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Bioengineering

कार्टिलेज पुनर्जनन को बढ़ावा देने के लिए परत-दर-परत जेनस बेस नैनो-मैट्रिक्स का निर्माण और लक्षण वर्णन

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/63984
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Connecticut
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल क्रमिक रूप से जेनस बेस नैनोट्यूब (जेबीएनटीएस), मैट्रिलिन -3, और ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर बीटा -1 (टीजीएफ-1) को जोड़कर परत-दर-परत जेनस बेस नैनो-मैट्रिक्स (जेबीएनएम) मचान की असेंबली का वर्णन करता है। जेबीएनएम को गढ़ा और विशेषता दी गई थी; इसके अतिरिक्त, इसने उत्कृष्ट बायोएक्टिविटी प्रदर्शित की, जो आसंजन, प्रसार और भेदभाव जैसे सेल कार्यों को प्रोत्साहित करती है।

Abstract

इन विट्रो और विवो उपयोगों के लिए विशिष्ट कार्यों को बढ़ावा देने की उम्मीद में सेल आसंजन और प्रसार का मार्गदर्शन करने के लिए विभिन्न बायोमटेरियल स्काफोल्ड्स विकसित किए गए हैं। इन बायोमटेरियल मचानों में विकास कारकों को जोड़ना आम तौर पर एक इष्टतम सेल संस्कृति वातावरण प्रदान करने, सेल भेदभाव और इसके बाद के कार्यों की मध्यस्थता करने के लिए किया जाता है। हालांकि, एक पारंपरिक बायोमटेरियल पाड़ में विकास कारक आमतौर पर आरोपण पर जारी करने के लिए डिज़ाइन किए जाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप आसपास के ऊतक या कोशिकाओं पर अनपेक्षित दुष्प्रभाव हो सकते हैं। यहां, डीएनए-प्रेरित जेनस बेस नैनो-मैट्रिक्स (जेबीएनएम) ने स्व-टिकाऊ उपास्थि ऊतक निर्माण के लिए परत-दर-परत संरचना के साथ एक अत्यधिक स्थानीयकृत माइक्रोएन्वायरमेंट सफलतापूर्वक हासिल किया है। जेबीएनएम को जेनस बेस नैनोट्यूब (जेबीएनटीएस), मैट्रिलिन -3, और बायोफिनिटी के माध्यम से ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर बीटा -1 (टीजीएफ-ए 1) से स्व-इकट्ठा किया जाता है। जेबीएनएम को 1: 4: 10 के टीजीएफ-ए1: मैट्रिलिन -3: जेबीएनटी अनुपात में इकट्ठा किया गया था, क्योंकि यह निर्धारित अनुपात है जिस पर परत-दर-परत संरचना में उचित असेंबली हो सकती है। सबसे पहले, टीजीएफ-ए 1 समाधान को मैट्रिलिन -3 समाधान में जोड़ा गया था। फिर, जेबीएनटी समाधान को जोड़ने से पहले पर्याप्त एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए इस मिश्रण को कई बार पाइप किया गया था। इसने कई बार फिर से पाइपिंग के बाद परत-दर-परत जेबीएनएम का गठन किया। परत-दर-परत जेबीएनएम संरचना, अकेले जेबीएनटीएस, अकेले मैट्रिलिन -3, और अकेले टीजीएफ-ए 1 को चिह्नित करने के लिए विभिन्न प्रकार के प्रयोग किए गए थे। जेबीएनएम के गठन का अध्ययन यूवी-विस अवशोषण स्पेक्ट्रा के साथ किया गया था, और जेबीएनएम की संरचना को ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) के साथ देखा गया था। चूंकि आणविक पैमाने पर अभिनव परत-दर-परत जेबीएनएम पाड़ का गठन किया जाता है, फ्लोरोसेंट डाई-लेबल जेबीएनएम देखा जा सकता है। टीजीएफ-ए1 इंजेक्शन योग्य जेबीएनएम की आंतरिक परत के भीतर सीमित है, जो आसपास के क्षेत्रों में विकास कारकों की रिहाई को रोक सकता है, स्थानीयकृत चोंड्रोजेनेसिस को बढ़ावा दे सकता है, और एक एंटी-हाइपरट्रॉफिक माइक्रोएन्वायरमेंट को बढ़ावा दे सकता है।

Introduction

ऊतक इंजीनियरिंग में मचान सेल लगाव और बाद के ऊतक विकास के लिए संरचनात्मक सहायता प्रदान करने में महत्वपूर्ण भूमिकानिभाते हैं। आमतौर पर, किसी भी मचान के बिना पारंपरिक ऊतक निर्माण सेल संस्कृति वातावरण पर निर्भर करते हैं और सेल भेदभाव को मध्यस्थ करने के लिए विकास कारकों को जोड़ते हैं। इसके अलावा, मचानों में बायोएक्टिव अणुओं का यह जोड़ अक्सर सेल भेदभाव और कार्य 2,3 का मार्गदर्शन करने में पसंदीदा दृष्टिकोण है। कुछ मचान स्वतंत्र रूप से देशी ऊतकों के जैव रासायनिक माइक्रोएन्वायरमेंट की नकल कर सकते हैं, जबकि अन्य सीधे विकास कारकों के माध्यम से सेल कार्यों को प्रभावित कर सकते हैं। हालांकि, शोधकर्ताओं को अक्सर मचानों का चयन करने में चुनौतियों का सामना करना पड़ता है जो सेल आसंजन, विकास और भेदभाव को सकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकते हैं, जबकि लंबी अवधिमें इष्टतम संरचनात्मक समर्थन और स्थिरता प्रदान करते हैं। बायोएक्टिव अणु अक्सर पाड़ से शिथिल रूप से बंधे होते हैं जिससे आरोपण पर इन प्रोटीनों की तेजी से रिहाई होती है, जिसके परिणामस्वरूप अवांछित स्थानों में उनकी रिहाई होती है। यह ऊतकों या कोशिकाओं पर दुष्प्रभावों में समाप्त होता है जिन्हें जानबूझकरलक्षित नहीं किया गया था 6,7।

मचान आमतौर पर बहुलक सामग्री से बने होते हैं। जेनस बेस नैनो-मैट्रिक्स (जेबीएनएम) एक बायोमिमेटिक पाड़ मंच है जिसे स्व-टिकाऊ उपास्थि ऊतक निर्माण के लिए एक नई परत-दर-परत विधि के साथ बनायागया है। इन नए डीएनए-प्रेरित नैनोट्यूब को जेनस बेस नैनोट्यूब (जेबीएनटी) नाम दिया गया है, क्योंकि वे बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) में पाए जाने वाले कोलेजन की संरचना और सतह रसायन विज्ञान की ठीक से नकल करते हैं। बायोएक्टिव अणुओं के अलावा, जैसे कि मैट्रिलिन -3 और ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर बीटा -1 (टीजीएफ-ए 1), जेबीएनएम एक इष्टतम माइक्रोएन्वायरमेंट बना सकता है जो तब वांछित सेल और ऊतक कार्यक्षमता9 को उत्तेजित कर सकता है।

जेबीएनटी न्यूक्लियोबेस एडेनिन और थाइमिन के सिंथेटिक संस्करणों से प्राप्त नए नैनोट्यूब हैं। जेबीएनटीएस का गठन स्व-विधानसभा10 के माध्यम से किया जाता है; छह सिंथेटिक न्यूक्लियोबेस एक अंगूठी बनाने के लिए बंधते हैं, और ये छल्ले11 की लंबाई में 200-300 μm नैनोट्यूब बनाने के लिए π-π स्टैकिंग इंटरैक्शन से गुजरते हैं। ये नैनोट्यूब संरचनात्मक रूप से कोलेजन प्रोटीन के समान हैं; देशी उपास्थि माइक्रोएन्वायरमेंट के एक पहलू की नकल करके, जेबीएनटीएस को चोंड्रोसाइट्स और मानव मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एचएमएससी) 11,12,13,14 के लिए एक अनुकूल लगाव साइट प्रदान करने के लिए दिखाया गया है। क्योंकि नैनोट्यूब स्व-असेंबली से गुजरते हैं और किसी भी प्रकार के आरंभकर्ता (जैसे यूवी-प्रकाश) की आवश्यकता नहीं होती है, वे कठिन-से-पहुंचदोष क्षेत्रों के लिए एक इंजेक्शन योग्य मचान के रूप में रोमांचक क्षमता दिखाते हैं।

मैट्रिलिन -3 एक संरचनात्मक बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन है जो उपास्थि में पाया जाता है। यह प्रोटीन चोंड्रोजेनेसिस और उचित उपास्थि समारोह16,17 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हाल ही में, इसे बायोमटेरियल स्काफोल्ड्स में शामिल किया गया है, जो हाइपरट्रॉफी 9,18,19 के बिना चोंड्रोजेनेसिस को प्रोत्साहित करता है। जेबीएनएम में इस प्रोटीन को शामिल करके, उपास्थि कोशिकाओं को एक मचान की ओर आकर्षित किया जाता है जिसमें इसके मूल माइक्रोएन्वायरमेंट के समान घटक होते हैं। इसके अतिरिक्त, यह दिखाया गया है कि चोंड्रोसाइट्स20 के भीतर उचित टीजीएफ -1 सिग्नलिंग के लिए मैट्रिलिन -3 की आवश्यकता होती है। विकास कारक सिग्नलिंग अणुओं के रूप में कार्य करते हैं, जिससे एक निश्चित कोशिका या ऊतक की विशिष्ट वृद्धि होती है। इस प्रकार, इष्टतम उपास्थि पुनर्जनन प्राप्त करने के लिए, मैट्रिलिन -3 और टीजीएफ -1 जेबीएनएम के भीतर आवश्यक घटक हैं। परत-दर-परत मचान में टीजीएफ-ए1 को जोड़ने से ऊतक निर्माण में उपास्थि पुनर्जनन को बढ़ावा मिल सकता है। टीजीएफ-ए1 एक विकास कारक है जो ओस्टियोकॉन्ड्रल दोषों की उपचार प्रक्रिया को प्रोत्साहित करने के लिए नियोजित है, चोंड्रोसाइट्स और एचएमएससी प्रसार और भेदभाव21,22 को प्रोत्साहित करता है। इस प्रकार, टीजीएफ-ए1 उपास्थि पुनर्जनन जेबीएनएम (जे / टी / एम जेबीएनएम) 23 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, विशेष रूप से जब यह जेबीएनएम परतों के भीतर स्थानीयकृत होता है तो उचित विकास को प्रोत्साहित करता है।

जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, विकास कारक आमतौर पर मचानों के बाहर इकट्ठे होते हैं जिनमें निगमन के कोई विशिष्ट तरीके नहीं होते हैं। यहां, बायोमैटेरियल्स के सटीक रूप से डिज़ाइन किए गए नैनो-आर्किटेक्चर के साथ, जेबीएनएम को इच्छित कोशिकाओं और ऊतकों के विशिष्ट लक्ष्यीकरण के लिए विकसित किया गया था। जेबीएनएम आंतरिक परत में जेबीएनटी सतहों पर टीजीएफ-ए 1 से बना है और बाहरी परत24,25 में जेबीएनटी सतहों पर मैट्रिलिन -3 का पालन किया गया है। परत-दर-परत संरचना की आंतरिक परत में टीजीएफ-ए1 का समावेश जेबीएनएम फाइबर के साथ एक अत्यधिक स्थानीयकृत माइक्रोएन्वायरमेंट की अनुमति देता है, जिससे प्रोटीन12 की बहुत धीमी रिहाई के साथ एक होमियोस्टैटिक ऊतक निर्माण होता है। जेबीएनएम की इंजेक्टेबिलिटी इसे भविष्य के विभिन्न बायोमटेरियल अनुप्रयोगों के लिए एक आदर्श उपास्थि ऊतक निर्माण बनातीहै।

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Protocol

1. जेबीएनटीएस का संश्लेषण

  1. पहले प्रकाशित तरीकों का उपयोग करके जेबीएनटी मोनोमर तैयार करें, जिसमें विभिन्न प्रकार के यौगिकों का संश्लेषण शामिलहै।
  2. रिवर्स-फेज कॉलम का उपयोग करके उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) के साथ संश्लेषित होने के बाद कच्चे जेबीएनटी मोनोमर को शुद्ध करें। विलायक ए का उपयोग करें: 100% पानी, विलायक बी: 100% एसिटोनिट्राइल, और विलायक सी: पीएच = 1 के साथ एचसीएल पानी का समाधान। 3 एमएल / मिनट की प्रवाह दर का उपयोग करें। 7.2 मिनट पर एचपीएलसी में प्राप्त सबसे बड़ी चोटी एकत्र करें।

2. जेबीएनटी /मैटन 1 / टीजीएफ-ए 1 के लिए निर्माण (वीडियो 1)

नोट: वीडियो 1 से पता चलता है कि जेबीएनएम एक शारीरिक वातावरण (पानी का समाधान, कोई यूवी प्रकाश, कोई रासायनिक योजक, और कोई हीटिंग) में गठित एक इंजेक्शन ठोस है, जो जैविक रूप से भी प्रेरित है।

  1. इन प्रोटीनों के उचित मिश्रण को सुनिश्चित करने के लिए एच 2 ओ में निलंबित 1 मिलीग्राम / एमएल टीजीएफ -1 के 8 μL को H2O में निलंबित 1 mg / mL मैट्रिलिन -3 के32μL जोड़ें।
  2. TGF-1/matrilin-3 घोल मेंH2Oमें निलंबित 1 mg/mL JBNts का 80 μL जोड़ें। उचित सम्मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए पिपेट बार-बार। जेबीएनटीएस को जोड़ने के तुरंत बाद सफेद फ्लोक्यूल्स की उपस्थिति देखी जा सकती है, जो जेबीएनएम (वीडियो 1) के गठन का संकेत देती है।

3. पराबैंगनी-दृश्यमान (यूवी-विस) अवशोषण के साथ नमूनों का अवलोकन

नोट: जेबीएनएम की असेंबली को चिह्नित करने के लिए यूवी-विस अवशोषण स्पेक्ट्रा का अध्ययन किया गया था। इस माप का विश्लेषण चार श्रेणियों के लिए किया गया था: अकेले जेबीएनटीएस, अकेले मैट्रिलिन -3, अकेले टीजीएफ-ए 1, और पूर्ण परत-दर-परत जेबीएनएम, जिसमें सभी तीन भाग शामिल थे। सभी प्रारंभिक सांद्रता एच2ओ में निलंबित हैं।

  1. जेबीएनटी समूह के लिए, 90.9 μg/mL घोल बनाने के लिए H2O के 50 μL में 1 mg/mL JBNts का 5 μL जोड़ें।
  2. मैट्रिलिन -3 समूह के लिए, 7.3 μg / mL घोल बनाने के लिए H2O के 15 μL में 10 μg / mL मैट्रिलिन -3 का 40 μL जोड़ें।
  3. TGF-a1 समूह के लिए, 1.8 μg/mL घोल बनाने के लिए H2O के 45 μL में 10 μl का 10 μL जोड़ें।
  4. जेबीएनएम समूह के लिए, 10 μg/mL matrilin-3 का 40 μL से 10 μg/mL TGF-1 जोड़ें। उचित मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए आंदोलन करें, और फिर घोल में 1 मिलीग्राम / एमएल जेबीएनटी के 5 μL जोड़ें, नमूने को मिश्रण करने के लिए बार-बार पाइप करें।
  5. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके, प्रत्येक समूह के अवशोषण स्पेक्ट्रम को मापें।

4. नमूनों का जेटा-संभावित माप

नोट: जेटा-क्षमता का विश्लेषण बेहतर अनुमान लगाने के लिए किया गया था कि विवो ऊतक में जेबीएनएम कैसे बातचीत करेगा। तीन समूहों को मापा गया: अकेले मैट्रिलिन -3, टीजीएफ -1 के साथ मैट्रिलिन -3, और पूर्ण परत-दर-परत जेबीएनएम।

  1. मैट्रिलिन -3 समूह के लिए, 800 μL समाधान बनाने के लिए H2O के 640 μL में 10 mg / mL मैट्रिलिन -3 का 160 μL जोड़ें।
  2. मैट्रिलिन-3/टीजीएफ-ए1 यौगिक के लिए, 10 μg/mL मैट्रिलिन-3 के 160 μL को 10 μg/mL TGF-a1 के 40 μL में जोड़ें। उचित एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए पिपेट बार-बार। फिर, इसेH2O के 600 μL में जोड़ें जिसके परिणामस्वरूप 800 μL समाधान होता है।
  3. JBNm समूह के लिए, 10 μg/mL मैट्रिलिन-3 के 160 μL को 10 μg/mL TGF-a1 के 40 μL जोड़ें। प्रोटीन को मिलाने के लिए पिपेट कई बार। फिर, समरूपता सुनिश्चित करने के लिए समाधान और पिपेट में 1 मिलीग्राम / एमएल जेबीएनटी के 20 μL जोड़ें। अंत में, 800 μL समाधान का उत्पादन करने के लिए H2O के 580 μL में जेबीएनएम समाधान जोड़ें।
  4. तीन समूहों के लिए ज़ेटा-संभावित मूल्यों को मापें।

5. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) के लिए जेबीएनटी/मैट्रिलिन-3 नैनो-मैट्रिक्स की तैयारी

नोट: जेबीएनटीएस और जेबीएनएम की आकृति विज्ञान को चिह्नित करने के लिए टीईएम लक्षण वर्णन किया जाता है।

  1. प्रकाशित प्रोटोकॉल और निर्माता के प्रोटोकॉल12 के अनुसार जेबीएनटीएस और जेबीएनएम के नकारात्मक धुंधला होने से पहले ग्रिड को ठीक से साफ करने के लिए प्लाज्मा क्लीनर में दो ग्रिड डालें।
  2. 1 mg/mL JBNts के 10 μL को 40 μL आसुत जल के साथ मिलाकर 200 μg/mL JBNt घोल बनाएं।
  3. 100 μg/mL मैट्रिलिन-3 के 30 μL को 100 μg/mL TGF-1 के 20 μL के साथ कई बार मिलाएं। जेबीएनएम नमूना तैयार करने के लिए मैट्रिलिन -3 / टीजीएफ -ए 1 मिश्रण में 1 मिलीग्राम / एमएल जेबीएनटी का 10 μL जोड़ें। फिर, पिपेट बार-बार।
  4. अलग-अलग ग्रिड पर जेबीएनटी समाधान के 3 μL (200 μg / mL) और JBNm समाधान के 3 μL जोड़ें, और उन्हें 2 मिनट के लिए छोड़ दें।
  5. प्रत्येक ग्रिड को 100 μL uranyl एसीटेट समाधान (0.5%) के साथ धोएं। अतिरिक्त समाधान को हटाने के लिए फ़िल्टर पेपर का उपयोग करें और ग्रिड को हवा में सूखने दें।
  6. नमूनों को ठीक से देखने और चिह्नित करने के लिए एक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप संचालित करें, जैसा कि पहलेप्रकाशित 11,12 है।

6. फ्लोरोसेंट-लेबल प्रोटीन का अवशोषण स्पेक्ट्रा माप

नोट: अवशोषण वर्णक्रमीय विश्लेषण के साथ जेबीएनएम की संरचनाओं को देखकर जेबीएनएम की संरचना को सत्यापित किया जाता है।

  1. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए प्रोटीन लेबलिंग किट का उपयोग करके टीजीएफ-ए 1 को लेबल करें। 8.9 μg/mL परीक्षण समाधान बनाने के लिए H 2 O के 25 μL लेबल TGF-a1 से20μL जोड़ें।
  2. एक अलग लेबलिंग किट का उपयोग करके मैट्रिलिन -3 को लेबल करें। 36 μg/mL परीक्षण समाधान बनाने के लिए मैट्रिलिन-3 से H2O के 25 μL लेबल वाले 80 μg/mL का20μL जोड़ें।
    नोट: टीजीएफ-ए 1 के फ्लोरोसेंट डाई लेबलिंग के परिणामस्वरूप 20 μg / mL की अंतिम एकाग्रता हुई, जबकि मैट्रिलिन -3 की लेबलिंग के परिणामस्वरूप 80 μg / mL की अंतिम एकाग्रता हुई।
  3. 80 μg/mL लेबल वाले मैट्रिलिन-3 के 20 μL को 20 μl लेबल TGF-11और H2Oके 5 μL लेबल के साथ मिलाएं, जिसके परिणामस्वरूप एक लेबल TGF-1/matrilin-3 यौगिक बनता है। मिश्रण को मिश्रण करने के लिए कई बार पाइप करें।
  4. H2 O के 40 μL में 1 mg/mL JBNts का 5 μL जोड़ें, जिसके परिणामस्वरूप 111 μg/mL घोल बनता है।
  5. 20 μg/mL लेबल TGF-1 से 20 μL लेबल वाले 80 μg/mL लेबल वाले मैट्रिलिन-3 और पिपेट को कई बार जोड़ें। लेबल किए गए TGF-1/matrilin-3 घोल में 1 mg/mL JBNts का 5° L जोड़ें, और यौगिक को ठीक से मिलाने के लिए बार-बार पिपेट जोड़ें।
    नोट: जेबीएनटी की अंतिम सांद्रता, जिसे टीजीएफ-ए 1 लेबल किया गया था, और मैट्रिलिन -3 नमूने क्रमशः 111 μg / mL, 8.9 μg / mL, और 36 μg / mL थे।
  6. प्रत्येक नमूना समूह (यानी, लेबल TGF-1 (चरण 6.1), लेबल मैट्रिलिन -3 (चरण 6.2), लेबल TGF-a1/matrilin-3 (चरण 6.3), JBNts (चरण 6.4), JBNM (चरण 6.5)) को काले 384-वेल प्लेट के अपने कुएं में स्थानांतरित करें।
  7. ब्लैक 384-वेल प्लेट को मल्टी-मोड माइक्रोप्लेट रीडर में लोड करें और निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए 488 एनएम और 555 एनएम के उत्तेजना तरंग दैर्ध्य पर माप लें।

7. इन विट्रो जैविक कार्य परख

  1. पूर्व-लेपित कवरग्लास कक्षों पर सेल आसंजन परीक्षण
    1. नमूने के पांच समूहों के साथ दो कक्षीय कवरग्लास तैयार करें, क्योंकि प्रत्येक सेल प्रकार के लिए एक कवरग्लास का उपयोग किया जाता है।
    2. 198.75 μL आसुत जल में 1 mg/mL JBNts का 1.25 μL जोड़ें, जिसके परिणामस्वरूप 6.25 μg/mL घोल बनता है।
    3. 10 μg/mL मैट्रिलिन-3 का 10 μL और 190 μL आसुत जल जोड़ें, जिसके परिणामस्वरूप 0.5 μg/mLsolution होता है।
    4. 197.5 μg/mL आसुत जल के 2.5 μL को 10 μg/mL TGF-a1 जोड़ें, जिसके परिणामस्वरूप 0.125 μg/mLsolution होता है।
    5. जेबीएनएम समूह के लिए, 10 μg/mL मैट्रिलिन-3 के 10 μL को 10 μg/mLTGF-a1 के 2.5 μL में जोड़ें और पिपेट को बार-बार जोड़ें। मिश्रण के घोल और पिपेट में 1 mg/mL की सांद्रता के साथ 1.25 μL JBNt जोड़ें। अंत में, 200 μL JBNm समाधान के परिणामस्वरूप 186.25 μL आसुत जल जोड़ें।
      1. नियंत्रण समूह के लिए, आसुत जल के 200 μL का उपयोग करें।
    6. प्रत्येक नमूना समूह को नंबर 1.5 कक्षित कवरग्लास के अपने कुएं में जोड़ें। कवरग्लास को 1 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें, और फिर इसे लियोफिलाइज़र उपकरण के साथ फ्रीज-सुखाएं।
    7. तैयार कक्षित कवरग्लास के प्रत्येक कुएं में बीज मानव मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एचएमएससी) और मानव चोंड्रोसाइट्स कोशिकाएं (10,000 कोशिकाएं प्रति कुएं)।
    8. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 4 घंटे के लिए दो कवर ग्लास को इनक्यूबेट करें। फिर, सेल कल्चर माध्यम को एस्पिरेट करें और पीबीएस के साथ दो बार कुल्ला करें।
    9. 5 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ कोशिकाओं को ठीक करें, और फिर पीबीएस के साथ नमूने निकालें और कुल्ला करें। 4% पैराफॉर्मलडिहाइड को पूरी तरह से हटाने के लिए नमूने को दूसरी बार धोएं।
    10. 10 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटन-एक्स के 100 μL के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें और पीबीएस के साथ धोएं। प्रत्येक कुएं में 0.165 μM Rhodamine-phalloidin का 100 μL जोड़ें। 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें और फिर पीबीएस के साथ फिर से धो लें।
    11. नाभिक को दागने के लिए प्रत्येक कुएं में 0.1 μg / mL DAPI जोड़ें। 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें और पीबीएस के साथ कुओं को दो बार धोएं।
    12. सेल आकृति विज्ञान का निरीक्षण करने और फ्लोरोसेंट छवियों को पकड़ने के लिए वर्णक्रमीय कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
    13. इसके अलावा, छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सेल संख्या और आकृति विज्ञान का विश्लेषण करें। सॉफ़्टवेयर खोलें और छवियों को लोड करें। स्केल बार जोड़ें और सॉफ़्टवेयर को कैलिब्रेट करें। प्रत्येक नमूने के लिए किसी दिए गए क्षेत्र में कोशिकाओं की संख्या की गणना करें। फिर, प्रत्येक नमूने के लिए सेल आकृति विज्ञान पर डेटा एकत्र करने के लिए मापने वाले उपकरण का उपयोग करें।
  2. सेल प्रसार
    1. तीन अनुपचारित 96-वेल प्लेटें तैयार करें, प्रत्येक में नमूने के पांच समूह जोड़ें।
      1. जेबीएनटी समूह के लिए, 596.25 μL आसुत जल में 1 mg/mL JBNts का 3.75 μL जोड़ें, जिसके परिणामस्वरूप 6.25 μg/mL की सांद्रता के साथ 600 μL JBNt घोल होता है।
      2. TGF-a1 समूह के लिए, आसुत जल के 592.5 μL में 10 μg/mL TGF-a1 का 7.5 μL जोड़ें, जिसके परिणामस्वरूप 0.125 μg/mL परीक्षण समाधान होता है।
      3. मैट्रिलिन -3 समूह के लिए, आसुत जल के 570 μL में 10 μg / mL मैट्रिलिन -3 का 30 μL जोड़ें, जिसके परिणामस्वरूप 0.5 μg / mL परीक्षण समाधान होता है।
      4. जेबीएनएम समूह के लिए, 10 μg/mL TGF-a1 के 7.5 μL को 10 μg/mL मैट्रिलिन-3 के 30 μL के साथ कई बार मिलाएं, इसके बाद घोल में 1 mg/mL JBNts का 3.75 μL जोड़ें।
      5. जेबीएनटी, टीजीएफ-ए1 और मैट्रिलिन -3 नमूनों के लिए क्रमशः 6.25 μg/mL, 0.125 μg/mL, और 0.5 μg/mL की अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए 558.75 μL आसुत जल के साथ JBNm घोल को पतला करें।
      6. नियंत्रण समूह के लिए, आसुत जल के 600 μL का उपयोग करें।
    2. प्रत्येक नमूना समूह को छह कुओं में विभाजित करें (प्रति कुएं 100 μL नमूना)।
    3. सभी नमूनों वाले तीन प्लेटों को 1 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें और फिर लियोफिलाइजिंग उपकरण के साथ फ्रीज-ड्राई करें।
    4. इन प्लेटों पर बीज एचएमएससी, प्रत्येक को 5,000 कोशिकाओं से युक्त 100 μL सेल निलंबन (प्रति कुआं) प्राप्त होता है। तीन प्लेटों को 1 दिन, 3 दिन या 5 दिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
    5. कोशिकाओं के साथ प्रत्येक कुएं में सीसीके -8 समाधान का 10 μL जोड़ें और अगले 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    6. 450 एनएम पर मल्टी-मोड माइक्रोप्लेट रीडर के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से अवशोषण मूल्यों को मापें।
    7. 96-वेल प्लेट पर एचएमएससी की एक ज्ञात ढाल बीज लें और 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं की ज्ञात संख्या के अवशोषण मूल्यों को मापने और एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए सीसीके -8 परख का उपयोग करें।
    8. अवशोषण मानक वक्र का उपयोग करके सेल प्रसार की गणना करें।
  3. स्थिरता परीक्षण
    नोट: एक मानव टीजीएफ-ए1 लक्षित एलिसा किट का उपयोग एक अगारोस हाइड्रोगेल में जेबीएनएम से टीजीएफ-ए 1 की रिहाई के प्रतिशत को निर्धारित करने के लिए किया गया था।
    1. 20 मिलीलीटर पीबीएस में 400 मिलीग्राम अगारोस पाउडर डालकर और अगारोस पाउडर को पूरी तरह से भंग करने के लिए इसे 100 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करके 2% अगारोस तैयार करें।
    2. ठंडा 2% अगारोस हाइड्रोगेल के अंदर जेबीएनएम तैयार करें।
      1. 10 μg/mL TGF-1 के 10 μL, 10 μg/mL मैट्रिलिन-3 के 40 μL, 1 mg/mL JBNts के 5 μL और PBS के 195 μL को मिलाएं। इस घोल को 2% अगारोस के 250 μL के साथ मिलाएं, जिससे जेबीएनएम हाइड्रोगेल बनता है।
    3. पीबीएस के 500 μL जोड़ें, इसे रिलीज समाधान के रूप में उपयोग करें, और इसे हर 3 दिनों में बदलना सुनिश्चित करें। प्रत्येक जारी समाधान रखें, और नमूने को 15 दिनों तक बैठने दें।
    4. निर्माता के निर्देशों का पालन करके, कैप्चर किए गए प्रत्येक रिलीज समाधान का परीक्षण करने के लिए एक एलिसा किट का उपयोग करें।
      नोट: पीबीएस में जारी टीजीएफ-ए 1 की मात्रा को 100% के सैद्धांतिक लोडिंग मूल्य से घटाकर, टीजीएफ-ए 1 की शेष राशि निर्धारित की जा सकती है।
  4. पीसीआर26 के साथ सेल भेदभाव विश्लेषण।
    1. प्रत्येक नमूने के साथ नमूनों के सात समूह तैयार करें, जिसमें सेल निलंबन के 20 μL (4 x 104 कोशिकाएं), विशिष्ट समाधान के 30 μL (या पीबीएस, नमूना समूह के आधार पर), और 2 wt % agarose के 50 μL शामिल हैं।
      1. TGF-a1 समूह के लिए, 10 μg/mL TGF-a1 का 5 μL PBS के 25 μL में जोड़ें, जिसके परिणामस्वरूप 1.6 μg/mL समाधान होता है।
      2. मैट्रिलिन -3 समूह के लिए, पीबीएस के 10 μL में 10 μg / mL मैट्रिलिन -3 का 20 μL जोड़ें, जिसके परिणामस्वरूप 6.7 μg / mL समाधान होता है।
      3. जेबीएनटी समूह के लिए, पीबीएस के 27.5 μL में 1 mg/mL JBNts का 2.5 μL जोड़ें, जिसके परिणामस्वरूप 83.3 μg/ mL समाधान होता है।
      4. J/T/M JBNm समूह के लिए, घोल को मिलाने के लिए 10 μg/mL मैट्रिलिन-3 से 5 μL 10 μg/mL TGF-a1 के 5 μL जोड़ें और पिपेट को ऊपर और नीचे जोड़ें। फिर, 1 mg/mL JBNts और पिपेट के 2.5 μL को फिर से जोड़ें। अंत में, पीबीएस के 2.5 μL के साथ पतला करें।
      5. प्रत्येक नियंत्रण समूह के लिए, नमूने के रूप में पीबीएस के 30 μL का उपयोग करें।
    2. प्रत्येक कुएं में 0.5 एमएल सेल कल्चर माध्यम जोड़ें, इसे हर 3 दिनों में बदलना सुनिश्चित करें।
      1. सकारात्मक नियंत्रण समूह के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एचएमएससी चोंड्रोजेनिक माध्यम का उपयोग करें जिसमें टीजीएफ-ए 1 जोड़ा गया है। यह अतिरिक्त TGF-1 TGF-1 और J/T/M JBNm दोनों समूहों की राशि के बराबर है।
      2. नकारात्मक नियंत्रण समूहों में से एक के लिए, एक वाणिज्यिक एचएमएससी चोंड्रोजेनिक माध्यम का उपयोग करें जिसमें टीजीएफ-ए 1 नहीं है। अन्य नकारात्मक नियंत्रण समूह के लिए, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) युक्त डीएमईएम सेल कल्चर माध्यम का उपयोग करें।
      3. हर दूसरे समूह के लिए, टीजीएफ-ए1 के बिना एक वाणिज्यिक एचएमएससी चोंड्रोजेनिक सेल कल्चर माध्यम का उपयोग करें।
    3. 15 दिनों के लिए नमूने की संस्कृति करें।
    4. नमूने के आरएनए को निकालें और पहले वर्णितनमूनों के भेदभाव का अध्ययन करने के लिए पीसीआर करें।
  5. टाइप एक्स कोलेजन अभिव्यक्ति परख के लिए इम्यूनोस्टेनिंग
    1. पीसीआर विधि अनुभाग (चरण 7.4) के साथ सेल भेदभाव के समान ही सात एगारोस-आधारित नमूने तैयार करें।
    2. 15 दिनों के लिए नमूने की संस्कृति करें।
    3. नमूने को 1 दिन के लिए 4% फॉर्मलाडेहाइड के साथ ठीक करें, रात भर 30% सुक्रोज समाधान में भिगोएं, और फिर तरल नाइट्रोजन के साथ -80 डिग्री सेल्सियस पर रात भर फ्रीज करें। इष्टतम काटने के तापमान यौगिक अभिकर्मक (ओसीटी) का उपयोग करके नमूने को ठीक करें, पानी में घुलनशील ग्लाइकोल्स और रेजिन का मिश्रण, -10 डिग्री सेल्सियस पर।
    4. प्रत्येक नमूने के 20 μm मोटी जमे हुए खंडों को प्राप्त करने के लिए एक क्रायोस्टेट माइक्रोटोम संचालित करें।
    5. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, प्रत्येक खंड को 1:800 कमजोर पड़ने के साथ एंटी-कोलेजन एक्स एंटीबॉडी और पीबीएस के साथ पतला एक फ्लोरोसेंट लेबलिंग द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ दाग दें।
    6. 488 एनएम की उत्तेजना और आंखों के टुकड़े पर 40x के आवर्धन का उपयोग करके, एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ प्रत्येक खंड का निरीक्षण करें।

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Representative Results

प्रोटोकॉल के बाद, जेबीएनटीएस को सफलतापूर्वक संश्लेषित किया गया और यूवी-विस अवशोषण और टीईएम के साथ विशेषता दी गई। जेबीएनएम एक इंजेक्टेबल ठोस पाड़ है जो तेजी से बायोमिमेटिक प्रक्रिया से गुजरता है। शारीरिक वातावरण में TGF-1/matrilin-3 समाधान के मिश्रण में JBNTs को जोड़ने के बाद, एक ठोस सफेद-जाल मचान का गठन किया गया था, जो JBNm की सफल असेंबली को दर्शाता है, जैसा कि चित्र 1 में देखा गया है। यह लक्षण वर्णन विधियों में प्रदर्शित किया गया था।

शारीरिक परिस्थितियों में, मैट्रिलिन -3 को इसके आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु27 (चित्रा 2 ए) के कारण नकारात्मक रूप से चार्ज किया जाता है। मैट्रिलिन -3 समाधान में टीजीएफ-ए 1 समाधान को जोड़ने के बाद, टीजीएफ-1 / मैट्रिलिन -3 यौगिक की जेटा-क्षमता लगभग तटस्थ मूल्य तक बढ़ गई, यह दर्शाता है कि दो प्रोटीन चार्ज इंटरैक्शन के माध्यम से बंधे थे। जैसा कि चित्रा 2 ए में देखा गया है, जेबीएनटीएस के कारण जेबीएनएम की जेटा-क्षमता तीन समूहों में सबसे अधिक है, क्योंकि लाइसिन साइड चेन का आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु एक शारीरिक वातावरण में लगभग 9.74 है। जेबीएनएम के जेटा-संभावित मूल्यों में वृद्धि इसकी परत-दर-परत संरचना की सफल असेंबली को इंगित करती है।

यूवी-विस अवशोषण स्पेक्ट्रा (चित्रा 2 बी) जेबीएनएम की पदानुक्रमित परत-दर-परत आंतरिक संरचना के गठन को स्पष्ट करता है। लाइसिन साइड चेन और जेबीएनटीएस के सुगंधित छल्ले ने क्रमशः 220 एनएम और 280 एनएम पर दो अवशोषण चोटियों में योगदान दिया। अवशोषण मूल्य में कमी टीजीएफ-ए 1 के अतिरिक्त के बाद देखी गई थी, यह दर्शाता है कि टीजीएफ-ए 1 और जेबीएनटीएस के बीच बंधन होता है। मैट्रिलिन -3 में जेबीएन के जुड़ने के बाद, चोटियों की अवशोषण तीव्रता में अधिक स्पष्ट कमी देखी गई, जो एक बार फिर मैट्रिलिन -3 और जेबीएन के बीच सफल बंधन का संकेत देती है। इसी तरह, TGF-1/matrilin-3 के मिश्रण में JBNTs को जोड़ने के बाद, JBNm का गठन किया गया था, और अवशोषण की चोटियों में तीव्रता में कमी आई थी। जेबीएनएम का अवशोषण शिखर टीजीएफ-1/जेबीएनटीएस लाइन की तुलना में मैट्रिलिन -3 / जेबीएनटीएस लाइन के करीब है, यह दर्शाता है कि जेबीएनटी मैट्रिलिन -3 से बांधना पसंद करते हैं, जिससे मैट्रिलिन -3 के साथ परत-दर-परत बाहरी संरचना बनती है जबकि टीजीएफ -ए 1 आंतरिक परत में रहता है। टीईएम का उपयोग जेबीएनटीएस और जेबीएनएम (चित्रा 2 सी) की आकृति विज्ञान को चिह्नित करने के लिए किया जाता है। प्रोटीन के साथ संयोजन के बाद, जेबीएनएम के मोटे बंडलों को एक मचान संरचना बनाते हुए देखा गया।

फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी ने परत-दर-परत संरचना (चित्रा 3 ए) की उपस्थिति की पुष्टि की है और जेबीएनएम के क्रॉस-सेक्शन का प्रदर्शन किया है। टीजीएफ-ए1 और मैट्रिलिन-3 लेबल करने के बाद, यह देखा गया कि लाल फ्लोरोसेंट मैट्रिलिन -3 जेबीएनटी बंडलों को ढंकता है, जिससे जेबीएनएम की बाहरी परत बनती है। चित्रा 3 बी में, हरे-फ्लोरोसेंट टीजीएफ-ए 1 ने एक आंतरिक परत का गठन किया, जो विकास कारकों को संग्रहीत करने की क्षमता में योगदान देता है और टीजीएफ-ए 1 के स्थानीयकरण की अनुमति देता है। चित्रा 3 सी फ्लोरोसेंट डाई-लेबल प्रोटीन के बीच फ्लोरेसेंस अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (फ्रेट) प्रक्रिया को प्रदर्शित करता है, जैसा कि फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रा की विशेषता है, जिसमें क्रमशः लेबल टीजीएफ-ए 1 और मैट्रिलिन -3 समूहों के लिए520 एनएम और 570 एनएम पर उत्सर्जन शिखर हैं। प्रोटोकॉल के अनुसार जेबीएनटीएस को जोड़ने के बाद, परत-दर-परत संरचना बनती है; जेबीएनएम समूह के लिए 520 एनएम और 570 एनएम दोनों पर चोटियां देखी गईं, जो प्रोटीन और जेबीएनटी के सफल बंधन और संयोजन का संकेत देती हैं।

इसके अतिरिक्त, एचएमएससी आसंजन और सेल प्रसार पर जेबीएनएम के प्रभाव का पता लगाया गया था। जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है, कक्षित कवरग्लास की सतह पर लेपित जेबीएनएम का सेल आसंजन घनत्व निर्धारित किया गया था। जेबीएनएम ने एचएमएससी को अपने साथ क्लस्टर दिखाया (चित्रा 4 ए), जबकि कम कोशिकाओं ने जेबीएनटी का पालन किया। हालांकि, अन्य समूहों के लिए, जेबीएनएम समूह की तुलना में एचएमएससी को संरेखण के बिना समान रूप से वितरित किया गया था। कोशिकाओं के संरेखण, साथ ही जेबीएनएम पर कोशिकाओं के आकार ने प्रदर्शित किया कि जेबीएनटीएस ने सेल आसंजन में भूमिका निभाई, जबकि जेबीएनएम में प्रोटीन ने सेल आसंजन (चित्रा 4 बी, सी) की आत्मीयता में वृद्धि की।

सेल कल्चर के पहले दिन के बाद जेबीएनएम, जेबीएनटीएस, मैट्रिलिन -3, अकेले टीजीएफ -1, और नकारात्मक नियंत्रण, जेबीएनएम और टीजीएफ-ए 1 समूहों ने अन्य समूहों की तुलना में महत्वपूर्ण सेल प्रसार दिखाया। जब सेल कल्चर अवधि को 3 और 5 दिनों तक बढ़ा दिया गया था, तो जेबीएनएम और टीजीएफ-ए 1 समूहों ने और भी अधिक बढ़े हुए सेल प्रसार का प्रदर्शन किया, जैसा कि चित्र 5 में देखा गया है। जेबीएनएम के साथ और जेबीएनएम (नकारात्मक नियंत्रण) के बिना एचएमएससी के भेदभाव को निर्धारित करने के लिए एक दीर्घकालिक कार्य अध्ययन किया गया था। 15 दिनों के बाद, एक बढ़ा हुआ एल्सियन नीला दाग देखा गया, जो जेबीएनएम26 के साथ बढ़ रहे एचएमएससी के चोंड्रोजेनेसिस का संकेत देता है। इस प्रकार, कोशिकाओं ने जेबीएनएम के जेबीएन को प्राथमिकता दी। यह संभवतः इसकी डीएनए-नकल संरचना और छोटे-अणु इकाइयों में अलग होने की क्षमता के कारण था, जिनमें से उत्तरार्द्ध को कम पीएच या पर्याप्त एंजाइमेटिक गतिविधि (जैसे कोशिकाओं द्वारा उत्थान) 14,29 द्वारा ट्रिगर किया जा सकता है।

वीडियो 1: जेबीएनएम असेंबली की वीडियो रिकॉर्डिंग। यह रिकॉर्डिंग जेबीएनएमएस, मैट्रिलिन -3, और टीजीएफ -1 के गठन को जेबीएनएम में दर्शाती है। इस आंकड़े को झोउ एट अल (2021)26 से संशोधित किया गया है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 1
चित्र 1: JBNts, J/T/M JBNm और J/T/M JBNm की चोंड्रोजेनिक क्षमता की रासायनिक संरचना का योजनाबद्ध चित्रण। (A) JBNts की रासायनिक संरचना, मोनोमर से रोसेट रिंग से JBNT तक उनके गठन को उजागर करती है। (B) J/T/M JBNM बनाने वाले घटक, साथ ही साथ वे JBNm में कैसे इकट्ठा होते हैं। जे /टी / एम जेबीएनएम पर मानव मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं की खेती का योजनाबद्ध। इस आंकड़े को झोउ एट अल (2021)26 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
(ए) अकेले मैट्रिलिन -3 के जेटा-संभावित स्पेक्ट्रा, टीजीएफ-1/मैट्रिलिन -3 यौगिक, और जे/टी/एम जेबीएनएम का भौतिक लक्षण वर्णन( बी) अकेले जेबीएनटीएस के यूवी-विस अवशोषण स्पेक्ट्रा, अकेले मैट्रिलिन -3, टीजीएफ -1, अकेले टीजीएफ -3 / ) अकेले जेबीएनटीएस और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) से प्राप्त जे / टी / एम जेबीएनएम की छवियां। इस आंकड़े को झोउ एट अल (2021)26 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: जे/टी/एम जेबीएनएम के फ्लोरोसेंट कॉन्फोकल इमेजिंग और फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रा (ए) जे/टी/एम जेबीएनएम की 3डी कॉन्फोकल छवि, जिसमें लाल-फ्लोरोसेंट-लेबल मैट्रिलिन-3 और ग्रीन-फ्लोरोसेंट-लेबल टीजीएफ-ए1 है। (बी) लाल फ्लोरोसेंट-लेबल मैट्रिलिन -3, हरे-फ्लोरोसेंट-लेबल टीजीएफ-ए 1, और एक विलय संस्करण के साथ जे / टी / एम जेबीएनएम की 2 डी कॉन्फोकल छवियां। (सी) लेबल प्रोटीन के बीच फ्रेट प्रक्रिया को चिह्नित करने के लिए विभिन्न यौगिकों के प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा। इस आंकड़े को झोउ एट अल (2021)26 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: मानव मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एचएमएससी) संस्कृति का विश्लेषण। (ए) टीजीएफ-1, मैट्रिलिन -3, और जेबीएनटीएस के साथ एचएमएससी की ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी छवियां, एक अगारोस जेल पर सुसंस्कृत। (ख) विभिन्न प्रकार के जेबीएनएम घटकों के साथ लेपित चैम्बर्ड कवर ग्लास पर संवर्धित एचएमएससी की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियां। (सी) प्रत्येक समूह के लिए प्रति वर्ग मिलीमीटर का पालन की गई कोशिकाओं की संख्या का ग्राफ। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन को निरूपित करती हैं. (d) प्रति समूह में μm में सेल प्रमुख अक्ष लंबाई का ग्राफ। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन को निरूपित करती हैं. नोट: N ≥ 3, *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001, ****P< 0.0001 (नकारात्मक नियंत्रण, NC के खिलाफ तुलना में)। इस आंकड़े को झोउ एट अल (2021)26 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: दिन 1, 3 और 5 के बीच विभिन्न समूहों के लिए सेल संख्याओं की तुलना। 1, 3 और 5 दिनों में विभिन्न सामग्रियों के साथ संवर्धित होने के बाद एचएमएससी के सेल नंबर आंकड़े। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन को निरूपित करती हैं. नोट: N = 6, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. इस आंकड़े को झोउ एट अल (2021)26 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस अध्ययन का लक्ष्य पारंपरिक ऊतक निर्माणों की सीमाओं को दूर करने के लिए एक बायोमिमेटिक पाड़ मंच, जेबीएनएम विकसित करना है जो सेल भेदभाव को मध्यस्थ करने के लिए सेल कल्चर वातावरण पर भरोसा करते हैं। जेबीएनएम एक स्व-टिकाऊ उपास्थि ऊतक निर्माण के लिए एक परत-दर-परत संरचना मचान है। अभिनव डिजाइन नए डीएनए-प्रेरित नैनोमैटेरियल्स, जेबीएनटीएस पर आधारित है। जेबीएनटीएस30, टीजीएफ-ए1 और मैट्रिलिन-3 से बना जेबीएनएम, एक नई परत-दर-परत तकनीक के माध्यम से इकट्ठा किया जाता है जहां पाड़ की स्व-असेंबली को आणविक स्तर पर नियंत्रित किया जाता था। जेबीएनएम की असेंबली को देखा गया और जेटा-संभावित माप, यूवी-विस अवशोषण, टीईएम और प्रतिदीप्ति वर्णक्रमीय विश्लेषण के साथ विशेषता दी गई।

चित्रा 2 बी (चरण 3) में यूवी-विस स्पेक्ट्रा ने जेबीएनएम के पदानुक्रमित परत-दर-परत इंटीरियर के गठन का प्रदर्शन किया है। बाध्यकारी आत्मीयता में अंतर के कारण अवशोषण चोटियों में अंतर देखा जा सकता है। जेबीएनटीएस और टीजीएफ -1 के बीच की तुलना में जेबीएनटीएस और मैट्रिलिन -3 के बीच अधिक प्रमुख बातचीत होती है, यह दर्शाता है कि जेबीएनटीएस अपने रेशेदार आकृति विज्ञान और लाइसिन सतह रसायन विज्ञान के संदर्भ में कोलेजन प्रोटीन की नकल करते हैं। यह तकनीक TGF-1 के बजाय मैट्रिलिन -3 के लिए जेबीएनटीएस के बंधन का निरीक्षण करने के लिए आवश्यक है, जिससे TGF-a1 के एनकैप्सुलेशन की अनुमति मिलती है और इसलिए आसपास के ऊतक में TGF-1 की धीमी रिहाई प्रदान होती है। जेबीएनएम के विकास में सबसे महत्वपूर्ण कदम जेबीएनटीएस के साथ प्रोटीन का संयोजन है। लेबल किए गए मैट्रिलिन -3 और टीजीएफ -1 के बीच फ्रेट घटना के पूर्ण प्रभाव का निरीक्षण करने के लिए जेबीएनटीएस को जोड़ने से पहले टीजीएफ-ए 1 और मैट्रिलिन -3 को जोड़ा जाना चाहिए। इस तकनीक की सीमा प्रोटीन और नैनोट्यूब के गलत जोड़ अनुक्रम से उपजी है, जिसके परिणामस्वरूप विभिन्न माप होते हैं। यह भविष्य के अध्ययनों के लिए जेबीएनएम के गठन के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है, और इसलिए, भविष्य के जेबीएनएम निर्माण और अध्ययनों पर लागू किया जाएगा।

मैट्रिलिन -3 एक अत्यधिक नकारात्मक प्रोटीन है, जबकि टीजीएफ-ए 1 थोड़ा तटस्थ प्रोटीन है, जैसा कि चित्रा 2 ए में देखा गया है। इन प्रोटीनों के बंधन को निर्धारित करने के लिए चार्ज अंतर देखा गया था। मैट्रिलिन -3 की नकारात्मक रूप से आवेशित स्थिति से, टीजीएफ-ए 1 (चित्रा 2 ए) के जुड़ने के बाद ज़ेटा-क्षमता लगभग तटस्थ मूल्य तक बढ़ गई। यह कदम बायोमिमेटिक पाड़ की पहली आंतरिक परत को निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है, और यह इंगित करने के लिए कि दोनों प्रोटीनों का संयोजन चार्ज इंटरैक्शन के माध्यम से है। जेबीएनटीएस के अतिरिक्त, जो जेबीएनएम निर्माण का दूसरा चरण है, जेबीएनएम की जेटा-क्षमता ~ 10 ± 5 एमवी (चित्रा 2 ए) पर मापा गया था। चूंकि जेबीएनटी अत्यधिक सकारात्मक हैं, जेबीएनएम का चार्ज उम्मीद के अनुसार बढ़ता हुआ देखा गया था। इस प्रकार चार्ज इंटरैक्शन के माध्यम से जेबीएनएम के गठन का निरीक्षण करने के लिए जेटा-क्षमता के साथ चार्ज का निर्धारण महत्वपूर्ण है। यूवी-विस स्पेक्ट्रोस्कोपी के समान, इस चरण में जोड़ का अनुक्रम महत्वपूर्ण है, और गलत अतिरिक्त क्रम के परिणामस्वरूप विभिन्न माप हो सकते हैं। इसी तरह, माप से पहले मिश्रण को ऊपर और नीचे करना महत्वपूर्ण है।

इसके बाद, टीजीएफ-ए 1 और मैट्रिलिन -3 को लेबल किया जाता है ताकि मल्टीमोड माइक्रोप्लेट रीडर के साथ कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रल विश्लेषण के साथ जेबीएनएम के विकास को देखा जा सके। नमूने 488 एनएम लेजर के साथ उत्साहित थे और 520 एनएम और 570 एनएम (चित्रा 3) पर उत्सर्जन शिखर दिखाते थे। अकेले जेबीएनटीएस के लिए कोई उत्सर्जन शिखर नहीं देखा गया क्योंकि उन्हें लेबल नहीं किया गया है। फ्रेट टीजीएफ-ए1 डोनर से मैट्रिलिन -3 स्वीकर्ता तक हुआ, जिससे उत्सर्जन शिखर 520 एनएम पर कम हो गया और उत्सर्जन शिखर 570 एनएम पर बढ़ गया; दो घटक दूरी में 10 एनएम अलग हैं, जिससे फ्रेट घटना होती है। इसलिए, जेबीएनएम की असेंबली चार्ज इंटरैक्शन के साथ स्थानिक (यानी, भौतिक दूरी) प्रक्रियाओं पर आधारित है। जेबीएनएम के विकास में सबसे महत्वपूर्ण कदम अतिरिक्त अनुक्रम है; फ्रेट घटना के पूर्ण प्रभाव का निरीक्षण करने के लिए जेबीएनटीएस को जोड़ने से पहले टीजीएफ-ए 1 और मैट्रिलिन -3 को जोड़ा जाना चाहिए। फ्लोरोसेंट जेबीएनएम का निरीक्षण करने के लिए आंख के टुकड़े पर कम से कम 40x का आवर्धन आवश्यक है। इस तकनीक की सीमा यह है कि जेबीएनटीएस को लेबल नहीं किया जाता है और इसलिए, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ नहीं देखा जा सकता है। हालांकि, प्रोटीन लेबलिंग तकनीक को भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए कुछ संशोधनों के साथ जेबीएनटी लेबल करने के लिए लागू किया जा सकता है।

जेबीएनएम सेल कार्यों की सहायता कर सकता है, जैसे सेल आसंजन और सेल प्रसार। इस अध्ययन में, एचएमएससी को विभिन्न सामग्रियों (जेबीएनएम, जेबीएनटीएस, टीजीएफ-ए1, मैट्रिलिन -3, और एडिटिव्स के बिना नकारात्मक नियंत्रण) पर संवर्धित (5,000 कोशिकाओं से शुरू) किया गया था ताकि सीसीके -8 समाधान का उपयोग करके 1, 3 और 5 दिनों के लिए इनक्यूबेशन के बाद सेल संख्या की तुलना की जा सके, सेल प्रसार निर्धारित करने के लिए सटीक निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन किया जा सके। जेबीएनएम, विशेष रूप से टीजीएफ-ए 1 की उपस्थिति में, और टीजीएफ-ए 1 ने अकेले अन्य तीन समूहों की तुलना में महत्वपूर्ण सेल प्रसार दिखाया। जेबीएनटी ईसीएम में कोलेजन की नकल करते हैं जबकि मैट्रिलिन -3 एक उपास्थि-विशिष्ट प्रोटीन है, जिसके परिणामस्वरूप 3 और 5 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के बाद सेल प्रसार गतिविधि में वृद्धि होती है (चित्रा 5)। जेबीएनएम ने बायोमैटेरियल्स29,31 के रूप में विभिन्न भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए पारंपरिक सेल संरचनाओं की सीमाओं को दूर करने के लिए एक इंजेक्शन और बायोमिमेटिक ऊतक इंजीनियरिंग मचान के रूप में सेवा करने की बड़ी क्षमता दिखाई है। जेबीएनएम उपास्थि ईसीएम की नकल करता है, आसंजन साइटों को प्रदान करता है और माइक्रोएन्वायरमेंट में प्रो-चोंड्रोजेनिक विभेदक कारकों की रिहाई की अनुमति देता है, जैसे कि टीजीएफ-132,33। मचान की आंतरिक परत में टीजीएफ-ए 1 को शामिल करने की जेबीएनएम की क्षमता इसे अवांछित क्षेत्रों में लीक होने से रोकती है, इस प्रकार मचान की प्रभावशीलता में सुधार होता है (चित्रा 4 और चित्रा 5)। कई एचएमएससी को जेबीएनएम पाड़ के साथ क्लस्टर करते हुए देखा जाता है, जबकि कोशिकाओं को मैट्रिलिन -3, टीजीएफ -ए 1 और नकारात्मक नियंत्रण समूहों (चित्रा 4) में विरल रूप से वितरित किया जाता है। कोशिकाओं की आकृति विज्ञान भी देखा गया था, जो जेबीएनएम सतहों के साथ उत्कृष्ट संबंध का संकेत देता है। ये सटीक रूप से डिज़ाइन किए गए बायोमैटेरियल्स सेल कल्चर वातावरण में शामिल बायोएक्टिव अणुओं की तेजी से रिहाई को रोकते हैं और मैट्रिक्स34 के भीतर ऊतक निर्माण की आत्म-स्थिरता में सुधार करते हैं। इस तकनीक की एक सीमा यह है कि कोशिकाओं के प्रसार को निर्धारित करने के लिए शुरुआती सेल संख्या महत्वपूर्ण है। इस अध्ययन के लिए 5,000 की शुरुआती सेल संख्या सबसे इष्टतम पाई गई। कोशिकाओं की ज्ञात संख्या को प्लॉट करके और मल्टीमोड माइक्रोप्लेट रीडर में उन्हें मापकर सेल संख्या निर्धारित करने के लिए एक मानक वक्र की भी आवश्यकता होती है। इस तकनीक को भविष्य में जेबीएनएम स्काफोल्ड्स से संबंधित सभी अध्ययनों में सेल प्रसार निर्धारित करने के लिए एक मानकीकृत विधि के रूप में लागू किया जा सकता है।

15 दिनों के लिए दीर्घकालिक कार्य अध्ययन निर्धारित करने के लिए जेबीएनएम के साथ और बिना 3 डी अगारोस छर्रों में एचएमएससी को संवर्धित किया गया था। 15 दिनों के बाद, अगारोस छर्रों में एचएमएससी से कुल आरएनए निकाला गया, जिसमें सकारात्मक नियंत्रण था (छर्रों को हर बार ताजा टीजीएफ-ए 1 के साथ आपूर्ति की गई थी जब माध्यम बदला गया था), जेबीएनएम, जेबीएनटीएस, मैट्रिलिन -3, टीजीएफ -1, और कोई एडिटिव्स नहीं। जीन विश्लेषण के लिए रीयल-टाइम क्यूपीसीआर किया गया था, चोंड्रोजेनिक भेदभाव मार्करों, एग्ग्रेकन (एसीएएन), और हाइपरट्रॉफी मार्कर टाइप एक्स कोलेजन (सीओएल एक्स) के लिए परीक्षण किया गया था। जेबीएनएम समूह में एसीएएन अभिव्यक्ति में अन्य समूहों की तुलना में काफी वृद्धि हुई, यह दर्शाता है कि जेबीएनएम सीओएल एक्स को बाधित करते हुए स्टेम सेल चोंड्रोजेनिक भेदभाव को काफी बढ़ावा देता है। इस बीच, सकारात्मक नियंत्रण ने चोंड्रोजेनेसिस को बढ़ाया है, जैसा कि एसीएएन में वृद्धि में उल्लेख किया गया है, और विभेदित सेल26 की अतिवृद्धि भी है। इस अध्ययन की एक और सीमा यह है कि आरएनए निष्कर्षण एक हाइड्रोगेल में एम्बेडेड कोशिकाओं से है। इस प्रोटोकॉल में प्राप्त कुल आरएनए, इसलिए, एकाग्रता और शुद्धता में कम था। इस सीमा को दूर करने के लिए, अगले चरण, वास्तविक समय क्यूपीसीआर के लिए इष्टतम एकाग्रता और शुद्धता प्राप्त करने के लिए अधिक नमूने सुसंस्कृत और निकाले गए थे। जबकि क्यूपीसीआर अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है, बड़ी संख्या में नमूनों का त्याग किए बिना कुशल नमूना निष्कर्षण सुनिश्चित करने के लिए भविष्य के अध्ययनों के लिए इस तकनीक का मामूली संशोधन आवश्यक है।

जेबीएनएम हाइड्रोगेल से प्रोटीन की रिहाई का परीक्षण करने के लिए मानव टीजीएफ-ए 1 एलिसा किट के साथ एक स्थिरता परीक्षण किया गया था। इस अध्ययन में, TGF-1 को J/T/M JBNm में समझाया जाने की उम्मीद है, और इसलिए कोई TGF-a1 रिलीज नहीं देखी जानी चाहिए (यानी, सैद्धांतिक लोडिंग मान 100% है)। इस कदम की एक सीमा यह है कि सभी टीजीएफ-ए 1 को जेबीएनएम परत-दर-परत मचान में समझाया जाता है। 15 दिनों के बाद, हाइड्रोगेल से जारी समाधान ों को निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए किट के साथ एकत्र और परीक्षण किया जाता है। फिर, टीजीएफ-ए 1 की मात्रा की गणना सैद्धांतिक लोडिंग मूल्य से पीबीएस में जारी टीजीएफ-ए 1 की मात्रा को घटाकर की गई थी। चूंकि TGF-1 को JBNm की आंतरिक परत में समझाया गया था, इसलिए प्रोटीन की धीमी रिहाई का अनुमान लगाया गया था। अध्ययन से पता चला है कि टीजीएफ-ए1 जेबीएनएम पाड़ के भीतर स्थानीयकृत है और आसपासके क्षेत्रों में तेजी से नहीं निकलता है।

इस अभिनव परत-दर-परत जेबीएनएम उपास्थि ऊतक निर्माण को आणविक स्तर पर अत्यधिक संगठित और नियंत्रित स्व-असेंबली द्वारा महसूस किया गया था। टीजीएफ-ए1 मैट्रिक्स फाइबर की आंतरिक परत में सीमित है, अवांछित स्थानों पर इसके रिसाव को रोकता है, और एक साथ स्थानीयकृत चोंड्रोजेनेसिस को बढ़ावा देता है। इसके अलावा, मैट्रिलिन -3 को मैट्रिक्स फाइबर की बाहरी परत में स्थानीयकृत किया जाता है, जिससे एंटी-हाइपरट्रॉफिक माइक्रोएन्वायरमेंट35 बनता है। जेबीएनटीएस को न केवल एक संरचनात्मक पाड़ रीढ़ के रूप में काम करने के लिए दिखाया गया है, बल्कि मैट्रिक्स फाइबर30,36 के साथ कोशिकाओं को स्थानीयकृत करने के लिए स्टेम सेल एंकरेज और आसंजन को भी बढ़ाता है। भविष्य के काम के लिए, जेबीएनटी-आधारित मचान के परत-दर-परत डिजाइन को विभिन्न ऊतकों37,38,39 में अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जाएगा।

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Disclosures

डॉ युपेंग चेन ईस्क्रा बायोटेक, इंक और नैनोडे थेरेप्यूटिक्स, इंक के सह-संस्थापक हैं।

Acknowledgments

यह काम एनआईएच अनुदान 7R01AR072027 और 7R03AR069383, nsF कैरियर अवार्ड 1905785, NSF 2025362 और कनेक्टिकट विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित है। यह काम एनआईएच अनुदान एस 10ओडी016435 द्वारा भी समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 % Normal Goat Serum Thermo Fisher 50062Z Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.
24-well plate Corning 07-200-740 24-well plate used for comparative cell culture.
384-Well Black Untreated Plate Thermo Fisher 262260 384-well plate used for absorption measurements.
8-well chambered coverglass Thermo Fisher 155409PK 8-well coverglass used for comparative cell culture.
96-well flat bottom Corning 07-200-91 96-well plate used for comparative cell culture.
96-Well Plate non- treated Thermo Fisher 260895 96-well plate used for comparative cell culture and analysis.
Agarose Gel Sigma-Aldrich A9539 Hydrogel used for cell culture.
Agarose Gel Sigma Aldrich A9539 Hydrogel used as an environment for cell culture.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit Thermo Fisher A30006 (488) and A30007 (555) Fluorescent dye used to label proteins.
Anti-Collagen X Antibody Thermo Fisher 41-9771-82 Antibody used to stain collagen-X.
Bio-Rad PCR Machine Bio-Rad Equipment used to perform PCR on samples.
C28/I2 Chondrocyte Cell Line Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.
Cell Counting Kit 8 Milipore Sigma 96992 Cell proliferation assay.
Cell Profiler Broad Institute Software used to analyze cell images.
Cryostat Microtome Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.
DAPI Invitrogen D1306 Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.
Disposable cuvettes FISHER Scientific 14-955-128 Container used for spectrophotometry.
DMEM Cell Culture Medium Thermo Fisher 10566032 Media used to support cellular growth.
Fetal Bovine Serum GIBCO A4766801 Serum used in cell culture medium to support cell growth.
Fluoromount-G Mounting Medium Thermo Fisher 00-4958-02 Solution used to mount slides for immunostaining.
Formaldehyde Compound used to fix samples prior to microtoming.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody Thermo Fisher A16110 Antibody used for protein staining.
Human Mesenchymal Stem Cells LONZA PT-2501 Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium LONZA PT-3003 Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.
ImageJ National Institutes of Health Image analysis software used in conjunction with microscopy.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit BioRad 1725150 Kit used for PCR.
Janus-base nanotubes (JBNts) Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope Tecnai Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.
MATLAB MathWorks Statistical software used for modeling and data analysis.
Matrilin-3 Fisher Scientific 3017MN050 Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Fisher Equipment used to measure absorption values of a sample.
Nikon A1R Spectral Confocal Microscope Nikon A1R HD25 Confocal microscope used to analyze samples.
Number 1.5 Chamber Coverglass Thermo Fisher 152250 Environment for sterile cell culture and imaging.
Optimal Cutting Temperature Compound Reagent Compound used to embed cells prior to microtoming.
Paraformaldehyde Thermo Scientific AAJ19943K2 Compound used to fix cells.
PDC-32G Plasma Cleaner Harrick Plasma Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.
penicillin-streptomycin GIBCO 15-140-148 Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.
Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher 10010023 Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.
Rhodamine-phalloidin Invitrogen R415 F-Actin red fluorescent dye.
Rneasy Plant Mini Kit QIAGEN 74904 Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.
Sucrose Solution Solution used to process samples prior to microtoming.
TGF beta-1 Human ELISA Kit Invitrogen BMS249-4 Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample.
TGF-β1 PEPROTECH 100-21C Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.
Triton-X Invitrogen HFH10 Compound used to lyse cells not fixed during staining process.
TRIzol Reagent Thermo Fisher 15596026 Reagent used to isolate RNA.
Zetasizer Nano ZS Malvern Panalytical Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.

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Landolina, M., Yau, A., Chen, Y. Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration. J. Vis. Exp. (185), e63984, doi:10.3791/63984 (2022).

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