournissant des sites d’adhésion et permettant la libération de facteurs différentiels pro-chondrogènes dans le microenvironnement, tels que TGF-β132,33. La capacité du JBNm à incorporer le TGF-β1 dans la couche interne de l’échafaudage l’empêche de fuir vers des zones indésirables, améliorant ainsi l’efficacité de l’échafaudage (Figure 4 et Figure 5). De nombreux hMSC se regroupent le long de l’échafaudage JBNm, tandis que les cellules sont peu réparties dans les groupes matrilin-3, TGF-β1 et témoins négatifs (Figure 4). La morphologie des cellules a également été observée, indiquant une excellente affinité avec les surfaces JBNm. Ces biomatériaux conçus avec précision empêchent la libération rapide de molécules bioactives incorporées dans l’environnement de culture cellulaire et améliorent l’autosuffisance des constructions tissulaires dans la matrice34. Une limite de cette technique est que le nombre de cellules de départ est essentiel pour déterminer la prolifération des cellules. Un nombre de cellules de départ de 5 000 a été jugé le plus optimal pour cette étude. Une courbe standard est également nécessaire pour déterminer le nombre de cellules en traçant un nombre connu de cellules et en les mesurant dans le lecteur de microplaques multimode. Cette technique peut être appliquée à l’avenir en tant que méthode standardisée pour déterminer la prolifération cellulaire dans toutes les études relatives aux échafaudages JBNm.

Les CSMh ont été cultivées dans des granulés d’agarose 3D avec et sans JBNm pour déterminer l’étude fonctionnelle à long terme pendant 15 jours. Après 15 jours, l’ARN total a été extrait des CSMh dans les pastilles d’agarose, contenant un contrôle positif (les pastilles ont été fournies avec du TGF-β1 frais chaque fois que le milieu a été changé), JBNm, JBNts, matriline-3, TGF-β1 et aucun additif. La qPCR en temps réel a été réalisée pour l’analyse des gènes, testant les marqueurs de différenciation chondrogénique, Aggrecan (ACAN) et le marqueur d’hypertrophie de type collagène X (COL X). L’expression d’ACAN dans le groupe JBNm a augmenté de manière significative par rapport aux autres groupes, démontrant que JBNm favorise significativement la différenciation chondrogénique des cellules souches tout en inhibant COL X. Pendant ce temps, le contrôle positif a amélioré la chondrogenèse, comme indiqué dans l’augmentation de l’ACAN, ainsi que l’hypertrophie de la cellule différenciée26. Une autre limite de cette étude est que l’extraction de l’ARN se fait à partir des cellules incorporées dans un hydrogel. L’ARN total obtenu dans ce protocole était donc faible en concentration et en pureté. Pour surmonter cette limitation, d’autres échantillons ont été cultivés et extraits afin d’obtenir la concentration et la pureté optimales pour l’étape suivante, la qPCR en temps réel. Bien que la qPCR soit importante pour l’étude, une modification mineure de cette technique est nécessaire pour les études futures afin d’assurer une extraction efficace des échantillons sans sacrifier un grand nombre d’échantillons.

Un test de stabilité a été effectué avec un kit ELISA TGF-β1 humain pour tester la libération de protéines de l’hydrogel JBNm. Dans cette étude, le TGF-β1 devrait être encapsulé dans le J/T/M JBNm et, par conséquent, aucun rejet de TGF-β1 ne devrait être observé (c.-à-d. que la valeur de charge théorique est de 100 %). Une limitation de cette étape est que tout TGF-β1 est supposé être encapsulé dans l’échafaudage JBNm couche par couche. Après 15 jours, les solutions libérées par l’hydrogel sont collectées et testées avec le kit, en suivant les protocoles du fabricant. Ensuite, la quantité de TGF-β1 a été calculée en soustrayant la quantité de TGF-β1 libérée dans PBS de la valeur de charge théorique. Comme le TGF-β1 a été encapsulé dans la couche interne du JBNm, la libération lente de la protéine était prévue. L’étude a démontré que le TGF-β1 est localisé dans l’échafaudage JBNm et ne se libère pas rapidement dans les zones environnantes26.

Cette construction innovante de tissu cartilagineux JBNm couche par couche a été réalisée par auto-assemblage hautement organisé et contrôlé au niveau moléculaire. Le TGF-β1 est confiné dans la couche interne des fibres matricielles, empêchant sa fuite vers des endroits indésirables et favorisant simultanément la chondrogenèse localisée. De plus, la matriline-3 est localisée dans la couche externe des fibres matricielles, créant un microenvironnement anti-hypertrophique35. Il a été démontré que les JBNt servent non seulement d’épine dorsale structurelle d’échafaudage, mais améliorent également l’ancrage et l’adhésion des cellules souches pour localiser les cellules le long des fibres matricielles30,36. En ce qui concerne les travaux futurs, la conception couche par couche de l’échafaudage basé sur JBNt sera personnalisée pour des applications dans divers tissus37,38,39.

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Disclosures

Le Dr Yupeng Chen est cofondateur d’Eascra Biotech, Inc. et de NanoDe Therapeutics, Inc.

Acknowledgments

Ce travail est soutenu par les subventions NIH 7R01AR072027 et 7R03AR069383, NSF Career Award 1905785, NSF 2025362 et l’Université du Connecticut. Ce travail est également soutenu en partie par la subvention S10OD016435 des NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 % Normal Goat Serum Thermo Fisher 50062Z Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.
24-well plate Corning 07-200-740 24-well plate used for comparative cell culture.
384-Well Black Untreated Plate Thermo Fisher 262260 384-well plate used for absorption measurements.
8-well chambered coverglass Thermo Fisher 155409PK 8-well coverglass used for comparative cell culture.
96-well flat bottom Corning 07-200-91 96-well plate used for comparative cell culture.
96-Well Plate non- treated Thermo Fisher 260895 96-well plate used for comparative cell culture and analysis.
Agarose Gel Sigma-Aldrich A9539 Hydrogel used for cell culture.
Agarose Gel Sigma Aldrich A9539 Hydrogel used as an environment for cell culture.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit Thermo Fisher A30006 (488) and A30007 (555) Fluorescent dye used to label proteins.
Anti-Collagen X Antibody Thermo Fisher 41-9771-82 Antibody used to stain collagen-X.
Bio-Rad PCR Machine Bio-Rad Equipment used to perform PCR on samples.
C28/I2 Chondrocyte Cell Line Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.
Cell Counting Kit 8 Milipore Sigma 96992 Cell proliferation assay.
Cell Profiler Broad Institute Software used to analyze cell images.
Cryostat Microtome Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.
DAPI Invitrogen D1306 Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.
Disposable cuvettes FISHER Scientific 14-955-128 Container used for spectrophotometry.
DMEM Cell Culture Medium Thermo Fisher 10566032 Media used to support cellular growth.
Fetal Bovine Serum GIBCO A4766801 Serum used in cell culture medium to support cell growth.
Fluoromount-G Mounting Medium Thermo Fisher 00-4958-02 Solution used to mount slides for immunostaining.
Formaldehyde Compound used to fix samples prior to microtoming.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody Thermo Fisher A16110 Antibody used for protein staining.
Human Mesenchymal Stem Cells LONZA PT-2501 Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium LONZA PT-3003 Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.
ImageJ National Institutes of Health Image analysis software used in conjunction with microscopy.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit BioRad 1725150 Kit used for PCR.
Janus-base nanotubes (JBNts) Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope Tecnai Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.
MATLAB MathWorks Statistical software used for modeling and data analysis.
Matrilin-3 Fisher Scientific 3017MN050 Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Fisher Equipment used to measure absorption values of a sample.
Nikon A1R Spectral Confocal Microscope Nikon A1R HD25 Confocal microscope used to analyze samples.
Number 1.5 Chamber Coverglass Thermo Fisher 152250 Environment for sterile cell culture and imaging.
Optimal Cutting Temperature Compound Reagent Compound used to embed cells prior to microtoming.
Paraformaldehyde Thermo Scientific AAJ19943K2 Compound used to fix cells.
PDC-32G Plasma Cleaner Harrick Plasma Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.
penicillin-streptomycin GIBCO 15-140-148 Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.
Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher 10010023 Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.
Rhodamine-phalloidin Invitrogen R415 F-Actin red fluorescent dye.
Rneasy Plant Mini Kit QIAGEN 74904 Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.
Sucrose Solution Solution used to process samples prior to microtoming.
TGF beta-1 Human ELISA Kit Invitrogen BMS249-4 Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample.
TGF-β1 PEPROTECH 100-21C Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.
Triton-X Invitrogen HFH10 Compound used to lyse cells not fixed during staining process.
TRIzol Reagent Thermo Fisher 15596026 Reagent used to isolate RNA.
Zetasizer Nano ZS Malvern Panalytical Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.

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Bioengineering numéro 185
Fabrication et caractérisation de nano-matrice Janus Base couche par couche pour favoriser la régénération du cartilage
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Landolina, M., Yau, A., Chen, Y.… More

Landolina, M., Yau, A., Chen, Y. Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration. J. Vis. Exp. (185), e63984, doi:10.3791/63984 (2022).

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