Summary
Detta protokoll presenterar viktiga cellodlingstekniker och metoder som ska användas i forskningscellodlingslaboratoriet för att undvika kontaminering av svampar och bakterier. Inom kategorin bakterier kommer särskild vikt att läggas vid att förhindra mykoplasmakontaminering.
Abstract
Cellodling är en känslig färdighet som är nödvändig för odling av människor, djur och insektsceller eller andra vävnader i en kontrollerad miljö. Målet med protokollet är att betona de korrekta tekniker som används i ett forskningslaboratorium för att förhindra kontaminering från svampar och bakterier. Särskild vikt läggs vid att undvika mykoplasmakontaminering, ett stort problem i cellodlingsrummet på grund av dess lilla storlek och resistens mot de flesta antibiotika som används för cellodling. Samma tekniker säkerställer kontinuerlig tillväxt och upprätthåller friska celler. För både nya och erfarna cellodlingsanvändare är det viktigt att konsekvent följa dessa bästa metoder för att minska risken för kontaminering. En gång om året bör laboratorierna granska bästa praxis för cellodling och följa upp med en diskussion eller ytterligare utbildning vid behov. Att vidta tidiga åtgärder för att förhindra kontaminering i första hand kommer att spara tid och pengar, jämfört med att städa upp efter förorening. Universell bästa praxis håller cellkulturer friska, vilket minskar behovet av att ständigt tina nya celler, köpa dyra cellodlingsmedier och minska mängden inkubatordekontaminering och driftstopp.
Introduction
Cellodling har många användningsområden i forskningslaboratoriet. Sedan cellodlingens ursprung i början av 20-talet har cellinjer hjälpt till att främja vetenskapen. Cellinjer har flera fördelar; Olika cellinjer kan hjälpa forskare att studera cellbiologi, producera baculovirus för vidare studier eller producera stora mängder av ett protein av intresse, för att nämna några1. Några ytterligare användningsområden inkluderar att studera vävnadstillväxt, hjälpa till att främja vaccinutveckling, toxikologisk forskning, studera genernas roll i friska organismer och sjuka modeller och produktion av hybridcellinjer 2,3. Cellinjer kan också möjliggöra läkemedelsproduktion3. Korrekt aseptisk teknik är nödvändig när man arbetar med cellinjer; De metoder och tekniker som beskrivs i detta manuskript är tillämpliga på forskningslaboratorier där cellodlingsarbete utförs. Andra laboratoriemiljöer diskuteras inte.
Kontaminering är ofta det främsta problemet när man utför cellodlingsarbete. I samband med detta dokument hänvisar kontaminering i allmänhet till svampar och bakterier. Det övergripande målet med den metod som beskrivs i detta dokument är att noggrant beskriva de bästa metoderna för att undvika kontaminering. Alla laboratoriemedlemmar bör följa dessa metoder när de arbetar i ett forskningslaboratoriums cellodlingsrum. Laboratorierna bör se till att alla arbetstagare aktivt deltar i användningen av dessa bästa metoder för att förhindra kontaminering. Kunskapen om rätt praxis och tekniker hjälper till att säkerställa att cellkulturer förblir livskraftiga, friska och fria från kontaminering. Utvecklingen av denna teknik bygger på litteraturforskning, sju års erfarenhet av att arbeta med cellkulturer och behovet av en metod som både nybörjare och erfarna cellodlingsarbetare kan hänvisa till på årsbasis.
Det finns ett behov av en tydlig, standardiserad teknik som alla forskningscellodlingslaboratorier bör följa. Mycket av litteraturen om cellodlingskontaminering diskuterar detektion av mykoplasma, aseptiska tekniker, föroreningskällor, eliminering av föroreningar och förebyggande genom användning av antibiotika och regelbunden testning 4,5,6,7,8. Även om denna information är till hjälp, finns det inga videor i litteraturen som visar de korrekta cellodlingsteknikerna man bör följa. Fördelen med de metoder som presenteras jämfört med alternativa tekniker är fokus på att förhindra kontaminering innan det händer, snarare än att upptäcka och korrigera misstag senare. Dessutom är en grundlig demonstration av aseptiska tekniker, en diskussion om att förhindra svamp- och bakterietillväxt och information om luftflöde i biosäkerhetsskåp värdefulla för både nybörjare och erfarna cellodlingsarbetare.
Bakterier och svampar är de två vanligaste typerna av föroreningar. Inom bakteriekategorin är mykoplasma ett stort problem på grund av dess lilla storlek och förmåga att föröka sig medan den förblir obemärkt. De är självreplikerande organismer utan styv cellvägg som är beroende av eukaryota celler för att växa. De har nedsatt metabolisk förmåga och kan föröka sig kraftigt medan de förblir okända vid rutinmässig visuell inspektion av cellkulturer och regelbunden mikroskopisk analys, även om transmissionselektronmikroskopi kan detektera mykoplasma 9,10. Dessutom kan de passera genom mikrobiologiska filter10. Cellodlingsmedium ger mykoplasma näringsämnen, även om tyvärr komplettering av media med antibiotika inte påverkar mykoplasma10. Man bör notera att det i allmänhet inte är nödvändigt att komplettera media med antibiotika; Lämpliga tekniker bör räcka för att hålla föroreningar i schack. Infektion med mykoplasma leder inte till omedelbar celldöd, men det är oroande för forskare eftersom det påverkar datareproducerbarhet och kvalitet.
All laboratoriepersonal bör strikt följa god cellodlingspraxis. Kulturer bör testas för mykoplasma efter att de nyligen har köpts, medan de för närvarande odlas, före kryokonservering och när de tinas från flytande kväve 2,10. Olika tester finns tillgängliga på marknaden med polymeraskedjereaktion (PCR), enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) eller immunfärgning. 3 Litteraturen indikerar att "humana isolat representerar en stor andel av de mykoplasmaföroreningar som finns i cellodling"5. Även om mer än 200 mykoplasmaarter har beskrivits, står cirka sex av dessa för de flesta infektioner. Dessa sex arter är M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale och Acholeplasma laidlawii10. Som med andra typer av föroreningar tar luft och aerosoler dessa in i cellkulturer5. Detta upprepas i andra artiklar eftersom "den mänskliga operatören är potentiellt den största faran i laboratoriet"7. Även om detta görs genom mänskliga fel kan risken elimineras om ett standardförfarande följs. Utsöndring från personal är inte begränsad till endast mykoplasmakontaminering; Cellkulturer i ett laboratorium är vanligtvis infekterade med samma mykoplasmaarter, vilket indikerar att kontaminering sprider sig från en kolv till en annan på grund av felaktiga cellodlingstekniker10.
Förebyggandet av korskontaminering är också en annan anledning till att lämpliga cellodlingstekniker bör följas. Det noteras att minst 15%-18% av cellinjerna över hela världen kan vara korskontaminerade eller felidentifierade11,12. Förutom att testa cellinjer för mykoplasmakontaminering bör de också testas för korskontaminering10. För mänskliga cellinjer är cellinjeautentisering med en billig DNA-baserad teknik som kallas kort tandemupprepning (STR) profilering den nuvarande internationella referensstandarden, eftersom det är ett enkelt sätt att bekräfta cellinjeidentitet 2,10,13,14. STR kan identifiera felmärkta eller korskontaminerade cellinjer, men det kan inte upptäcka felaktigt vävnadsursprung10,13,14. Forskningsdatas giltighet kan äventyras om cellinjer är felmärkta, felaktigt identifierade eller förorenade13. I likhet med andra typer av kontaminering kan korskontaminering uppstå på grund av dålig teknik som orsakar aerosoler att spridas, felaktig kontakt som leder till att fel celltyp kommer in i en kolv eller använder samma mediaflaska och reagens med olika cellinjer10. Ingen delning av mediaflaskor bör ske; Att dela en flaska media mellan två olika cellinjer kan göra det möjligt att blanda dessa cellpopulationer, vilket leder till att den snabbare växande celltypen helt tar över kolven. Denna ersättning märks inte och leder till felmärkning och felidentifiering2. En cellinje kan också misstas för en annan om kulturer förväxlas under hantering eller märkning10. Noggrann uppmärksamhet bör ägnas åt att hålla reagens, media och kolvar åtskilda från varandra. Varje labbmedlem bör ha sina egna mediaflaskor; Ingen delning bör ske mellan labbmedlemmar. Cellinjer själva bör köpas från en kvalificerad cellbank och leverantör. Laboratorier bör inte dela celler. Studier visar att, även om STR- och mykoplasmatester regelbundet används, har många forskningsartiklar i litteraturen redan använt felidentifierade eller förorenade cellinjer15. Att sikta igenom forskningen för att hitta dessa problematiska papper och retroaktivt informera läsarna om denna fråga är besvärligt. Förebyggande är det bästa sättet att säkerställa att detta problem inte uppstår i första hand.
Den enkla åtgärden att spruta föremål med 70% EtOH kan döda organismer; 70% EtOH fungerar genom att denaturera proteiner och lösa lipider i de vanligaste förorenande organismerna, inklusive bakterier och svampar16. Studier har visat att 70% är den mest effektiva koncentrationen; ytproteiner koagulerar inte snabbt med 70% EtOH så att de kan komma in i cellen, medan vattnet det innehåller är nödvändigt för denatureringsprocessen av proteiner. På grund av koncentrationsskillnaden mellan vatten och alkohol på vardera sidan av cellväggen kommer 70% EtOH in i cellen för att denaturera både enzymatiska och strukturella proteiner. Om mögeltillväxt observeras i kolvar, måste hela inkubatorn dekontamineras genom att först spruta den med 70% EtOH och torka den torr, följt av en 16 h inkubation över natten vid 60 °C17. Detta dödar de flesta mögel och eventuella bakterier.
Den största fördelen med förebyggande metoder jämfört med alternativa tekniker för att eliminera kontaminering efter det inträffar är att genom att förhindra kontaminering tidigt kan laboratoriearbetare vara säkra på att deras cellkulturer är friska och det kommer inte att finnas några höga kostnader i samband med dekontaminering av inkubatorer eller kassering av cellkulturer. Elimineringen av mykoplasmaföroreningar efter till exempel är inte effektiv7. Att ta sig tid tidigt för att säkerställa att laboratoriepersonalen är ordentligt utbildad, cellodlingsrummet är fristående och ett standardförfarande används sparar tid och pengar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelser
- Allmänt
- Bär en ren labbrock avsedd att bäras endast i cellodlingsrummet och inga andra delar av laboratoriet.
OBS: Labrocken behöver inte vara steril. - Använd nya handskar som inte har rört några andra ytor. Se till att handskarna sitter tätt. Nitril, puderfria handskar är bäst.
OBS: Handskarna behöver inte vara sterila. - För att förbereda dig för arbete, spraya handskarna, labbrockärmarna och insidan av det biologiska säkerhetsskåpet med 70% EtOH. Torka av arbetsytan och glaspanelen med en luddfri pappershandduk.
OBS: Användning av 70% EtOH dödar bakterier med högsta effektivitet16. Pappershandduken behöver inte vara steril. - Håll vattenbad inne i cellodlingsrummet och använd endast dessa för uppvärmning av odlingsmedier eller upptining av celler. Töm och tvätta vattenbaden en gång i veckan, följ tillverkarens instruktioner för rengöring.
- Bär en ren labbrock avsedd att bäras endast i cellodlingsrummet och inga andra delar av laboratoriet.
- Inuti det biologiska säkerhetsskåpet
- Begränsa antalet föremål som tas in i skåpet. Avbryt inte luftflödet inuti det biologiska säkerhetsskåpet genom att blockera de främre eller bakre gallren.
Se figur 1 för en förklaring av hur luft strömmar inuti ett skåp. - Spraya alla föremål placerade inuti skåpet med 70% EtOH och torka dem torra. Börja med att spraya toppen av mediaflaskan och arbeta ner. På samma sätt, med en ren pappershandduk, torka den torr och arbeta gradvis vägen till botten. Gå inte tillbaka upp mot locket.
- Om skåpet är tillräckligt stort för att rymma serologiska pipetter kan de placeras inuti, annars kan de förvaras i en behållare monterad på utsidan av skåpet. Kontrollera vardera sidan av den inneslutna pipetten för hål, revor eller punkteringar i förpackningen före användning. Riv inte av omslaget. Skala istället försiktigt ändarna på omslaget, sätt in den serologiska pipetten i ett pipetthjälpmedel och ta bort omslaget i en flytande rörelse.
- Håll inte muspekaren över öppna flaskor eller kolvar; Sträck dig över öppna flaskor eller kolvar, eller öppna föremål över toppen av redan öppnade föremål i det biologiska säkerhetsskåpet.
OBS: Luftflödet inuti skåpet trycker ner på arbetsytan, så eventuell förorening som finns på hylsan kan till exempel komma in i cellkulturerna. - Häll inte vätskor. Lägg istället till dem med en serologisk pipett. Efter komplettering av mediet, blanda innehållet noggrant och initiala flaskan. Se också till att inkludera en etikett för vad media kompletterades med.
- Begränsa antalet föremål som tas in i skåpet. Avbryt inte luftflödet inuti det biologiska säkerhetsskåpet genom att blockera de främre eller bakre gallren.
2. Arbeta med vidhäftande cellinjer
- Om en plastkolv behövs, spraya hela påsen och placera den inuti skåpet.
- Använd autoklaverade glaspipetter eller sterila plastpipetter för engångsbruk för att aspirera media eller tvättlösningar. Ta försiktigt bort metalllocket från förvaringsbehållaren. Isolera en glaspipett genom att försiktigt skaka behållaren i en vinkel. Undvik att vidröra andra pipetter när du når behållaren.
OBS: Hantera endast den valda pipetten från ena änden. - Byt snabbt ut locken på flaskorna så snart som möjligt. Placera locken på arbetsytan upp och ner så att fälgen inte vidrör arbetsytan. Ta inte tag i locket uppifrån eller nerifrån; Rör istället kepsarna från sidorna.
- Vid aspirering av vätskor, använd en vakuumfällkolv placerad utanför skåpet i en sekundär behållare på golvet.
OBS: Kasta inte flytande avfall i påsar för biologiskt farligt avfall eftersom påsarna kommer att läcka. Avfall kommer att skapas under arbetet inuti skåpet. Att flytta händerna in och ut ur skåpet för ofta kommer att avbryta luftflödet. Lämna eventuellt avfall i skåpet tillfälligt. Placera den åt sidan så att den inte stör arbetet. - Spraya handskarna generöst med 70% EtOH varje gång de blir torra. Gnugga händerna mot varandra så att handskarna inte droppar våta.
- Om en serologisk pipett felaktigt berör något i skåpet, tveka inte att kasta ut det. Börja om på nytt med en ren serologisk pipett istället för att använda en som kan vara förorenad.
4. Kontrollera och lagra celler
- Innan du placerar celler i inkubatorn, kontrollera hur de ser ut under mikroskopet. Om cellerna har suspenderats grundligt bör enstaka celler observeras.
- Tala, nysa, hosta eller andas inte tungt i inkubatorerna. Öppna och stäng inkubatordörrarna snabbt. Att lämna dörrar öppna längre än nödvändigt kan tillåta föroreningar som finns i luften att komma in i inkubatorerna.
OBS: Att bära en mask när du arbetar i cellodlingsrummet kan hjälpa eftersom mykoplasma kan finnas i människans mun. Undvik användning av mobiltelefoner i cellodlingsrummet, eftersom det inte rekommenderas att prata. - Se till att locken på alla flaskor är tätt stängda innan du tar bort flaskorna från skåpet.
- Förvara cellodlingsmedier i mörker vid 4 °C när de inte används eftersom de är ljuskänsliga.
- Spraya insidan av skåpet med 70% EtOH igen efter att cellodlingsarbetet är klart och torka ytan torr med en pappershandduk. Töm avfallspåsarna för biologisk fara. Upprepa denna process och byt ut handskarna när du byter till en annan cellinje.
5. Arbeta med upphängda cellinjer
- För suspensionsceller odlade i glasflaskor, se till att handskarna sprayas noggrant med 70% EtOH, rör sedan aluminiumfolien med de våta handskarna och spraya endast kolvens botten innan du placerar den inuti skåpet.
- När du tar ett prov för cellräkning, ta bort endast ett 1,5 ml rör från behållaren. Rör inte vid några andra rör. Placera locket upp och ner på arbetsytan. Rör inte vid den inre fälgen. Hantera den försiktigt från sidorna och byt ut den när du är klar.
- Ta försiktigt bort den dubbelvikta aluminiumfolien som täcker hela kolvens hals. Hantera endast glaskolven från botten - rör den inte från halsen - när folien är av. Använd en 1 ml serologisk pipett för att ta ett prov för cellräkning.
- Låt inte media droppa ner på kolvarnas sida; om det gör det, spraya en pappershandduk med 70% EtOH och rengör den direkt.
- Se till att lock och aluminiumfolie är åtdragna innan du tar bort flaskor eller kolvar från de biologiska säkerhetsskåpen.
6. Cellinkubation
- Använd separata inkubatorer för olika celltyper för att förhindra korskontaminering av de olika celltyperna.
7. Insamling av flytande avfall
- Samla flytande avfall i en vakuumfällkolv placerad utanför skåpet på golvet i en sekundär behållare märkt "Avfall".
OBS: Slangen är ansluten till ett högeffektivt partikelabsorberande (HEPA) filter, som byts ut varje månad.
8. Rensning
- Ta bort avfallspåsen om biologisk fara och tvätta glasflaskorna så snart som möjligt. Håll ett glastvättprotokoll vid diskbänken. Se tilläggsfil 1 för tvättprotokollet.
- Autoklavera cellodlingsglaset istället för att skicka det till en glastvättanläggning. Håll det åtskilt från glas i labbets huvudområde.
OBS: SF-9-celler lämnar en kant av döda celler på sidan av kolvarna om glaset inte skrubbas väl. Se tilläggsfil 1 för autoklavprotokollet.
9. Organisation
- Organisera cellodlingsrummet så att alla förnödenheter finns i ett område, vilket minimerar behovet av labbmedlemmar att lämna rummet på jakt efter förnödenheter.
- Märk alla plastflaskor som används för att skörda celler och återanvänds i cellodling efteråt som "Endast för cellodlingsanvändning". Använd de angivna cellodlingsflaskorna för en specifik celltyp. Förvara flaskorna i cellodlingsrummet för enkel åtkomst.
10. Identifiera bakterier, svampar och mykoplasmakontaminering
Om du inte följer arbetsflödet ovan kan det leda till kontaminering av bakterier, svampar och mykoplasma.
- Alltid innan du börjar arbeta, observera kolvar för kraftig grumlighet, extra tillväxt i form av fuzzy bollar och täta ansamlingar av celler på sidan, som alla är indikatorer på kontaminering.
OBS: Ett erfaret öga kan se skillnaden mellan grumlighet orsakad av mikrobiell kontaminering jämfört med de faktiska cellerna. Medan celler orsakar att det normalt klara mediet verkar grumligt, orsakar bakteriell kontaminering stor grumlighet med vit färg.- Identifiera mögelföroreningar visuellt genom att notera utseendet på runda, fuzzy bollar som flyter i media (se figur 2).
- Identifiera bakteriell kontaminering visuellt om mediet är grumligt, vitt eller turbulent (se figur 2).
- Identifiera mykoplasmakontaminering genom att göra ett månatligt mykoplasmatest. Ett PCR-baserat test instruerar användare att ta ett 1,5 ml prov av celler, utföra ett celltal med 10 μL, späd till 0,08 x 106 celler / ml, snurra ner cellerna, lysera cellerna med bufferten i satsen och snurra ner en sista gång. Supernatanten inkuberas med primrar som förstärker en rad mykoplasmaarter. Kör en DNA-gel för att visualisera banden. Inga band betyder att mykoplasma inte identifieras.
OBS: Denna huvudsakliga förorening kan finnas i människans mun. Det är god praxis att testa för mykoplasmakontaminering i celler efter upptining av dem och innan de används för experiment. Övervaka sedan cellerna för mykoplasmakontaminering en gång i månaden. Många företag erbjuder mykoplasma testkit. Välj en som är lämplig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de korrekta cellodlingsteknikerna och metoderna som beskrivs i detta dokument inte följs kan kontaminering av svampar och bakterier uppstå i forskningscellodlingslaboratoriet. Figur 2 visar kolvar som innehåller kontaminering i både suspensions- och vidhäftningskulturerna.
När man inte följer aseptiska tekniker kan mögelkontaminering inträffa 2-3 dagar senare. Runda fuzzy bollar som flyter i media är märkbara i suspensionsceller, medan mögeltillväxt i bifogade celler kan observeras som stora, oregelbundna, vita eller gröna fläckar.
För bakterier observeras kontaminering följande dag. Media är turbulent, vitt och grumligt. Den vita färgen är typisk för bakterieceller, som multiplicerar mycket snabbare än cellinjer. Ett erfaret öga kan se skillnaden mellan icke-förorenade medier och förorenade medier. För bifogade celler kan man jämföra en flaska oöppnat media med en kolv för att kontrollera om någon turbulens ses i kolven.
Inuti det biologiska säkerhetsskåpet bör antalet föremål hållas på ett minimum. Undvik att placera föremål på bak- och frontgaller (se figur 3). I detta skåp finns en uppsättning pipetter, spetsar, autoklaverade glaspipetter, ett pipetthjälpmedel och markörer inuti. Arbetsområdet i mitten är tydligt. Att hålla skåp organiserade på detta sätt är en bra idé. Dessutom bör operatören bära en ren labbrock och handskar innan arbetet påbörjas. En sprayflaska med 70% EtOH bör förvaras i närheten så att operatören kan spraya sina handskar ofta. Huden är täckt av handskar eller en labbrock. Operatören bör justera sin stol så att armarna är i 90 ° vinkel när de arbetar inuti skåpet, och föremålen ska vara inom räckhåll inuti skåpet (se figur 4).
Många arter av mykoplasma kan identifieras på ett tillförlitligt sätt med hjälp av en PCR-baserad analys. Figur 5 visar resultaten av ett negativt mykoplasmatest. Bandet till vänster visar molekylviktsstandarderna för DNA. De fyra banden till höger är positiva kontroller. Inga band visas under de testade celltyperna eftersom mykoplasma inte detekterades.
Om mediet innehåller pH-indikatorer blir det rött för det optimala pH-värdet för celler vid 7,4. När cellerna växer kommer mediet att ändra färg från rött till gult3. Denna färgförändring kan också uppstå om bakterier tar över kolven och växer över (figur 6). Den gula färgen indikerar att pH är lågt. Att observera en ny, oöppnad flaska media bredvid en kolv är ett objektivt sätt att observera kontaminering i bifogade celler. För suspensionskulturer kan användaren noga observera kolven för eventuella tillväxter som flyter i mediet eller om en tjock ring av övervuxna bakterieceller finns runt insidan av glaskolven. För båda celltyperna kan ett litet prov tas och observeras under mikroskopet. Om andra tillväxter eller cellformer observeras, speciellt om cellerna rör sig, är detta en indikator på kontaminering (figur 7). En grundlig rengöring av hemocytometern bör utföras före cellräkning, eftersom denna typ av skräp endast kan vara närvarande på hemocytometern och inte i själva cellkulturerna.
Lukten kan vara en annan indikator på förorening i en inkubator. Bakteriell överväxt har en typisk lukt som en erfaren cellodlingsanvändare kommer att märka. Lukten sammanfaller alltid med en förorenad kolv, även om en infekterad kolv inte alltid kan orsaka att hela inkubatorn luktar.
Mögelförorening tenderar att vara vanligare i HEK 293 S-celler odlade i suspension. Bakteriell kontaminering är vanligare i SF-9-celler. Detta kan bero på att RIC-celler odlas med fuktighet, vilket leder till fuktackumulering i inkubatorerna. SF-9-celler odlas utan fuktighet, så miljön är torrare. Kontamineringshastigheten i vidhäftande kulturer är mindre än föroreningshastigheten i suspensionskulturer. Detta kan bero på den mindre kolvstorleken, kolvens icke-återanvändbara natur eller det ventilerade locket istället för användningen av aluminiumfolie.
Mykoplasma kan inte observeras med blotta ögat eller med ett vanligt ljusmikroskop, även om specialiserad transmissionselektronmikroskopi kan detektera mykoplasma. En mykoplasmaidentifieringssats bör användas för att testa cellkulturerna varje månad. Många arter av mykoplasma kan identifieras på ett tillförlitligt sätt med hjälp av en PCR-baserad analys. En kort beskrivning om hur detta PCR-test utförs finns i protokollavsnittet, och mer information om mykoplasma finns i diskussionsavsnittet.
Figur 1: Hur luft strömmar i ett biosäkerhetsskåp. Biologiska säkerhetsskåp drar förorenad luft från själva rummet och från skåpet genom de främre och bakre grillarna. Denna luft går under metallarbetsytan, mot baksidan av skåpet och upp till toppen av enheten där ett HEPA-filter är beläget. Där passerar luften genom filtret och filtreras. Denna rena luft trycker ner på arbetsytan. På grund av hur flödet av filtrerad luft trycks ner inuti skåpet är det bra att inte sväva. Det är till exempel inte önskvärt att ha en hylsa ovanpå en öppen flaska och riskera att eventuella föroreningar trycks in i media. Antalet föremål som tas in i skåpet bör hållas på ett minimum, och föremål ska inte placeras på fram- eller bakgrillen för att inte avbryta luftflödet. Att flytta armarna in och ut ur skåpet för snabbt kan också störa luftflödet. Skapad för NuAire, Inc., av Jeff Kaphingst, Jeff the Designer, LLC. Används med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Icke-förorenad suspension och vidhäftande celler och celler förorenade med mögel eller bakterier. Den första bilden till vänster innehåller insektsceller (SF-9-celler) som inte är förorenade. Den andra bilden visar en annan kolv av dessa celler förorenade med mögel. Den tredje kolven var förorenad av bakterier, vilket kan noteras av det tjocka, vita, grumliga utseendet. Den andra och tredje kolven var förorenade eftersom ingen av de korrekta cellodlingsteknikerna och metoderna följdes. Alla kolvar bereddes samma dag. Tillväxt observerades nästa dag för bakteriell kontaminering och 2 dagar senare för mögelförorening. Icke-förorenade vidhäftande celler visas (Hek293-celler) tillsammans med mögel och bakteriell kontaminering i vidhäftande kulturer. Mögelförorening visas i andra raden i en rund petriskål. Bilden är tagen från toppen av skålen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Organisation av cellodlingsskåp. Inuti det biologiska säkerhetsskåpet bör mängden föremål hållas på ett minimum. Att placera föremål på bak- och frontgrillarna bör undvikas. I detta skåp finns en uppsättning pipetter, spetsar, autoklaverade glaspipetter, ett pipetthjälpmedel och markörer inuti. Arbetsområdet i mitten är tydligt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Det korrekta sättet för en operatör att arbeta under flödeshuven. En operatör bör bära en ren labbrock och handskar innan arbetet påbörjas. En sprayflaska med 70% EtOH bör förvaras i närheten så att operatören kan spraya sina handskar ofta. Huden täcks av handskarna eller labbrocken. Operatören bör justera sin stol så att armarna är i 90 ° vinkel när de arbetar inuti skåpet. Föremål ska vara inom räckhåll inuti skåpet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Ett negativt mykoplasmatestresultat. Många arter av mykoplasma kan identifieras på ett tillförlitligt sätt med hjälp av en PCR-baserad analys. Bandet till vänster visar molekylviktsstandarderna för DNA. De fyra banden till höger är positiva kontroller. Inga band visas under de testade celltyperna eftersom mykoplasma inte detekterades. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Normal mediefärg ändras från rött till gult. Cellodlingsmedia ändrar färgen från rött till gult om pH-indikatorer är närvarande. Den gula färgen indikerar att pH är lågt och mediet bör bytas ut. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Föroreningar observerade under ljusmikroskopet. Om andra tillväxter eller cellformer observeras under ljusmikroskopet medan cellräkningar utförs, kan detta vara en indikator på kontaminering. Det bör noteras att en grundlig rengöring av hemocytometern bör utföras före cellräkning, eftersom denna typ av skräp endast kan förekomma på hemocytometern och inte i själva cellkulturerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande fil 1: Bilaga Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om kontaminering är ett av de främsta problemen när man utför cellodlingsarbete, kommer de metoder och tekniker som beskrivs i detta manuskript att bidra till att mildra riskerna. De kritiska stegen inkluderar att bära en ren labbrock, som endast används i cellodlingsrummet, använda rena, pulverfria handskar som sprayas med 70% EtOH ofta och som byts när man växlar mellan cellinjer, uppmuntrar varje individ att inte dela mediaflaskor, rengör skåpet noggrant före och efter avslutat arbete, snyggt packa upp serologiska pipetter, undvika långvarig nära kontakt med öppna flaskor eller kolvar, inte dela mediaflaskor mellan flera cellinjer och snabbt öppna och stänga inkubatordörrar. Dessutom säkerställer tvätt och autoklavering av egna glasvaror kvalitetskontroll, vilket minskar sannolikheten för att införa yttre föroreningar. Kvalitetskontrollmetoder inkluderar användning av autoklavtejp för att indikera om autoklaven har nått rätt temperatur på 121 °C, regelbundet förebyggande underhåll av utrustningen och visuell inspektion av kolven för att säkerställa att den har skrubbats ordentligt18. En annan viktig punkt är att använda separata inkubatorer för olika celltyper för att säkerställa att kontaminering från en celltyp inte överförs till andra och för att säkerställa att korskontaminering med celler inte uppstår.
Bakteriella och svampinfektioner är de två vanligaste inkräktarna i cellkulturer. En av de största föroreningarna, M. orale, är den vanligaste mykoplasmaarten i människans mun och representerar också "det enskilt vanligaste isolatet som står för 20–40% av alla mykoplasmainfektioner i cellkulturer"4. Med andra ord är laboratoriepersonal den största källan till denna förorening. Det är alltid ett bekymmer i cellodlingsrummet eftersom mykoplasma är en liten, långsamt växande mikroorganism som saknar en styv cellvägg som kan passera genom 0,45 μm filter4. Studier visar att förekomsten av mykoplasmakontaminering är 15% -35% av kontinuerliga humana eller djurcellinjer4. Dessutom visar statistiken att cirka 5% till 30% av världens cellinjer är förorenade med mykoplasma6. Tyvärr är mykoplasma resistent mot de flesta antibiotika som används för cellodling, och infektion kan påverka cellfysiologi och metabolism 4,6. Även om kontaminering inte saktar ner cellmetabolismen kan den förorena slutprodukten6. Infektioner kan hålla sig kvar utan att laboratoriemedlemmar märker cellskador. Om kontaminering inträffar är kostnaden för att tina upp nya celler, den tid som spenderas på att sprida de nya kulturerna, de dyra medierna som har slösats bort, dekontaminering av inkubatorer och den tid kollegor spenderar på att vänta på att börja sina experiment igen, enorm. Vårt laboratorium uppskattar att den totala förlorade tiden står för 2 veckor och den totala kostnaden i samband med kontaminering av ett typiskt humant däggdjurscellproteinuttryck på 8 liter är $ 1,400. De metoder och tekniker som beskrivs i detta manuskript erbjuder bra förebyggande åtgärder för att mildra extra kostnader, förlorade celler och driftstopp.
Ändringar av dessa metoder rekommenderas inte. Alla labbmedlemmar bör utbildas innan de arbetar i cellodlingsrummet och sedan få repetitionsutbildning varje år7. Labmedlemmar bör också organisera cellodlingsrummet så att alla nödvändiga förnödenheter finns i ett område, vilket minimerar behovet av laboratoriemedlemmar att lämna cellodlingsrummet på jakt efter leveranser.
Begränsningar av de presenterade teknikerna observeras om kontaminering kommer från externa källor såsom serum, inkubatorer, felaktiga autoklaver, smutsiga labbrockar eller källan till cellerna. Felsökning av tekniken kan vara nödvändig om kontaminering sker trots strikt efterlevnad av detta protokoll. Många externa faktorer kan bidra till denna typ av förorening. Labbmedlemmar måste vara försiktiga och kontrollera externa källor. Till exempel kan partiet fetalt bovint serum (FBS) som köpts från leverantören ha förorenats med mykoplasma. Jämfört med 1950-talet är detta nu en sällsynt händelse, men det kan fortfarande hända6. Alla mediaflaskor ska kastas ut om någon kontaminering märks, och protokollet startas om genom att tina nya celler och använda nya medier. Föroreningen kan redan ha varit närvarande inuti inkubatorn om det är mögel eller bakterier; De andra kolvarna inuti samma inkubator bör kontrolleras för att se om bakteriell eller mögeltillväxt observeras. Alla förorenade kolvar ska kastas ut och inkubatorn dekontamineras. Om ingen förorening hittas bör autoklaven kontrolleras för funktionsfel. Glaset kanske inte har autoklaverats ordentligt i första hand. Autoklavtejpen kan ändra färg trots att autoklaven inte når 121 °C. Därefter bör utgångsdatum på de använda antibiotikalösningarna kontrolleras; Nya lösningar kan behöva köpas in. Slutligen bör källan till cellerna beaktas; Var de från en betrodd labbleverantör eller lånade de från ett annat labb? Celler bör alltid köpas från en betrodd laboratorieleverantör och bör aldrig lånas från ett annat labb. Slutligen bör labrockar tvättas för att säkerställa deras renhet19. Dekontaminering av inkubatorer bör övervägas när en kolv har kontaminerats. Bakterieceller eller mögelsporer får inte föröka sig och fortsätta sprida föroreningar.
Befintliga metoder reflekterar över eliminering av kontaminering. De metoder som beskrivs i detta manuskript fokuserar på förebyggande snarare än eliminering av kontaminering. Det finns flera procedurer när det gäller att använda antibiotika för att avlägsna mykoplasma20. Användningen av antibiotika är dock riskabel eftersom de kanske inte helt eliminerar infektionen och "kan tillåta resistenta organismer att utvecklas"12. Faktum är att "72 % av de kulturer som odlades kontinuerligt i antibiotika visade sig vara mykoplasmapositiva medan endast 7 % som odlades i frånvaro av antibiotika var infekterade"12. Dessa data betonar tanken att medan användningen av antibiotika rekommenderas och kan vara till hjälp, är överanvändning eller fullständigt beroende av antibiotika inte fördelaktigt. Dessutom kan användning av antibiotika för att avlägsna föroreningar bara tillåta problemet att kvarstå. Antibiotikalösningar är inte nödvändiga; Om teknikerna i detta dokument följs bör kontaminering framgångsrikt förhindras.
De metoder och tekniker som beskrivs i detta manuskript kan användas i framtiden för att upprätthålla en aseptisk miljö när man utför det månatliga mykoplasmatestet och när man gör hemlagade kompetenta bakterieceller. Båda protokollen kräver en ren miljö, liknande cellodlingsarbete, så att slutprodukten inte förorenas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har inga motstridiga intressen.
Acknowledgments
Detta arbete har möjliggjorts tack vare finansiering från Howard Hughes Medical Institute (HHMI). Vi vill tacka vår labbchef, Jue Chen, för att ha läst manuskriptet och för hennes fortsatta stöd, Donna Tallent för hennes hjälpsamma redigeringar och kommentarer, och Jeff Hennefeld från IT-avdelningen vid Rockefeller University för hans hjälp med videokomponenten i detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS | Gibco | 14-190-144 | |
| DMEM F-12 Media | ATCC | 30-2006 | |
| Glass Baffled Flask | Pyrex | 09-552-40 | |
| Glass Pipettes | Fisher | 13-678-6B | |
| Pipette Aid | Drummond | 13-681-15A | |
| Serological Pipette | Corning | 07-200-573 | |
| T75 flask | Corning | 07-202-004 | |
| Trypsin | Gibco | 25-300-054 | |
| *Items may vary because this video is about general cell culture techniques |
References
- Johnson, Z. L., Chen, J. Structural basis of substrate recognition by the multidrug resistance protein MRP1. Cell. 168 (6), 1075-1085 (2017).
- Capes-Davis, A., et al. Cell lines as biological models: practical steps for more reliable research. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).
- Segeritz, C. P., Vallier, L. Cell culture: growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
- Lincoln, C. K., Gabridge, M. G. Cell culture contamination: sources, consequences, prevention, and elimination. Methods in Cell Biology. 57, 49-65 (1998).
- Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of mycoplasma contamination in cell culture. Cell Journal. 13 (4), 203-212 (2012).
- Stacey, G. N.
- Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R.
- Barth, O. M., Majerowicz, S. Rapid detection by transmission electron microscopy of mycoplasma contamination in sera and cell cultures. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 83 (1), 63-66 (1988).
- Mirabelli, P., Coppola, L., Salvatore, M. Cancer cell lines are useful model systems for medical research. Cancers. 11 (8), 1098 (2019).
- Gabelli, S., Zhao, C., Oberst, J. A cell culture master class: What your cells wish they could tell you. Science. , Available from: https://www.science.org/content/webinar/cell-culture-master-class-your-cells-wish-they-could-tell-you (2020).
- Langdon, S. P. Cell culture contamination: an overview. Methods in Molecular Medicine. 88, 309-317 (2004).
- Babic, Z., et al. Meta-research: Incidences of problematic cell lines are lower in papers that use RRIDs to identify cell lines. eLife. 8, e41676 (2019).
- Visconti, P., et al. Short tandem repeat profiling for the authentication of cancer stem-like cells. International Journal of Cancer. 148 (6), 1489-1498 (2021).
- Horbach, S. P. J. M., Halffman, W. The ghosts of HeLa: How cell line misidentification contaminates the scientific literature. PLoS One. 12 (10), 0186281 (2017).
- Why 70% isopropyl alcohol is a better disinfectant than 99% isopropyl alcohol when it comes to Covid-19. MunGlobal. , Available from: https://munglobal.com.au/resources/knowledge-base/pathogens/why-70-isopropyl-alcohol-is-a-better-disinfectant-than-99-isopropyl-alcohol/#:~:text=Due%20to%20the%20concentration%20difference,potency%20of%20its%20antimicrobial%20properties (2023).
- United States Department of Agriculture. Processing and Safety. Food Safety Publications. , Available from: https://www.ars.usda.gov/ARSUserFiles/60701000/FoodSafetyPublications/p328.pdf (2004).
- Sterilizing Practices. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/sterilizing-practices.html (2023).
- Coté, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1.3 (2001).
- Uphoff, C. C., Drexler, H. G. Eradication of Mycoplasma contamination from cell cultures. Current Protocols in Molecular Biology. 106, 1-12 (2014).
- Bykowski, T., Stevenson, B.
- Penning, S. D. How a Class II, Type A2 Biosafety Cabinet Works. Nuaire. , Available from: https://www.nuaire.com/resources/class-ii-type-a2-biosafety-cabinet-how-it-works-article (2020).
- Phelan, K., May, K. M. Mammalian cell tissue culture techniques. Current Protocols in Pharmacology. 73, 1-23 (2016).
