Summary
פרוטוקול זה מציג טכניקות ושיטות חיוניות לתרביות תאים שישמשו במעבדת המחקר לתרביות תאים כדי למנוע זיהום על ידי פטריות וחיידקים. בתוך קטגוריית החיידקים, יושם דגש מיוחד על מניעת זיהום מיקופלסמה.
Abstract
תרבית תאים היא מיומנות עדינה הנחוצה לגידול תאי אדם, בעלי חיים וחרקים, או רקמות אחרות, בסביבה מבוקרת. מטרת הפרוטוקול היא להדגיש את הטכניקות הנכונות המשמשות במעבדת מחקר למניעת זיהום מפטריות וחיידקים. דגש מיוחד מושם על הימנעות מזיהום מיקופלסמה, דאגה מרכזית בחדר תרביות התאים בשל גודלו הקטן ועמידותו לרוב האנטיביוטיקות המשמשות לתרביות תאים. אותן טכניקות מבטיחות צמיחה מתמשכת ושומרות על תאים בריאים. עבור משתמשים חדשים ומנוסים בתרביות תאים כאחד, חשוב לדבוק באופן עקבי בשיטות עבודה מומלצות אלה כדי להפחית את הסיכון לזיהום. פעם בשנה, מעבדות צריכות לבחון שיטות עבודה מומלצות לתרביות תאים ומעקב עם דיון או הכשרה נוספת במידת הצורך. נקיטת פעולה מוקדמת למניעת זיהום מלכתחילה תחסוך זמן וכסף, בהשוואה לניקוי לאחר התרחשות הזיהום. שיטות עבודה מומלצות אוניברסליות שומרות על תרביות תאים בריאות, ובכך מפחיתות את הצורך להפשיר תאים חדשים כל הזמן, לרכוש מדיה יקרה של תרביות תאים, ולהפחית את כמות הטיהור וההשבתה של האינקובטור.
Introduction
לתרבית תאים שימושים רבים במעבדת המחקר. מאז ראשית תרביות התאים בתחילת המאה ה-20, קווי תאים סייעו לקדם את המדע. לקווי תאים יש מספר יתרונות; קווי תאים שונים יכולים לסייע לחוקרים לחקור ביולוגיה של התא, לייצר baculovirus למחקרים נוספים, או לייצר כמויות גדולות של חלבון מעניין, אם לציין כמה1. שימושים נוספים כוללים חקר צמיחת רקמות, סיוע בקידום פיתוח חיסונים, מחקר טוקסיקולוגי, חקר תפקיד הגנים באורגניזמים בריאים ובמודלים חולים, וייצור קווי תאים היברידיים 2,3. קווי תאים יכולים גם לאפשר ייצור תרופות3. טכניקות אספטיות נכונות נחוצות בעת עבודה עם קווי תאים; הפרקטיקות והטכניקות המתוארות בכתב יד זה ישימות למעבדות מחקר שבהן מתבצעת עבודת תרבית תאים. הגדרות מעבדה אחרות אינן נדונות.
זיהום הוא לעתים קרובות הדאגה העיקרית בעת ביצוע עבודת תרבית תאים. בהקשר של מאמר זה, זיהום מתייחס בדרך כלל לפטריות וחיידקים. המטרה הכוללת של השיטה המתוארת במאמר זה היא לתאר ביסודיות את שיטות העבודה המומלצות למניעת זיהום. כל חברי המעבדה צריכים לדבוק בפרקטיקות אלה כאשר הם עובדים בחדר תרביות תאים של מעבדת מחקר. מעבדות צריכות להבטיח שכל העובדים הם משתתפים פעילים בשימוש בשיטות עבודה מומלצות אלה למניעת זיהום. הידע של שיטות העבודה והטכניקות הנכונות יסייע להבטיח שתרביות תאים יישארו בנות קיימא, בריאות וללא זיהום. פיתוח טכניקה זו מבוסס על מחקר הספרות, שבע שנות ניסיון בעבודה עם תרביות תאים, והצורך בשיטה שגם עובדים מתחילים וגם מנוסים בתרביות תאים יכולים להתייחס אליה על בסיס שנתי.
יש צורך בטכניקה ברורה וסטנדרטית שכל מעבדות המחקר לתרביות תאים צריכות לעקוב אחריה. רוב הספרות על זיהום תרביות תאים דנה בזיהוי מיקופלסמה, טכניקות אספטיות, מקורות זיהום, חיסול מזהמים ומניעה על ידי שימוש באנטיביוטיקה ובדיקות קבועות 4,5,6,7,8. בעוד שמידע זה מועיל, אין בספרות סרטונים המדגימים את טכניקות תרבית התאים הנכונות שיש לעקוב אחריהן. היתרון של הפרקטיקות המוצגות על פני טכניקות חלופיות הוא התמקדות במניעת זיהום לפני שהוא קורה, ולא באיתור ותיקון טעויות מאוחר יותר. יתר על כן, הדגמה יסודית של טכניקות אספטיות, דיון על מניעת צמיחת פטריות וחיידקים, ומידע לגבי זרימת האוויר בארון הבטיחות הביולוגית הם בעלי ערך עבור עובדי תרביות תאים מתחילים ומנוסים כאחד.
חיידקים ופטריות הם שני סוגי המזהמים הנפוצים ביותר. בתוך קטגוריית החיידקים, מיקופלסמה מהווה דאגה עיקרית בשל גודלה הקטן ויכולתה להתרבות מבלי שיבחינו בה. הם אורגניזמים המשכפלים את עצמם ללא דופן תא קשיחה, המסתמכים על תאים איקריוטים כדי לגדול. יש להם יכולות מטבוליות מופחתות והם יכולים להתרבות מאוד תוך שהם נשארים בלתי מזוהים בבדיקה חזותית שגרתית של תרביות תאים וניתוח מיקרוסקופי רגיל, אם כי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור יכול לזהות מיקופלסמה 9,10. יתר על כן, הם יכולים לעבור דרך מסננים מיקרוביולוגיים10. מדיום תרבית תאים מספק מיקופלסמה עם חומרים מזינים, אם כי למרבה הצער תוספת מדיה עם אנטיביוטיקה אינה משפיעה על מיקופלסמה10. יש לציין כי, באופן כללי, אין צורך להשלים את התקשורת עם אנטיביוטיקה; טכניקות נכונות צריכות להספיק כדי לשמור על זיהום במפרץ. זיהום במיקופלסמה אינו מוביל למוות תאי מיידי, אך הוא מדאיג את החוקרים מכיוון שהוא משפיע על שחזור הנתונים ואיכותם.
כל אנשי המעבדה צריכים להקפיד על שיטות תרבית תאים טובות. תרביות יש לבדוק מיקופלסמה לאחר שנרכשו לאחרונה, בזמן שהן גדלות כעת, לפני שימור בהקפאה, וכאשר הן מופשרות מחנקן נוזלי 2,10. בדיקות שונות זמינות בשוק באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR), בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA), או immunostaining. 3 הספרות מצביעה על כך ש"מבודדים אנושיים מייצגים אחוז גדול ממזהמי המיקופלסמה הנמצאים בתרביות תאים"5. למרות שתוארו יותר מ-200 מיני מיקופלסמה, כשישה מהם אחראים לרוב הזיהומים. ששת המינים הללו הם M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale ו-Acholeplasma laidlawii10. כמו עם סוגים אחרים של זיהום, אוויר ואירוסולים מביאים אותם לתוך תרביות תאים5. הדבר מהדהד במאמרים אחרים, שכן "המפעיל האנושי הוא בעל הפוטנציאל לסכנה הגדולה ביותר במעבדה"7. למרות שזה נעשה באמצעות טעות אנוש, הסיכון ניתן לבטל אם הליך סטנדרטי הוא אחריו. שפיכה מכוח אדם אינה מוגבלת רק לזיהום מיקופלסמה; תרביות תאים במעבדה אחת נגועות בדרך כלל באותו מין מיקופלסמה, דבר המצביע על כך שהזיהום מתפשט מבקבוק אחד למשנהו עקב טכניקות לא נכונות של תרביות תאים10.
מניעת זיהום צולב היא גם סיבה נוספת מדוע יש לעקוב אחר טכניקות תרבית תאים נכונות. יצוין כי לפחות 15%-18% מקווי התאים ברחבי העולם עשויים להיות מזוהמים צולבים או מזוהים באופן שגוי11,12. בנוסף לבדיקת קווי תאים לזיהום מיקופלסמה, יש לבדוק אותם גם לזיהום צולב10. עבור קווי תאים אנושיים, אימות קו התא באמצעות טכניקה זולה מבוססת DNA הנקראת פרופיל חזרה טנדם קצר (STR) הוא תקן הייחוס הבינלאומי הנוכחי, מכיוון שזו דרך קלה לאשר את זהות קו התא 2,10,13,14. STR יכול לזהות קווי תאים עם תווית שגויה או צולבת, אך הוא אינו יכול לזהות מקור רקמה שגוי10,13,14. תוקפם של נתוני מחקר עלול להיפגע אם קווי תאים מסומנים באופן שגוי, מזוהים באופן שגוי או מזוהמים13. בדומה לסוגים אחרים של זיהום, זיהום צולב יכול להתרחש עקב טכניקה לקויה הגורמת להתפשטות אירוסולים, מגע מוטעה המוביל לסוג תא שגוי להיכנס לצלוחית, או שימוש באותו בקבוק מדיה וריאגנטים עם קווי תאים שונים10. אין לשתף בקבוקי מדיה; שיתוף בקבוק אחד של מדיה בין שני קווי תאים שונים יכול לאפשר לאוכלוסיות תאים אלה להיות מעורבבות, מה שמוביל את סוג התא הגדל מהר יותר להשתלט לחלוטין על הצלוחית. החלפה זו אינה מורגשת ומובילה לתיוג שגוי ולזיהוי שגוי2. קו תא יכול גם להיות מוטעה אחר אם תרביות מתבלבלות במהלך טיפול או תיוג10. יש להקדיש תשומת לב רבה לשמירה על ריאגנטים, מדיה וצלוחיות בנפרד זה מזה. לכל חבר מעבדה צריכים להיות בקבוקי מדיה משלו; אין לשתף בין חברי המעבדה. את קווי הסלולר עצמם יש לרכוש מבנק סלולרי מוסמך וספק. מעבדות לא צריכות לחלוק תאים. מחקרים מראים כי למרות שבדיקות STR ומיקופלסמה נמצאות בשימוש קבוע, מחקרים רבים בספרות כבר השתמשו בקווי תאים מזוהים או מזוהמים15. סינון המחקר כדי למצוא את המאמרים הבעייתיים הללו וליידע את הקוראים בדיעבד בעניין זה הוא מסורבל. מניעה היא הדרך הטובה ביותר להבטיח בעיה זו לא מתרחשת מלכתחילה.
הפעולה הפשוטה של ריסוס פריטים עם 70% EtOH יכולה להרוג אורגניזמים; 70% EtOH פועל על ידי דנטורציה של חלבונים והמסת שומנים באורגניזמים המזהמים הנפוצים ביותר, כולל חיידקים ופטריות16. מחקרים הראו כי 70% הוא הריכוז היעיל ביותר; חלבונים פני השטח אינם נקרשים במהירות עם 70% EtOH כך שהם יכולים להיכנס לתא, בעוד המים שהוא מכיל נחוצים לתהליך דנטורציה של חלבונים. בשל הפרש הריכוזים של מים ואלכוהול משני צדי דופן התא, 70% EtOH נכנס לתא כדי לנטרל חלבונים אנזימטיים ומבניים. אם צמיחת עובש נצפתה בצלוחיות, יש לטהר את האינקובטור כולו על ידי ריסוס תחילה עם 70% EtOH וניגובו יבש, ולאחר מכן דגירה של 16 שעות לילה ב 60 ° C17. זה הורג את רוב העובש וכל חיידקים.
היתרון העיקרי של שיטות מניעה על פני טכניקות חלופיות של חיסול זיהום לאחר התרחשותו הוא שעל ידי מניעת זיהום בשלב מוקדם, עובדי מעבדה יכולים להיות בטוחים שתרביות התאים שלהם בריאות ולא יהיו עלויות גבוהות הקשורות לטיהור אינקובטורים או השלכת תרביות תאים. סילוק מזהמים מיקופלסמה לאחר, למשל, אינו יעיל7. אם ניקח את הזמן בשלב מוקדם כדי להבטיח שאנשי המעבדה מאומנים כראוי, חדר תרביות התאים יהיה עצמאי, ונעשה שימוש בהליך סטנדרטי יחסוך זמן וכסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנות
- כללי
- יש ללבוש מעיל מעבדה נקי המיועד ללבישה רק בחדר תרביות התאים ולא בחלקים אחרים של המעבדה.
הערה: מעיל המעבדה אינו חייב להיות סטרילי. - לבשו כפפות חדשות שלא נגעו במשטחים אחרים. ודאו שהכפפות מתאימות היטב. כפפות ללא ניטריל ללא אבקה הן הטובות ביותר.
הערה: הכפפות אינן צריכות להיות סטריליות. - כדי להתכונן לעבודה, רססו את הכפפות, שרוולי מעיל המעבדה ופנים ארון הבטיחות הביולוגי ב-70% EtOH. נגבו את משטח העבודה ואת לוח הזכוכית לייבוש במגבת נייר שאינה מותירה סיבים.
הערה: שימוש ב-70% EtOH הורג חיידקים ביעילות הגבוהה ביותר16. מגבת הנייר לא צריכה להיות סטרילית. - שמרו אמבטיות מים בתוך חדר תרביות התאים והשתמשו בהן רק לחימום מצעי תרבית או הפשרת תאים. יש לנקז ולשטוף את אמבטיות המים אחת לשבוע, בהתאם להוראות היצרן לניקוי.
- יש ללבוש מעיל מעבדה נקי המיועד ללבישה רק בחדר תרביות התאים ולא בחלקים אחרים של המעבדה.
- בתוך ארון הבטיחות הביולוגי
- להגביל את מספר הפריטים המובאים לארון. אין להפריע לזרימת האוויר בתוך ארון הבטיחות הביולוגי על ידי חסימת הגריל הקדמי או האחורי.
הערה: ראו איור 1 לקבלת הסבר על האופן שבו האוויר זורם בתוך ארון. - רססו את כל הפריטים שהונחו בתוך הארון ב-70% EtOH ונגבו אותם לייבוש. התחילו בריסוס החלק העליון של בקבוק המדיה ועבדו כלפי מטה. באופן דומה, עם מגבת נייר נקייה, לנגב אותו יבש, בהדרגה עובד את הדרך לתחתית. אל תחזור למעלה לכיוון הכובע.
- אם הארון גדול מספיק כדי להכיל פיפטות סרולוגיות, ניתן למקם אותן בפנים, אחרת ניתן לאחסן אותן בכלי קיבול המותקן בצד החיצוני של הארון. בדוק את כל צד של פיפטה עטופה עבור חורים, קרעים או נקבים באריזה לפני השימוש. אין לקרוע את העטיפה. במקום זאת, מקלפים בעדינות את קצות העטיפה, מכניסים את הפיפטה הסרולוגית לעזר פיפטה, ומסירים את העטיפה בתנועה נוזלית אחת.
- אין לרחף מעל בקבוקים פתוחים או צלוחיות; הושיטו יד מעל בקבוקים או צלוחיות פתוחים, או פתחו פריטים מעל צמרות של פריטים שכבר נפתחו בארון הבטיחות הביולוגי.
הערה: זרימת האוויר בתוך הארון דוחפת כלפי מטה על משטח העבודה, כך שכל זיהום הקיים בשרוול, למשל, עלול להיכנס לתרביות התא. - אין לשפוך נוזלים. במקום זאת, הוסיפו אותם באמצעות פיפטה סרולוגית. לאחר השלמת המדיה, מערבבים היטב את התכולה ומתחילים את הבקבוק. כמו כן, הקפד לכלול תווית עבור מה המדיה הושלמה עם.
- להגביל את מספר הפריטים המובאים לארון. אין להפריע לזרימת האוויר בתוך ארון הבטיחות הביולוגי על ידי חסימת הגריל הקדמי או האחורי.
2. עבודה עם קווי תאים דבקים
- אם יש צורך בבקבוק פלסטיק, רססו את כל השקית והניחו אותה בתוך הארון.
- השתמש פיפטות זכוכית autoclaved או פיפטות פלסטיק סטרילי חד פעמי כדי לשאוף את התקשורת או פתרונות כביסה. הסר בזהירות את מכסה המתכת ממיכל האחסון. בודדו פיפטה אחת מזכוכית על ידי ניעור עדין של המיכל בזווית. כאשר מגיעים למיכל, הימנעו מלגעת בפיטות אחרות.
הערה: טפל בפיפטה שנבחרה מקצה אחד בלבד. - החלף במהירות את הפקקים על הבקבוקים בהקדם האפשרי. הניחו את הכובעים על משטח העבודה הפוכים כך שהחישוק לא ייגע במשטח העבודה. אין לתפוס את הכובע מלמעלה או למטה; במקום זאת, געו בכובעים מהצדדים.
- בעת שאיפת נוזלים, השתמשו בבקבוק מלכודת ואקום הממוקם מחוץ לארון במיכל משני על הרצפה.
הערה: אין לזרוק פסולת נוזלית לשקיות פסולת מסוכנות ביולוגית מכיוון שהשקיות ידלפו. פסולת תיווצר תוך כדי עבודה בתוך הארון. הזזת ידיים פנימה והחוצה מהארון לעתים קרובות מדי תפריע לזרימת האוויר. השאירו פסולת בתוך הארון באופן זמני. הניחו אותו בצד כדי שלא יפריע לעבודה. - רססו בנדיבות את הכפפות ב-70% EtOH בכל פעם שהן מתייבשות. שפשפו את הידיים זו בזו כדי שהכפפות לא יטפטפו רטובות.
- אם פיפטה סרולוגית נוגעת בטעות במשהו בארון, אל תהססו לזרוק אותה. התחילו מחדש עם פיפטה סרולוגית נקייה במקום להשתמש בכזו שעלולה להיות מזוהמת.
4. בדיקה ואחסון של תאים
- לפני הצבת התאים באינקובטור, בדקו כיצד הם נראים מתחת למיקרוסקופ. אם התאים הושעו ביסודיות, יש לראות תאים בודדים.
- אין לדבר, להתעטש, להשתעל או לנשום בכבדות לתוך האינקובטורים. פתחו וסגרו במהירות את דלתות האינקובטור. השארת דלתות פתוחות למשך זמן רב מהנדרש עלולה לאפשר למזהמים הנמצאים באוויר להיכנס לאינקובטורים.
הערה: חבישת מסכה בזמן עבודה בחדר תרביות תאים יכולה לעזור מכיוון שמיקופלסמה עשויה להיות נוכחת בפה האנושי. הימנעו משימוש בטלפונים סלולריים בחדר תרבית התא, שכן דיבור אינו מומלץ. - ודאו שהפקקים של כל הבקבוקים סגורים היטב לפני שאתם מוציאים את הבקבוקים מהארון.
- אחסנו את תרבית התאים בחושך בטמפרטורה של 4°C כאשר אינה בשימוש מכיוון שהיא רגישה לאור.
- רססו שוב את פנים הארון ב-70% EtOH לאחר סיום עבודת תרבית התאים ונגבו את המשטח יבש במגבת נייר. רוקנו את שקיות האשפה המסוכנות ביולוגית. חזור על תהליך זה והחלף את הכפפות בעת מעבר לקו תאים אחר.
5. עבודה עם קווי תאי השעיה
- עבור תאי תרחיף הגדלים בצלוחיות זכוכית, יש לוודא שהכפפות מרוססות היטב ב-70% EtOH, ואז נוגעים ברדיד האלומיניום עם הכפפות הרטובות ורססו רק את תחתית הבקבוק לפני הכנסתו לארון.
- בעת לקיחת דגימה לספירת תאים, הסר רק צינור אחד של 1.5 מ"ל מהמיכל שלו. אין לגעת בצינורות אחרים. הניחו את המכסה הפוך על משטח העבודה. אין לגעת בשפה הפנימית. טפל בו בזהירות מהצדדים והחלף אותו בסיום.
- הסר בזהירות את חתיכת רדיד אלומיניום מקופל כפול המכסה את כל הצוואר של הצלוחית. טפלו בבקבוק הזכוכית מלמטה בלבד – אל תיגעו בו מהצוואר – ברגע שנייר הכסף כבוי. השתמש פיפטה סרולוגית 1 מ"ל כדי לקחת דגימה לספירת תאים.
- אל תתנו לתקשורת לטפטף בצד הצלוחיות; אם כן, רססו מגבת נייר עם 70% EtOH ונקו אותה מיד.
- יש להדק את הפקקים ואת רדיד האלומיניום לפני הסרת בקבוקים או צלוחיות מארונות הבטיחות הביולוגיים.
6. דגירה של תאים
- השתמש באינקובטורים נפרדים עבור סוגי תאים שונים כדי למנוע זיהום צולב של סוגי התאים השונים.
7. איסוף פסולת נוזלית
- אספו פסולת נוזלית בבקבוק מלכודת ואקום הממוקם מחוץ לארון על הרצפה במיכל משני שכותרתו 'פסולת'.
הערה: הצינור מחובר למסנן ספיגת חלקיקים (HEPA) בעל יעילות גבוהה, המוחלף על בסיס חודשי.
8. ניקוי
- הסר את שקית הפסולת המסוכנת ביולוגית ושטוף את צלוחיות הזכוכית בהקדם האפשרי. הקפידו על פרוטוקול שטיפת זכוכית ליד הכיור. ראו קובץ משלים 1 לפרוטוקול הכביסה.
- בצעו אוטוקלאבל של כלי הזכוכית של תרבית התאים במקום לשלוח אותם למתקן שטיפת זכוכית. יש להפריד אותו מכלי זכוכית באזור המרכזי של המעבדה.
הערה: תאי SF-9 משאירים שפה של תאים מתים בצד הצלוחיות אם הזכוכית אינה משופשפת היטב. ראה קובץ משלים 1 עבור פרוטוקול autoclave.
9. ארגון
- ארגן את חדר תרביות התאים כך שכל האספקה תהיה ממוקמת באזור אחד, ובכך למזער את הצורך של חברי המעבדה לעזוב את החדר בחיפוש אחר אספקה.
- תייגו את כל בקבוקי הפלסטיק המשמשים לקצירת תאים ונעשה בהם שימוש חוזר בתרבית תאים לאחר מכן כ"לשימוש בתרבית תאים בלבד". השתמשו בבקבוקי תרבית התאים הייעודיים לסוג תא ספציפי אחד. אחסנו את הבקבוקים בחדר תרביות התאים לגישה נוחה.
10. זיהוי זיהום חיידקים, פטריות ומיקופלסמה
הערה: אי ביצוע זרימת העבודה לעיל עלול להוביל לזיהום חיידקי, פטריות ומיקופלסמה.
- תמיד לפני תחילת העבודה, לצפות צלוחיות עבור עכירות כבדה, צמיחה נוספת בצורה של כדורים מטושטשים, הצטברות צפופה של תאים בצד, כל אלה הם אינדיקטורים של זיהום.
הערה: עין מנוסה יכולה להבחין בין עכירות הנגרמת על ידי זיהום מיקרוביאלי לעומת התאים בפועל. בעוד התאים גורמים למדיה השקופה בדרך כלל להיראות עכורה, זיהום חיידקי גורם לעכירות כבדה בצבע לבן.- זהו חזותית זיהום עובש על-ידי ציון המראה של כדורים עגולים ומטושטשים שצפים במדיה (ראו איור 2).
- זהו חזותית זיהום חיידקי אם המדיה עכורה, לבנה או סוערת (ראו איור 2).
- זהה זיהום מיקופלסמה על ידי ביצוע בדיקת מיקופלסמה חודשית. בדיקה אחת מבוססת PCR מורה למשתמשים לקחת דגימה של 1.5 מ"ל של תאים, לבצע ספירת תאים באמצעות 10 μL, לדלל ל 0.08 x 106 תאים / מ"ל, לסובב את התאים, lyse התאים באמצעות המאגר הכלול בערכה, ולהסתובב למטה בפעם האחרונה. הסופרנאטנט מודגר עם פריימרים המגבירים מגוון מיני מיקופלסמה. הפעל ג'ל DNA כדי לדמיין את הלהקות. המשמעות של היעדר פסים היא שמיקופלסמה אינה מזוהה.
הערה: מזהם עיקרי זה יכול להימצא בפה האדם. מומלץ לבדוק זיהום מיקופלסמה בתאים לאחר הפשרתם ולפני השימוש בהם לניסויים. לאחר מכן, לפקח על התאים עבור זיהום mycoplasma פעם בחודש. חברות רבות מציעות ערכות בדיקת מיקופלסמה. בחר אחד מתאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אם לא מקפידים על הטכניקות והפרקטיקות הנכונות של תרביות תאים המתוארות במאמר זה, עלול להתרחש זיהום על ידי פטריות וחיידקים במעבדת תרביות תאי המחקר. איור 2 מראה צלוחיות שמכילות זיהום גם בתרביות המתרחפות וגם בתרביות הדבקות.
כאשר לא עוקבים אחר טכניקות אספטיות, זיהום עובש עלול להתרחש 2-3 ימים מאוחר יותר. כדורים מטושטשים עגולים הצפים במדיה מורגשים בתאי תרחיף, בעוד צמיחת עובש בתאים מחוברים ניתן לראות כתמים גדולים, לא סדירים, לבנים או ירוקים.
עבור חיידקים, זיהום הוא ציין למחרת. התקשורת סוערת, לבנה ומערפלת. הצבע הלבן אופייני לתאי חיידקים, שמתרבים הרבה יותר מהר מאשר קווי תאים. עין מנוסה מסוגלת להבדיל בין מדיה לא מזוהמת למדיה מזוהמת. עבור תאים מחוברים, ניתן להשוות בקבוק של מדיה שלא נפתחה עם בקבוק כדי לבדוק אם מערבולות כלשהן נראות בצלוחית.
בתוך ארון הבטיחות הביולוגי, יש לשמור על מספר הפריטים למינימום. הימנעו מהנחת פריטים על הגריל האחורי והקדמי (ראו איור 3). בארון זה, קבוצה של פיפטה, קצות, פיפטות זכוכית autoclaved, עזר פיפטה, טושים נמצאים בפנים. אזור העבודה באמצע ברור. שמירה על ארונות מאורגנים בדרך זו היא רעיון טוב. בנוסף, על המפעיל ללבוש מעיל מעבדה נקי וכפפות לפני תחילת העבודה. בקבוק תרסיס עם 70% EtOH צריך להישמר בקרבת מקום כדי שהמפעיל יוכל לרסס את הכפפות לעתים קרובות. העור מכוסה בכפפות או במעיל מעבדה. על המפעיל לכוונן את הכיסא כך שהזרועות שלו יהיו בזווית של 90° בעת עבודה בתוך הארון, והפריטים צריכים להיות בהישג יד בתוך הארון (ראו איור 4).
מינים רבים של מיקופלסמה ניתנים לזיהוי אמין באמצעות בדיקה מבוססת PCR. איור 5 מראה את התוצאות של בדיקת מיקופלסמה שלילית. הרצועה משמאל מראה את תקני המשקל המולקולרי של הדנ"א. ארבעת הפסים מימין הם פקדים חיוביים. לא מופיעים פסים מתחת לסוגי התאים שנבדקו מכיוון שמיקופלסמה לא זוהתה.
אם המדיה מכילה מחווני pH, היא תהיה אדומה עבור ערך ה- pH האופטימלי של תאים ב- 7.4. ברגע שהתאים גדלים, המדיה תשנה את צבעה מאדום לצהוב3. שינוי הצבע הזה יכול להתרחש גם אם חיידקים משתלטים על הבקבוק וגדלים יתר על המידה (איור 6). הצבע הצהוב מציין שה- pH נמוך. התבוננות בבקבוק מדיה חדש שלא נפתח ליד בקבוק היא דרך אובייקטיבית לצפות בזיהום בתאים המחוברים. עבור תרביות תרחיף, המשתמש יכול לצפות מקרוב בבקבוק עבור כל גידול צף במדיה או אם טבעת עבה של תאי חיידקים מגודלים נמצאת סביב החלק הפנימי של בקבוק הזכוכית. עבור שני סוגי התא, ניתן לקחת דגימה קטנה ולצפות בה תחת המיקרוסקופ. אם נצפים גידולים אחרים או צורות תאים אחרות, במיוחד אם התאים זזים, זהו אינדיקטור לזיהום (איור 7). ניקוי יסודי של ההמוציטומטר צריך להתבצע לפני ספירת תאים, שכן סוג זה של פסולת עשוי להיות נוכח רק על ההמוציטומטר ולא בתרביות התא עצמן.
הריח עשוי להיות אינדיקטור נוסף לזיהום באינקובטור. לצמיחת יתר של חיידקים יש ריח אופייני שמשתמש תרבית תאים מנוסה יבחין בו. הריח תמיד עולה בקנה אחד עם בקבוק מזוהם, אם כי בקבוק נגוע אחד לא תמיד יכול לגרום לאינקובטור כולו להריח.
זיהום עובש נוטה להיות נפוץ יותר בתאי HEK 293 S הגדלים בתרחיף. זיהום חיידקי שכיח יותר בתאי SF-9. ייתכן שהסיבה לכך היא שתאי RIC גדלים עם לחות, מה שמוביל להצטברות לחות באינקובטורים. תאי SF-9 גדלים ללא לחות, כך שהסביבה יבשה יותר. שיעור הזיהום בתרביות דבק נמוך משיעור הזיהום בתרביות תרחיף. זה יכול להיות בגלל גודל הבקבוק הקטן יותר, האופי שאינו ניתן לשימוש חוזר של הצלוחית, או המכסה המאוורר במקום השימוש ברדיד אלומיניום.
מיקופלסמה לא ניתן לצפות בעין בלתי ולא במיקרוסקופ אור רגיל, אם כי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור מיוחד יכול לזהות מיקופלסמה. יש להשתמש בערכת זיהוי מיקופלסמה כדי לבדוק את תרביות התאים מדי חודש. מינים רבים של מיקופלסמה ניתנים לזיהוי אמין באמצעות בדיקה מבוססת PCR. תיאור קצר על אופן ביצוע בדיקת PCR זו ניתן למצוא בסעיף הפרוטוקול, ומידע נוסף על מיקופלסמה ניתן למצוא בסעיף הדיון.
איור 1: כיצד זורם אוויר בארון בטיחות ביולוגית. ארונות בטיחות ביולוגיים מושכים אוויר מזוהם מהחדר עצמו ומהארון דרך הגריל הקדמי והאחורי. אוויר זה עובר מתחת למשטח העבודה המתכתי, לכיוון החלק האחורי של הארון, ועד לחלק העליון של היחידה שבה ממוקם מסנן HEPA. שם, האוויר עובר דרך הפילטר ומקבל סינון. האוויר הנקי הזה דוחף מטה על משטח העבודה. בשל האופן שבו זרימת האוויר המסונן נדחפת למטה בתוך הארון, מומלץ לא לרחף. לדוגמה, לא רצוי להחזיק שרוול מעל בקבוק פתוח ולהסתכן בכך שמזהמים פוטנציאליים יידחפו לתקשורת. יש לצמצם למינימום את מספר הפריטים המובאים לתוך הארון, ואין להניח פריטים על הגריל הקדמי או האחורי כדי לא להפריע לזרימת האוויר. הזזת זרועות פנימה והחוצה מהארון מהר מדי עלולה גם היא להפריע לזרימת האוויר. נוצר עבור NuAire, Inc., על ידי Jeff Kaphingst, Jeff the Designer, LLC. בשימוש באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תרחיף לא מזוהם ותאים דבקים ותאים מזוהמים בעובש או בחיידקים. התמונה הראשונה משמאל מכילה תאי חרקים (תאי SF-9) שאינם מזוהמים. התמונה השנייה מראה בקבוק נוסף של תאים אלה מזוהמים בעובש. הבקבוק השלישי היה מזוהם על ידי חיידקים, כפי שניתן לציין על ידי המראה העבה, הלבן והעכור. הצלוחיות השנייה והשלישית היו מזוהמות מכיוון שאף אחת מהטכניקות והפרקטיקות הנכונות של תרביות התאים לא בוצעה. כל הצלוחיות הוכנו באותו יום. למחרת נצפתה צמיחה לזיהום חיידקי ויומיים לאחר מכן לזיהום עובש. תאים דבקים לא מזוהמים מוצגים (תאי Hek293) יחד עם זיהום עובש וחיידקים בתרביות דבק. זיהום עובש מוצג בשורה השנייה בצלחת פטרי עגולה. התמונה נלקחה מראש המנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ארגון הקבינט של תרביות תאים. בתוך ארון הבטיחות הביולוגי, כמות הפריטים צריכה להישמר במינימום. יש להימנע מהנחת פריטים על הגריל האחורי והקדמי. בארון זה, קבוצה של פיפטה, קצות, פיפטות זכוכית autoclaved, עזר פיפטה, טושים נמצאים בפנים. אזור העבודה באמצע ברור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הדרך הנכונה עבור מפעיל לעבוד מתחת למכסה המנוע של הזרימה. מפעיל צריך ללבוש מעיל מעבדה נקי וכפפות לפני תחילת העבודה. בקבוק תרסיס עם 70% EtOH צריך להישמר בקרבת מקום כדי שהמפעיל יוכל לרסס את הכפפות לעתים קרובות. העור מכוסה בכפפות או במעיל המעבדה. המפעיל צריך להתאים את הכיסא שלו כך שהזרועות שלו יהיו בזווית של 90 מעלות בעת עבודה בתוך הארון. הפריטים צריכים להיות בהישג יד בתוך הארון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תוצאת בדיקת מיקופלסמה שלילית. מינים רבים של מיקופלסמה ניתנים לזיהוי אמין באמצעות בדיקה מבוססת PCR. הרצועה משמאל מראה את תקני המשקל המולקולרי של הדנ"א. ארבעת הפסים מימין הם פקדים חיוביים. לא מופיעים פסים מתחת לסוגי התאים שנבדקו מכיוון שמיקופלסמה לא זוהתה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: שינוי צבע מדיה רגיל מאדום לצהוב. מדיה של תרביות תאים משנה את הצבע מאדום לצהוב אם קיימים מחווני pH. הצבע הצהוב מציין שה- pH נמוך ויש להחליף את המדיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: מזהמים שנצפו במיקרוסקופ האור. אם גידולים אחרים או צורות תאים נצפים תחת מיקרוסקופ האור בעת ביצוע ספירת תאים, אז זה עשוי להיות אינדיקטור של זיהום. יש לציין כי יש לבצע ניקוי יסודי של ההמוציטומטר לפני ספירת התאים שכן פסולת מסוג זה עשויה להימצא רק על ההמוציטומטר ולא בתרביות התאים עצמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ משלים 1: נספח אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעוד זיהום הוא אחד החששות העיקריים בעת ביצוע עבודת תרבית תאים, הפרקטיקות והטכניקות המתוארות בכתב יד זה יסייעו להפחית את הסיכונים. השלבים הקריטיים כוללים לבישת מעיל מעבדה נקי, המשמש רק בחדר תרביות התא, שימוש בכפפות נקיות ונטולות אבקה המרוססות ב-70% EtOH לעתים קרובות ומוחלפות בעת מעבר בין קווי תאים, עידוד כל אדם לא לשתף בקבוקי מדיה, ניקוי יסודי של הארון לפני ואחרי סיום העבודה, פירוק מסודר של פיפטות סרולוגיות, הימנעות ממגע קרוב וממושך עם בקבוקים פתוחים או צלוחיות, אי שיתוף בקבוקי מדיה בין קווי תאים מרובים, ופתיחה וסגירה מהירה של דלתות האינקובטור. בנוסף, שטיפה ואוטומציה של כלי הזכוכית מבטיחים בקרת איכות, ובכך מפחיתים את ההסתברות להחדרת מזהמים חיצוניים. שיטות בקרת האיכות כוללות שימוש בסרט הדבקה אוטומטי כדי לציין אם המעקר הגיע לטמפרטורה הנכונה של 121 מעלות צלזיוס, תחזוקה מונעת שוטפת של הציוד, ובדיקה חזותית של הבקבוק כדי לוודא שהוא קרצוף כראוי18. נקודה חשובה נוספת היא להשתמש באינקובטורים נפרדים לסוגי תאים שונים כדי להבטיח שזיהום מסוג תא אחד לא יועבר לאחרים וגם כדי להבטיח שלא יתרחש זיהום צולב עם תאים.
זיהומים חיידקיים ופטרייתיים הם שני הפולשים הנפוצים ביותר בתרביות תאים. אחד המזהמים העיקריים, M. orale, הוא מין המיקופלסמה הנפוץ ביותר בפה האדם וגם "מייצג את המבודד הנפוץ ביותר המהווה 20%-40% מכלל זיהומי המיקופלסמה בתרביות תאים"4. במילים אחרות, אנשי המעבדה הם המקור העיקרי לזיהום זה. זה תמיד דאגה בחדר תרביות התא מאז מיקופלסמה הוא מיקרואורגניזם קטן, גדל לאט חסר דופן התא קשיח שיכול לעבור דרך 0.45 מיקרומטר מסננים4. מחקרים מראים כי שכיחות זיהום מיקופלסמה היא 15%-35% משורות תאים רציפות של בני אדם או בעלי חיים4. יתר על כן, הסטטיסטיקה מצביעה על כך שכ -5% עד 30% מקווי התאים בעולם מזוהמים במיקופלסמות6. למרבה הצער, מיקופלסמה עמידה לרוב האנטיביוטיקות המשמשות לתרבית תאים, וזיהום יכול להשפיע על הפיזיולוגיה של התא ועל חילוף החומרים 4,6. למרות שזיהום אינו מאט את חילוף החומרים בתאים, הוא עלול לזהם את המוצר הסופי6. זיהומים יכולים להישאר בסביבה מבלי שחברי המעבדה יבחינו בנזק לתאים. אם אכן יתרחש זיהום, העלות של הפשרת תאים חדשים, הזמן המושקע בהפצת התרביות החדשות, המדיה היקרה שבוזבזה, טיהור האינקובטורים וכמות הזמן שעמיתים מבלים בהמתנה להתחיל שוב את הניסויים שלהם, היא עצומה. המעבדה שלנו מעריכה את סך הזמן האבוד במשך שבועיים והעלות הכוללת הקשורה לזיהום של ביטוי חלבון תאי יונק אנושי טיפוסי של 8 ליטר היא 1,400 דולר. שיטות העבודה והטכניקות המתוארות בכתב יד זה מציעות אמצעי מניעה טובים כדי להפחית עלויות נוספות, תאים אבודים וזמן השבתה.
שינויים בשיטות אלה אינם מומלצים. יש להכשיר את כל חברי המעבדה לפני עבודתם בחדר תרביות התאים ולאחר מכן לקבל הכשרת רענון בכל שנה7. חברי המעבדה צריכים גם לארגן את חדר תרביות התאים כך שכל האספקה הדרושה תהיה באזור אחד, ובכך למזער את הצורך של חברי המעבדה לצאת מחדר תרביות התאים בחיפוש אחר אספקה.
מגבלות הטכניקות המוצגות נצפות אם הזיהום מגיע ממקורות חיצוניים כגון סרום, אינקובטורים, אוטוקלאבים לא תקינים, מעילי מעבדה מלוכלכים, או מקור התאים. פתרון בעיות של הטכניקה עשוי להיות נחוץ אם זיהום מתרחש למרות הקפדה על פרוטוקול זה. גורמים חיצוניים רבים יכולים לתרום לסוג זה של זיהום. חברי מעבדה צריכים להיות זהירים ולבדוק מקורות חיצוניים. לדוגמה, הרבה של סרום בקר עוברי (FBS) שנרכש מהספק עשוי להיות מזוהם עם mycoplasma. בהשוואה לשנות החמישים, זה עכשיו אירוע נדיר, אבל זה עדיין יכול לקרות6. יש לזרוק את כל בקבוקי המדיה אם מבחינים בזיהום כלשהו, ולהפעיל מחדש את הפרוטוקול על ידי הפשרת תאים חדשים ושימוש במדיה חדשה. ייתכן שהזיהום כבר היה קיים בתוך האינקובטור אם מדובר בעובש או בחיידקים; יש לבדוק את הצלוחיות האחרות בתוך אותה אינקובטור כדי לראות אם נצפתה צמיחת חיידקים או עובש. יש לזרוק את כל הצלוחיות המזוהמות ולטהר את האינקובטור. אם לא נמצא זיהום, יש לבדוק את האוטוקלאבה לאיתור שגיאות תקלות; ייתכן שכלי הזכוכית לא עברו אוטוקלאבינג כראוי מלכתחילה. סרט autoclave עשוי לשנות צבע למרות autoclave לא להגיע 121 ° C. לאחר מכן, יש לבדוק תאריכי תפוגה על התמיסות האנטיביוטיות המשמשות ; ייתכן שיהיה צורך לרכוש פתרונות חדשים. לבסוף, יש לקחת בחשבון את מקור התאים; האם הם היו מספקים אמינים במעבדה או הושאלו ממעבדה אחרת? תאים תמיד יש לרכוש מספק מעבדה מהימן ואין לשאול אותם ממעבדה אחרת. לבסוף, יש לכבס מעילי מעבדה כדי להבטיח את ניקיונם19. יש לשקול טיהור של אינקובטורים בכל פעם שבקבוק זוהם. אסור לאפשר לתאי חיידקים או נבגי עובש להתרבות ולהמשיך להפיץ זיהום.
שיטות קיימות משקפות את חיסול הזיהום. השיטות המתוארות בכתב יד זה מתמקדות במניעה ולא בביעור הזיהום. קיימים מספר נהלים לגבי שימוש באנטיביוטיקה להסרת מיקופלסמה20. עם זאת, השימוש באנטיביוטיקה הוא מסוכן מכיוון שהיא עלולה שלא לחסל לחלוטין את הזיהום ו"עלולה לאפשר לאורגניזמים עמידים להתפתח"12. למעשה, "72% מהתרביות שגדלו ברציפות באנטיביוטיקה נמצאו חיוביות למיקופלסמה, בעוד שרק 7% שגדלו בהיעדר אנטיביוטיקה היו נגועות"12. נתונים אלה מדגישים את הרעיון שבעוד שהשימוש באנטיביוטיקה מומלץ ויכול להועיל, שימוש יתר או הסתמכות מוחלטת על אנטיביוטיקה אינם מועילים. יתר על כן, שימוש באנטיביוטיקה להסרת זיהום עשוי רק לאפשר לבעיה להימשך. פתרונות אנטיביוטיים אינם נחוצים; אם הטכניקות במאמר זה הם אחריו, זיהום צריך להיות מונע בהצלחה.
שיטות העבודה והטכניקות המתוארות בכתב יד זה יכולות לשמש בעתיד כדי לשמור על סביבה אספטית בעת ביצוע בדיקת מיקופלסמה חודשית ובעת הכנת תאי חיידקים מוכשרים תוצרת בית. שני הפרוטוקולים דורשים סביבה נקייה, בדומה לעבודת תרבית תאים, כך שהתוצר הסופי אינו מזוהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחבר אין אינטרסים מנוגדים.
Acknowledgments
עבודה זו התאפשרה הודות למימון מהמכון הרפואי הווארד יוז (HHMI). ברצוננו להודות לראש המעבדה שלנו, ג'ו צ'ן, על קריאת כתב היד ועל תמיכתה המתמשכת, לדונה טאלנט על העריכות וההערות המועילות שלה, ולג'ף הנפלד מהמחלקה לטכנולוגיית מידע באוניברסיטת רוקפלר על עזרתו ברכיב הווידאו של כתב יד זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS | Gibco | 14-190-144 | |
| DMEM F-12 Media | ATCC | 30-2006 | |
| Glass Baffled Flask | Pyrex | 09-552-40 | |
| Glass Pipettes | Fisher | 13-678-6B | |
| Pipette Aid | Drummond | 13-681-15A | |
| Serological Pipette | Corning | 07-200-573 | |
| T75 flask | Corning | 07-202-004 | |
| Trypsin | Gibco | 25-300-054 | |
| *Items may vary because this video is about general cell culture techniques |
References
- Johnson, Z. L., Chen, J. Structural basis of substrate recognition by the multidrug resistance protein MRP1. Cell. 168 (6), 1075-1085 (2017).
- Capes-Davis, A., et al. Cell lines as biological models: practical steps for more reliable research. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).
- Segeritz, C. P., Vallier, L. Cell culture: growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
- Lincoln, C. K., Gabridge, M. G. Cell culture contamination: sources, consequences, prevention, and elimination. Methods in Cell Biology. 57, 49-65 (1998).
- Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of mycoplasma contamination in cell culture. Cell Journal. 13 (4), 203-212 (2012).
- Stacey, G. N.
- Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R.
- Barth, O. M., Majerowicz, S. Rapid detection by transmission electron microscopy of mycoplasma contamination in sera and cell cultures. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 83 (1), 63-66 (1988).
- Mirabelli, P., Coppola, L., Salvatore, M. Cancer cell lines are useful model systems for medical research. Cancers. 11 (8), 1098 (2019).
- Gabelli, S., Zhao, C., Oberst, J. A cell culture master class: What your cells wish they could tell you. Science. , Available from: https://www.science.org/content/webinar/cell-culture-master-class-your-cells-wish-they-could-tell-you (2020).
- Langdon, S. P. Cell culture contamination: an overview. Methods in Molecular Medicine. 88, 309-317 (2004).
- Babic, Z., et al. Meta-research: Incidences of problematic cell lines are lower in papers that use RRIDs to identify cell lines. eLife. 8, e41676 (2019).
- Visconti, P., et al. Short tandem repeat profiling for the authentication of cancer stem-like cells. International Journal of Cancer. 148 (6), 1489-1498 (2021).
- Horbach, S. P. J. M., Halffman, W. The ghosts of HeLa: How cell line misidentification contaminates the scientific literature. PLoS One. 12 (10), 0186281 (2017).
- Why 70% isopropyl alcohol is a better disinfectant than 99% isopropyl alcohol when it comes to Covid-19. MunGlobal. , Available from: https://munglobal.com.au/resources/knowledge-base/pathogens/why-70-isopropyl-alcohol-is-a-better-disinfectant-than-99-isopropyl-alcohol/#:~:text=Due%20to%20the%20concentration%20difference,potency%20of%20its%20antimicrobial%20properties (2023).
- United States Department of Agriculture. Processing and Safety. Food Safety Publications. , Available from: https://www.ars.usda.gov/ARSUserFiles/60701000/FoodSafetyPublications/p328.pdf (2004).
- Sterilizing Practices. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/sterilizing-practices.html (2023).
- Coté, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1.3 (2001).
- Uphoff, C. C., Drexler, H. G. Eradication of Mycoplasma contamination from cell cultures. Current Protocols in Molecular Biology. 106, 1-12 (2014).
- Bykowski, T., Stevenson, B.
- Penning, S. D. How a Class II, Type A2 Biosafety Cabinet Works. Nuaire. , Available from: https://www.nuaire.com/resources/class-ii-type-a2-biosafety-cabinet-how-it-works-article (2020).
- Phelan, K., May, K. M. Mammalian cell tissue culture techniques. Current Protocols in Pharmacology. 73, 1-23 (2016).
