Summary
该协议介绍了研究细胞培养实验室中使用的基本细胞培养技术和实践，以避免真菌和细菌污染。在细菌类别中，将特别强调防止支原体污染。
Abstract
细胞培养是在受控环境中生长人类、动物和昆虫细胞或其他组织所必需的一项精细技能。该协议的目标是强调研究实验室中使用的正确技术，以防止真菌和细菌污染。特别强调避免支原体污染，这是细胞培养室的一个主要问题，因为它体积小，对用于细胞培养的大多数抗生素具有抗性。这些相同的技术可确保持续生长并保持健康的细胞。对于新的和有经验的细胞培养用户，始终如一地遵守这些最佳实践以降低污染风险非常重要。实验室应每年审查一次细胞培养最佳实践，并在需要时进行讨论或额外培训。与污染发生后进行清理相比，尽早采取行动防止污染将节省时间和金钱。通用的最佳实践可保持细胞培养的健康，从而减少不断解冻新细胞的需要，购买昂贵的细胞培养基，并减少培养箱净化和停机时间。
Introduction
细胞培养在研究实验室中有许多用途。自20世纪初细胞培养起源以来，细胞系一直帮助推动科学发展。细胞系有几个优点;各种细胞系可以帮助研究人员研究细胞生物学，产生杆状病毒用于进一步研究，或产生大量感兴趣的蛋白质，仅举几例1。一些额外的用途包括研究组织生长，帮助推进疫苗开发，毒理学研究，研究基因在健康生物体和患病模型中的作用，以及杂交细胞系的生产2，3。细胞系还可以实现药物生产3。使用细胞系时，需要适当的无菌技术;本手稿中概述的实践和技术适用于进行细胞培养工作的研究实验室。其他实验室设置不讨论。
在进行细胞培养工作时，污染通常是主要关注的问题。在本文中，污染通常是指真菌和细菌。本文概述的方法的总体目标是全面描述避免污染的最佳实践。所有实验室成员在研究实验室的细胞培养室工作时都应遵守这些做法。实验室应确保所有工人积极参与使用这些最佳实践来防止污染。正确的实践和技术知识将有助于确保细胞培养物保持活力、健康和不受污染。该技术的发展基于文献研究、七年的细胞培养经验，以及对新手和经验丰富的细胞培养工作者每年都可以参考的方法的需求。
需要一种清晰、标准化的技术，所有研究细胞培养实验室都应遵循。许多关于细胞培养污染的文献讨论了支原体的检测、无菌技术、污染源、污染物的消除以及通过使用抗生素和定期检测进行预防4，5，6，7，8。虽然这些信息很有帮助，但文献中没有视频来展示应该遵循的正确细胞培养技术。与其他技术相比，所介绍的做法的优势在于专注于在污染发生之前防止污染，而不是在以后发现和纠正错误。此外，无菌技术的全面演示、关于防止真菌和细菌生长的讨论以及有关生物安全柜气流的信息对于新手和有经验的细胞培养工作者都很有价值。
细菌和真菌是两种最常见的污染物类型。在细菌类别中，支原体是一个主要问题，因为它体积小，能够增殖而不被注意。它们是自我复制的生物，没有依靠真核细胞生长的刚性细胞壁。尽管透射电子显微镜可以检测到支原体9，10，但它们的代谢能力降低，并且可以大量繁殖，同时在细胞培养物的常规目视检查和定期显微镜分析中仍未被识别。此外，它们可以通过微生物过滤器10。细胞培养基为支原体提供营养，但不幸的是，用抗生素补充培养基不会影响支原体10。应该注意的是，一般来说，没有必要用抗生素补充培养基;适当的技术应该足以防止污染。支原体感染不会导致细胞立即死亡，但研究人员担心它会影响数据的可重复性和质量。
所有实验室人员应严格遵守良好的细胞培养规范。培养物应在新购买后、当前生长期间、冷冻保存前以及从液氮2，10 解冻时检测支原体。市场上有不同的测试，使用聚合酶链反应（PCR），酶联免疫吸附测定（ELISA）或免疫染色。3 文献表明，“人分离株占细胞培养中发现的支原体污染物的很大一部分”5。尽管已经描述了200多种支原体，但其中约6种占大多数感染。这六个物种是 M. arginini、M. fermentans、M. hominis、M. hyorhinis、M. oral 和 Acholeplasma laidlawii10。与其他类型的污染一样，空气和气溶胶将这些污染物带入细胞培养物5。这在其他论文中得到了回应，因为“人类操作员可能是实验室中最大的危险”7。虽然这是通过人为错误完成的，但如果遵循标准程序，则可以消除风险。人员脱落不仅限于支原体污染;一个实验室中的细胞培养物通常感染相同的支原体物种，这表明由于不正确的细胞培养技术，污染从一个烧瓶扩散到另一个烧瓶10。
防止交叉污染也是应遵循适当的细胞培养技术的另一个原因。值得注意的是，全球至少有15%-18%的细胞系可能被交叉污染或错误识别11，12。除了测试细胞系的支原体污染外，还应测试它们的交叉污染10。对于人类细胞系，通过一种称为短串联重复（STR）分析的廉价基于DNA的技术进行细胞系鉴定是当前的国际参考标准，因为它是确认细胞系身份的简单方法2，10，13，14。STR可以识别错误标记或交叉污染的细胞系，但不能检测不正确的组织来源10，13，14。如果细胞系被错误标记、错误识别或污染，研究数据的有效性可能会受到损害13.与其他类型的污染类似，由于技术不佳导致气溶胶扩散，错误接触导致错误的细胞类型进入烧瓶，或使用相同的培养基瓶和具有不同细胞系的试剂，可能会发生交叉污染10。不应共享媒体瓶;在两个不同的细胞系之间共享一瓶培养基可以使这些细胞群混合，导致生长更快的细胞类型完全接管烧瓶。这种替换并不明显，会导致标签错误和错误识别2.如果在处理或标记过程中培养物混淆，则也可能将细胞系误认为另一种细胞系10。应特别注意将试剂、培养基和培养瓶彼此分开。每个实验室成员都应该有自己的培养基瓶;实验室成员之间不应进行共享。细胞系本身应从合格的细胞库和供应商处购买。实验室不应共用细胞。研究表明，尽管经常使用STR和支原体检测，但文献中的许多研究论文已经使用了错误识别或污染的细胞系15。筛选研究以找到这些有问题的论文并追溯告知读者此事是很麻烦的。预防是确保此问题不会首先发生的最佳方法。
喷洒含有70%EtOH的物品的简单动作即可杀死生物体;70%的EtOH通过使蛋白质变性和溶解最常见的污染生物（包括细菌和真菌）中的脂质起作用16。研究表明，70%是最有效的浓度;表面蛋白不会与70%的EtOH快速凝结，因此它们可以进入细胞，而它所含的水是蛋白质变性过程所必需的。由于细胞壁两侧的水和酒精的浓度差异，70%的EtOH进入细胞使酶和结构蛋白变性。如果在烧瓶中观察到霉菌生长，则必须首先用70%EtOH喷洒并擦干整个培养箱，然后在60°C下孵育16小时过夜17。这可以杀死大多数霉菌和任何细菌。
与在污染发生后消除污染的替代技术相比，预防措施的主要优势在于，通过及早预防污染，实验室工作人员可以确保他们的细胞培养物是健康的，并且不会有与培养箱净化或丢弃细胞培养物相关的高成本。例如，消除支原体污染物后效率不高7.尽早花时间确保实验室人员接受适当的培训，细胞培养室是独立的，并使用标准程序将节省时间和金钱。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 准备工作
- 常规
- 穿着干净的实验室外套，指定仅在细胞培养室穿着，不得在实验室的其他部分穿着。
注意：实验室外套不需要无菌。 - 戴上未接触任何其他表面的新手套。确保手套紧贴。丁腈、无粉手套是最好的。
注意：手套不需要无菌。 - 为了准备工作，用70%的EtOH喷洒手套，实验室衣套和生物安全柜的内部。用不起毛的纸巾擦干工作表面和玻璃面板。
注意：使用70%的EtOH以最高效率杀死细菌16。纸巾不需要无菌。 - 将水浴保存在细胞培养室内，仅将其用于加热培养基或解冻细胞。按照制造商的清洁说明每周排干并清洗一次水浴。
- 穿着干净的实验室外套，指定仅在细胞培养室穿着，不得在实验室的其他部分穿着。
- 生物安全柜内
- 限制带入机柜的物品数量。不要通过阻塞前格栅或后格栅来中断生物安全柜内的气流。
注：有关机柜内空气流动方式的说明，请参阅 图 1 。 - 用70%的EtOH喷洒橱柜内的所有物品，然后擦干。首先喷洒培养基瓶的顶部并向下工作。同样，用干净的纸巾擦干，逐渐向下。不要朝盖子走回去。
- 如果柜子足够大，可以容纳血清移液器，则可以将它们放在里面，否则它们可以存放在安装在柜子外部的容器中。使用前检查包装中的移液器两侧是否有孔洞、撕裂或穿孔。不要撕掉包装。相反，轻轻剥开包装的末端，将血清移液器插入移液器辅助设备，然后以一个流畅的动作取下包装。
- 不要将鼠标悬停在打开的瓶子或烧瓶上;将手伸向打开的瓶子或烧瓶，或打开的物品放在生物安全柜中已经打开的物品的顶部。
注意：机柜内的气流向下推到工作台面上，因此套筒上存在的任何污染物都可能进入细胞培养物。 - 不要倒入液体。相反，使用血清移液器添加它们。补充培养基后，彻底混合内容物并初始瓶子。此外，请确保包含媒体补充内容的标签。
- 限制带入机柜的物品数量。不要通过阻塞前格栅或后格栅来中断生物安全柜内的气流。
2. 使用贴壁细胞系
- 如果需要塑料烧瓶，请喷洒整个袋子并将其放入橱柜内。
- 使用高压灭菌玻璃移液器或一次性无菌塑料移液器吸出培养基或洗涤溶液。小心地从存储容器中取下金属盖。通过以一定角度轻轻摇晃容器来隔离一个玻璃移液器。将手伸入容器时，避免触摸任何其他移液器。
注意：仅从一端处理所选移液器。 - 尽快快速更换瓶盖。将盖子倒置放在工作台面上，使轮辋不会接触工作台面。不要从顶部或底部抓住盖子;相反，请从侧面触摸盖子。
- 吸入液体时，请使用位于机柜外的真空捕集瓶，放在地板上的辅助容器中。
注意：请勿将任何液体废物扔进生物危害废物袋中，因为袋子会泄漏。在机柜内工作时会产生废物。过于频繁地将手移入和移出机柜会中断气流。将任何废物暂时留在机柜内。将其放在一边，这样就不会中断工作。 - 每当手套变干时，请大量喷洒70%的EtOH。将双手揉搓在一起，以免手套滴湿。
- 如果血清移液器误碰到柜子里的东西，请不要犹豫，把它扔掉。使用干净的血清移液管重新开始，而不是使用可能被污染的移液器。
4. 检查和存储细胞
- 在将细胞放入培养箱之前，请检查它们在显微镜下的外观。如果细胞已彻底悬浮，则应观察单个细胞。
- 不要说话、打喷嚏、咳嗽或对着培养箱重呼吸。快速打开和关闭培养箱门。将门打开的时间超过必要的时间可能会使空气中存在的污染物进入培养箱。
注意：在细胞培养室工作时戴口罩会有所帮助，因为支原体可能存在于人口中。避免在细胞培养室使用手机，因为不建议说话。 - 在从柜子中取出瓶子之前，确保所有瓶子上的盖子都紧闭。
- 不使用时将细胞培养基储存在4°C的黑暗中，因为它对光敏感。
- 细胞培养工作完成后，再次用70%EtOH喷洒柜子内部，并用纸巾擦干表面。清空生物危害垃圾袋。重复此过程，并在切换到其他细胞系时更换手套。
5. 使用悬浮细胞系
- 对于在玻璃烧瓶中生长的悬浮细胞，请确保用70%EtOH彻底喷洒手套，然后用湿手套接触铝箔，并在将其放入柜内之前仅喷洒烧瓶的底部。
- 取样进行细胞计数时，仅从容器中取出一个 1.5 mL 管。请勿触摸任何其他管子。将盖子倒置放在工作表面上。请勿触摸内缘。从侧面小心处理，完成后更换。
- 小心地取下覆盖烧瓶整个颈部的双折铝箔。薄膜取下后，仅从底部处理玻璃烧瓶，请勿从颈部触摸玻璃烧瓶。使用 1 mL 血清移液管取样进行细胞计数。
- 不要让培养基从烧瓶侧面滴落;如果是这样，请喷洒含有70%乙醇的纸巾并立即清理。
- 在从生物安全柜中取出瓶子或烧瓶之前，确保盖子和铝箔已拧紧。
6. 细胞孵育
- 对不同的细胞类型使用单独的培养箱，以防止不同细胞类型的交叉污染。
7. 废液收集
- 将液体废物收集在位于柜外地板上的真空捕集瓶中，放在标有“废物”的辅助容器中。
注意：软管连接到高效微粒吸收（HEPA）过滤器，每月更换一次。
8. 清理
- 取出生物危害废物袋并尽快清洗玻璃烧瓶。在水槽旁保持玻璃清洗方案。有关洗涤方案，请参阅 补充文件1 。
- 对细胞培养玻璃器皿进行高压灭菌，而不是将其送到玻璃清洗设施。将其与实验室主要区域的玻璃器皿分开。
注意：如果玻璃擦洗不当，SF-9细胞会在烧瓶侧面留下死细胞边缘。有关高压灭菌器协议，请参阅 补充文件 1 。
9. 组织
- 组织细胞培养室，使所有耗材都位于一个区域，从而最大限度地减少实验室成员离开房间寻找耗材的需要。
- 将任何用于收获细胞并在之后在细胞培养中重复使用的塑料瓶标记为“仅供细胞培养使用”。将指定的细胞培养瓶用于一种特定的细胞类型。将瓶子存放在细胞培养室中，以便于取用。
10. 识别细菌、真菌和支原体污染
注意：不遵循上述工作流程会导致细菌、真菌和支原体污染。
- 总是在开始工作之前，观察烧瓶是否有重浊度，以绒毛球的形式额外生长，以及侧面细胞的密集堆积，所有这些都是污染的指标。
注意：有经验的眼睛可以分辨出微生物污染引起的浑浊度与实际细胞之间的差异。当细胞导致通常透明的培养基出现浑浊时，细菌污染会导致白色的严重浑浊。- 通过观察介质中漂浮的圆形模糊球的外观，直观地识别霉菌污染（见 图2）。
- 如果培养基浑浊、白色或湍流，目视识别细菌污染（见 图2）。
- 通过每月进行支原体检测来识别支原体污染。一项基于 PCR 的测试指示用户取 1.5 mL 细胞样品，使用 10 μL 进行细胞计数，稀释至 0.08 x 106 个细胞/mL，旋转细胞，使用试剂盒中包含的缓冲液裂解细胞，然后最后一次旋转。将上清液与扩增一系列支原体物种的引物一起孵育。运行DNA凝胶以可视化条带。无条带意味着未鉴定支原体。
注意：这种主要污染物可能存在于人体口腔中。在解冻细胞后和将其用于实验之前测试细胞中的支原体污染是一种很好的做法。之后，每月监测一次细胞的支原体污染。许多公司提供支原体检测试剂盒。选择一个合适的。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
如果不遵循本文中概述的正确细胞培养技术和实践，研究细胞培养实验室可能会受到真菌和细菌的污染。 图2 显示了悬浮液和贴壁培养物中含有污染物的培养瓶。
如果不遵循无菌技术，2-3天后可能会发生霉菌污染。悬浮细胞中漂浮在培养基中的圆形绒毛球很明显，而附着细胞中的霉菌生长可以观察到大块、不规则、白色或绿色斑块。
对于细菌，第二天观察到污染。媒体是湍流的，白色的，多云的。白色是细菌细胞的典型特征，其繁殖速度比细胞系快得多。有经验的眼睛能够区分未受污染的介质和受污染的介质。对于附着的细胞，可以将一瓶未开封的培养基与烧瓶进行比较，以检查烧瓶中是否观察到任何湍流。
在生物安全柜内，物品数量应保持在最低限度。避免将物品放在后格栅和前格栅上（请参阅图 3）。在这个柜子里，有一套移液器、吸头、高压灭菌的玻璃移液器、移液器辅助装置和标记器。中间的工作区域很清晰。以这种方式保持机柜井井有条是个好主意。此外，操作员在开始工作前应穿上干净的实验室外套和手套。应将含有70%乙基醇的喷雾瓶放在附近，以便操作员可以经常喷洒手套。皮肤被手套或实验室外套覆盖。在机柜内工作时，操作员应调整椅子，使其手臂呈 90° 角，并且物品应在机柜内触手可及（请参阅图 4）。
许多支原体种类可以使用基于PCR的测定法可靠地鉴定。 图5 显示了支原体检测阴性的结果。左边的条带显示了DNA的分子量标准品。右边的四个波段是阳性对照。由于未检测到支原体，因此在测试细胞类型下没有出现条带。
如果培养基含有pH指示剂，则细胞的最佳pH值为7.4，它将为红色。一旦细胞生长，培养基的颜色将从红色变为黄色3。如果细菌接管烧瓶并过度生长，也会发生这种颜色变化（图6）。黄色表示pH值低。观察烧瓶旁边一瓶新的、未开封的培养基是观察附着细胞污染的客观方法。对于悬浮培养，用户可以仔细观察培养瓶中漂浮的任何生长物，或者玻璃烧瓶内部周围是否存在厚厚的细菌细胞环。对于这两种细胞类型，都可以取少量样品并在显微镜下观察。如果观察到其他生长或细胞形状，特别是如果细胞正在移动，那么这是污染的指标（图7）。在细胞计数之前，应彻底清洁血细胞计数器，因为这种类型的碎片可能仅存在于血细胞计数器上，而不存在于细胞培养物本身中。
气味可能是培养箱中污染的另一个指标。细菌过度生长具有典型的气味，有经验的细胞培养用户会注意到。气味总是与受污染的烧瓶一致，尽管一个受感染的烧瓶可能并不总是导致整个培养箱闻到气味。
霉菌污染在悬浮生长的HEK 293 S细胞中更为普遍。细菌污染在SF-9细胞中更为常见。这可能是因为RIC细胞在湿度下生长，从而导致培养箱中的水分积聚。SF-9细胞在没有湿度的情况下生长，因此环境更干燥。贴壁培养物中的污染速率小于悬浮培养物中的污染速率。这可能是由于烧瓶尺寸较小，烧瓶不可重复使用的性质，或者通风盖而不是使用铝箔。
支原体不能用肉眼或普通光学显微镜观察，尽管专门的透射电子显微镜可以检测支原体。应每月使用支原体鉴定试剂盒检测细胞培养物。许多支原体种类可以使用基于PCR的测定法可靠地鉴定。有关如何进行此PCR测试的简要说明可以在方案部分找到，有关支原体的更多信息可以在讨论部分找到。
图1：空气 在 生物安全柜中的流动方式。 生物安全柜通过前后格栅从房间本身和机柜中抽取受污染的空气。这些空气进入金属工作表面下方，朝向机柜的背面，并到达 HEPA 过滤器所在的装置顶部。在那里，空气通过过滤器并被过滤。这种清洁的空气压在工作台面上。由于过滤后的气流如何在机柜内向下推，因此最好不要悬停。例如，不希望在打开的瓶子顶部有一个套筒，并且有可能将任何潜在的污染物推入介质中。带入机柜的物品数量应保持在最低限度，并且不应将物品放在前格栅或后格栅上，以免中断气流。将手臂移入和移出机柜的速度过快也会干扰气流。由Jeff Kaphingst，Jeff the Designer，LLC为NuAire，Inc.创建。 请点击此处查看此图的大图。
图2：未受污染的悬浮液和贴壁细胞以及被霉菌或细菌污染的细胞。 左边的第一张图片包含未被污染的昆虫细胞（SF-9细胞）。第二张图像显示了这些细胞被霉菌污染的另一个烧瓶。第三个烧瓶被细菌污染，从厚厚的白色浑浊外观可以看出。第二个和第三个烧瓶被污染，因为没有遵循适当的细胞培养技术和实践。所有烧瓶均在同一天制备。第二天观察到细菌污染的生长，2天后观察到霉菌污染的生长。图中显示了未受污染的贴壁细胞（Hek293细胞）以及贴壁培养物中的霉菌和细菌污染。霉菌污染显示在圆形培养皿的第二行中。照片是从盘子的顶部拍摄的。 请点击此处查看此图的大图。
图3：细胞培养柜组织。 在生物安全柜内，物品的数量应保持在最低限度。应避免将物品放在后格栅和前格栅上。在这个柜子里，有一套移液器、吸头、高压灭菌的玻璃移液器、移液器辅助装置和标记器。中间的工作区域很清晰。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：操作员在流罩下工作的正确方法。 操作员在开始工作前应穿上干净的实验室外套和手套。应将含有70%乙基醇的喷雾瓶放在附近，以便操作员可以经常喷洒手套。皮肤被手套或实验室外套覆盖。操作员应调整他们的椅子，使其在机柜内工作时手臂呈 90° 角。物品应在机柜内触手可及。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：支原体检测结果为阴性。 许多支原体种类可以使用基于PCR的测定法可靠地鉴定。左边的条带显示了DNA的分子量标准品。右边的四个波段是阳性对照。由于未检测到支原体，因此在测试细胞类型下没有出现条带。 请点击此处查看此图的大图。
图6：正常介质颜色从红色变为黄色。 如果存在pH指示剂，细胞培养基的颜色将从红色变为黄色。黄色表示pH值低，应更换培养基。 请点击此处查看此图的大图。
图 7：在光学显微镜下观察到的污染物。 如果在进行细胞计数时在光学显微镜下观察到其他生长或细胞形状，那么这可能是污染的指标。应该注意的是，在细胞计数之前应彻底清洁血细胞计数器，因为这种类型的碎片可能仅存在于血细胞计数器上，而不是细胞培养物本身。 请点击此处查看此图的大图。
补充文件1：附录 请点击这里下载此文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
虽然污染是进行细胞培养工作时的主要问题之一，但本手稿中概述的实践和技术将有助于降低风险。关键步骤包括穿着干净的实验室外套，仅在细胞培养室使用，使用干净的无粉手套，这些手套经常喷洒70%EtOH，并在细胞系之间切换时更换，鼓励每个人不要共用培养基瓶，在完成工作之前和之后彻底清洁机柜， 整齐地打开血清移液器，避免长时间密切接触打开的瓶子或烧瓶，不要在多个细胞系之间共享培养基瓶，并快速打开和关闭培养箱门。此外，清洗和高压灭菌自己的玻璃器皿可确保质量控制，从而降低引入外部污染物的可能性。质量控制方法包括使用高压釜胶带指示灭菌器是否已达到121°C的适当温度，定期对设备进行预防性维护，以及目视检查烧瓶以确保其已正确擦洗18。另一个重要的一点是，对不同的细胞类型使用单独的培养箱，以确保一种细胞类型的污染不会转移到其他细胞类型，并确保不会发生与细胞的交叉污染。
细菌和真菌感染是细胞培养物中最常见的两种入侵者。主要污染物之一，口腔支 原体，是人类口腔中最常见的支原体物种，也是“代表单一最常见的分离株，占细胞培养物中所有支原体感染的20%-40%”4。换句话说，实验室人员是这种污染的主要来源。这始终是细胞培养室中关注的问题，因为支原体是一种小而缓慢的微生物，缺乏可以通过0.45μm过滤器的刚性细胞壁4。研究表明，支原体污染的发生率为连续人或动物细胞系的15%-35%4。此外，统计数据表明，世界上约有5%至30%的细胞系被支原体污染6。不幸的是，支原体对大多数用于细胞培养的抗生素具有耐药性，感染会影响细胞生理和代谢4，6。虽然污染不会减慢细胞新陈代谢，但它可能会污染最终产物6。感染可以在实验室成员没有注意到细胞损伤的情况下持续存在。如果确实发生污染，解冻新细胞的成本，繁殖新培养物所花费的时间，浪费的昂贵培养基，净化培养箱以及同事等待再次开始实验所花费的时间是巨大的。我们的实验室估计，总损失时间占2周，与典型的人类哺乳动物细胞蛋白表达8 L的污染相关的总成本为1，400美元。本手稿中概述的实践和技术提供了良好的预防措施，以减轻额外的成本、细胞损失和停机时间。
不建议修改这些做法。所有实验室成员在细胞培养室工作之前都应接受培训，然后每年接受进修培训7.实验室成员还应组织细胞培养室，以便将所有必要的用品集中在一个区域，从而最大限度地减少实验室成员离开细胞培养室寻找用品的需要。
如果污染来自外部来源，如血清、培养箱、故障高压灭菌器、脏实验室涂层或细胞来源，则观察到所介绍技术的局限性。如果尽管严格遵守此协议但仍发生污染，则可能需要对该技术进行故障排除。许多外部因素都可能导致这种类型的污染。实验室成员需要谨慎并检查外部来源。例如，从供应商处购买的胎牛血清（FBS）可能已被支原体污染。与 1950 年代相比，这种情况现在很少发生，但仍可能发生6.如果发现任何污染，应扔掉所有培养基瓶，并通过解冻新细胞和使用新培养基重新启动协议。如果是霉菌或细菌，则培养箱内可能已经存在污染物;应检查同一培养箱内的其他烧瓶，以查看是否观察到细菌或霉菌生长。应扔掉所有受污染的烧瓶，并对培养箱进行净化。如果没有发现污染，应检查高压釜是否有故障错误;玻璃器皿可能一开始就没有正确高压灭菌。尽管高压釜未达到121°C，但高压釜胶带可能会改变颜色。 之后，应检查所用抗生素溶液的有效期;可能需要购买新的解决方案。最后，应考虑细胞的来源;它们是从值得信赖的实验室供应商那里借来的还是从其他实验室借来的？电池应始终从值得信赖的实验室供应商处购买，切勿从其他实验室借用。最后，应清洗实验室涂层以确保其清洁度19.每当烧瓶被污染时，应考虑对培养箱进行净化。不得让细菌细胞或霉菌孢子繁殖并继续传播污染。
现有方法反映了污染的消除。本手稿中概述的方法侧重于预防而不是消除污染。关于使用抗生素去除支原体20，存在几种程序。然而，使用抗生素是有风险的，因为它们可能无法完全消除感染，并且“可能允许耐药生物体发展”12。事实上，“在抗生素中连续生长的培养物中有 72% 被证明是支原体阳性，而在没有抗生素的情况下生长的培养物中只有 7% 被感染”12。这些数据强调了这样一种观点，即虽然建议使用抗生素并且可能有帮助，但过度使用或完全依赖抗生素是没有好处的。此外，使用抗生素去除污染可能只会让问题持续存在。抗生素溶液不是必需的;如果遵循本文中的技术，则应成功防止污染。
本手稿中概述的做法和技术可用于将来在进行每月支原体测试和自制感受态细菌细胞时保持无菌环境。两种方案都需要一个清洁的环境，类似于细胞培养工作，以便最终产品不受污染。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有任何利益冲突。
Acknowledgments
这项工作之所以成为可能，要归功于霍华德休斯医学研究所（HHMI）的资助。我们要感谢我们的实验室负责人 Jue Chen 阅读手稿并感谢她的持续支持，感谢 Donna Tallent 的有益编辑和评论，感谢洛克菲勒大学信息技术系的 Jeff Hennefeld 对本手稿视频部分的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS | Gibco | 14-190-144 | |
| DMEM F-12 Media | ATCC | 30-2006 | |
| Glass Baffled Flask | Pyrex | 09-552-40 | |
| Glass Pipettes | Fisher | 13-678-6B | |
| Pipette Aid | Drummond | 13-681-15A | |
| Serological Pipette | Corning | 07-200-573 | |
| T75 flask | Corning | 07-202-004 | |
| Trypsin | Gibco | 25-300-054 | |
| *Items may vary because this video is about general cell culture techniques |
References
- Johnson, Z. L., Chen, J. Structural basis of substrate recognition by the multidrug resistance protein MRP1. Cell. 168 (6), 1075-1085 (2017).
- Capes-Davis, A., et al. Cell lines as biological models: practical steps for more reliable research. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).
- Segeritz, C. P., Vallier, L. Cell culture: growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
- Lincoln, C. K., Gabridge, M. G. Cell culture contamination: sources, consequences, prevention, and elimination. Methods in Cell Biology. 57, 49-65 (1998).
- Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of mycoplasma contamination in cell culture. Cell Journal. 13 (4), 203-212 (2012).
- Stacey, G. N.
- Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R.
- Barth, O. M., Majerowicz, S. Rapid detection by transmission electron microscopy of mycoplasma contamination in sera and cell cultures. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 83 (1), 63-66 (1988).
- Mirabelli, P., Coppola, L., Salvatore, M. Cancer cell lines are useful model systems for medical research. Cancers. 11 (8), 1098 (2019).
- Gabelli, S., Zhao, C., Oberst, J. A cell culture master class: What your cells wish they could tell you. Science. , Available from: https://www.science.org/content/webinar/cell-culture-master-class-your-cells-wish-they-could-tell-you (2020).
- Langdon, S. P. Cell culture contamination: an overview. Methods in Molecular Medicine. 88, 309-317 (2004).
- Babic, Z., et al. Meta-research: Incidences of problematic cell lines are lower in papers that use RRIDs to identify cell lines. eLife. 8, e41676 (2019).
- Visconti, P., et al. Short tandem repeat profiling for the authentication of cancer stem-like cells. International Journal of Cancer. 148 (6), 1489-1498 (2021).
- Horbach, S. P. J. M., Halffman, W. The ghosts of HeLa: How cell line misidentification contaminates the scientific literature. PLoS One. 12 (10), 0186281 (2017).
- Why 70% isopropyl alcohol is a better disinfectant than 99% isopropyl alcohol when it comes to Covid-19. MunGlobal. , Available from: https://munglobal.com.au/resources/knowledge-base/pathogens/why-70-isopropyl-alcohol-is-a-better-disinfectant-than-99-isopropyl-alcohol/#:~:text=Due%20to%20the%20concentration%20difference,potency%20of%20its%20antimicrobial%20properties (2023).
- United States Department of Agriculture. Processing and Safety. Food Safety Publications. , Available from: https://www.ars.usda.gov/ARSUserFiles/60701000/FoodSafetyPublications/p328.pdf (2004).
- Sterilizing Practices. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/sterilizing-practices.html (2023).
- Coté, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1.3 (2001).
- Uphoff, C. C., Drexler, H. G. Eradication of Mycoplasma contamination from cell cultures. Current Protocols in Molecular Biology. 106, 1-12 (2014).
- Bykowski, T., Stevenson, B.
- Penning, S. D. How a Class II, Type A2 Biosafety Cabinet Works. Nuaire. , Available from: https://www.nuaire.com/resources/class-ii-type-a2-biosafety-cabinet-how-it-works-article (2020).
- Phelan, K., May, K. M. Mammalian cell tissue culture techniques. Current Protocols in Pharmacology. 73, 1-23 (2016).
