Summary
Gepubliceerde gegevens met betrekking tot calcitonine gen-gerelateerde peptide (CGRP) concentraties in menselijk plasma zijn inconsistent. Deze inconsistenties kunnen te wijten zijn aan het ontbreken van een gestandaardiseerde, gevalideerde methodologie om dit neuropeptide te kwantificeren. Hier beschrijven we een gevalideerd enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) protocol om CGRP in menselijk plasma te zuiveren en te kwantificeren.
Abstract
Calcitonine gen-gerelateerd peptide (CGRP) is een vasoactief neuropeptide dat een vermeende rol speelt in de pathofysiologie van migraine en kan een kandidaat zijn voor de status van biomarker. CGRP komt vrij uit neuronale vezels bij activering en induceert steriele neurogene ontsteking en arteriële vaatverwijding in de vasculatuur die trigeminus efferente innervatie ontvangt. De aanwezigheid van CGRP in de perifere vasculatuur heeft geleid tot onderzoek om dit neuropeptide in menselijk plasma te detecteren en te kwantificeren met behulp van proteomische assays, zoals de enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). De halfwaardetijd van 6,9 min en de variabiliteit in technische details van testprotocollen, die vaak niet volledig worden beschreven, hebben echter inconsistente CGRP ELISA-gegevens in de literatuur opgeleverd. Hier wordt een aangepast ELISA-protocol voor de zuivering en kwantificering van CGRP in menselijk plasma gepresenteerd. De procedurele stappen omvatten monsterverzameling en -bereiding, extractie met behulp van een polair sorptiemiddel als zuiveringsmiddel, aanvullende stappen om niet-specifieke binding te blokkeren en kwantificering via ELISA. Verder is het protocol gevalideerd met spike en herstel en lineariteit van verdunningsexperimenten. Dit gevalideerde protocol kan theoretisch worden gebruikt om CGRP-concentraties in het plasma van personen te kwantificeren, niet alleen met migraine, maar ook met andere ziekten waarbij CGRP een rol kan spelen.
Introduction
Calcitonine gen-gerelateerd peptide (CGRP) is een 37-aminozuur neuropeptide dat aanwezig is in neuronale vezels met perivasculaire lokalisatie en niet-neuronale weefsels. De twee vormen van CGRP, α- en β-CGRP, delen meer dan 90% homologie en delen fysiologische functies; αCGRP wordt echter aangetroffen in het centrale en perifere zenuwstelsel, terwijl βCGRP wordt aangetroffen in het enterische zenuwstelsel 1,2. Bij activering van nociceptoren en calciumafhankelijke exocytose komt CGRP vrij uit neuronen, waardoor steriele neurogene ontsteking met arteriële vasodilatatie en plasma-eiwitextravasatie wordt geïnduceerd 3,4,5,6,7. Vanaf hier verschijnt CGRP in de postcapillaire vaten en kan het een biomarker zijn voor ziekten die afferente nociceptieve activering veroorzaken, zoals migraine 8,9,10,11. Van belang is dat CGRP ook betrokken is bij COVID-19 door zijn rol in angiogenese en immuunmodulatie, en kan een ongunstige ziekte-evolutie voorspellen12,13. Een protocol voor de nauwkeurige kwantificering van CGRP in menselijk plasma zou dus een brede waarde kunnen hebben.
De meeste aandacht is misschien wel besteed aan de rol van CGRP bij migraine. Op basis van preklinische en klinische studies is CGRP naar voren gebracht als een mogelijke biomarker voor migraine en als een doelwit voor behandeling 3,4,5,6,7,8,9,10. Sommige studies hebben een verhoging van CGRP gevonden in cohorten met episodische migraine ten opzichte van controledeelnemers10,14,15. Het succes van CGRP-remmers in klinische onderzoeken voor de behandeling van migrainehoofdpijn lijkt verhoogde CGRP te impliceren als een oorzakelijke factor voor migrainehoofdpijn. Niet alle onderzoekers hebben deze resultaten echter bevestigd16,17,18,19. Bovendien moet de rol van CGRP bij niet-hoofdpijnsymptomen van migraine nog worden opgehelderd; het huidige werk werd gemotiveerd door een verlangen om de rol van CGRP bij vestibulaire symptomen van migraine te begrijpen.
Inconsistente CGRP-immunoassaygegevens in de literatuur kunnen verschillende oorzaken hebben. Ten eerste is de halfwaardetijd van CGRP in de perifere vasculatuur 6,9 min 20, vanwege de activiteit van serineproteasen 21, insulineafbrekende enzymen en andere metalloproteasen 22, neutrale endopeptidasen 23 en endotheline-converterend enzym-1 24. Ten tweede worden de variabele technische details van de immunoassays die worden gebruikt om CGRP te kwantificeren niet volledig beschreven in dergelijke studies. Ten slotte compliceert het gebrek aan standaardisatie van de immunoassay-methodologie het beeld nog meer.
Dit artikel beschrijft een gemodificeerd enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) protocol dat de zuivering en nauwkeurige kwantificering van α- en βCGRP in menselijk plasma mogelijk maakt. De antilichamen van de kit zijn niet kruisreactief met amyline, calcitonine of stof P. Dit protocol heeft de nodige validatie-experimenten ondergaan, zoals spike en herstel en lineariteit van verdunning, waarvan de gegevens hier worden gepresenteerd. Zo'n CGRP ELISA-protocol dat validatie heeft ondergaan, is nog niet eerder volledig beschreven in de literatuur. Dit protocol kan worden gebruikt om CGRP in menselijk plasma te kwantificeren in de context van migraine, evenals cardiologische2,25, dermatologische 26, verloskundige 27, reumatologische28,29, musculoskeletale 30,31, endocriene 32,33 en virale ziekten 12,13 waarbij CGRP betrokken is geweest.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol is ontwikkeld met behulp van menselijke plasmamonsters van personen met toestemming met goedkeuring van de Johns Hopkins Institutional Review Board (NA_00092491).
1. Monsterverzameling en -bereiding
- Verzamel 5 ml volbloed uit de antecubitale ader via standaard venapunctiemethoden34 in een 6 ml vacutainer ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) verzamelbuis.
- Voeg na verzameling 0,5 ml aprotinine (10.000 KIU / ml) concurrerende serineproteaseremmer toe aan de buis om de lysis van het doelpeptide te blokkeren. Keer de buis 10 keer om om de aprotinine voldoende te laten mengen met het bloed. Bewaar daarna de buizen op ijs tot de volgende stap.
- Centrifugeer de buis bij 604 x g gedurende 4 minuten bij 4 °C binnen 60 minuten na bloedafname.
- Verwijder de plasmafractie met een pipet en breng over op 2 ml steriele cryovialen met ronde bodem.
- Bewaar de cryovialen onmiddellijk bij -80 °C gedurende maximaal 2 weken.
2. Extractie van de plasmamonsters
- Plaats een extractiepatroon in een conische centrifugebuis van 15 ml met de buitenste ribbels van de patroon ondersteund door de buitenste ribbels van de buis.
- Activeer de patroon door eerst 5 ml 100% methanol en vervolgens 10 ml ultrapuur water door de patroon te laten lopen.
- Terwijl vloeistof door de cartridge wordt geleid via door zwaartekracht aangedreven stroming, zal deze zich verzamelen in de buis.
- Gooi overtollige vloeistof weg terwijl deze zich ophoopt om ervoor te zorgen dat de vloeistof de patroon niet overspoelt.
- Zorg ervoor dat de patroon niet droogt tijdens het experiment.
- Verdun 250 μL plasma met 750 μL 4% azijnzuur.
- Laat de 1 ml plasma en azijnzuuroplossing langzaam door de patroon lopen.
OPMERKING: Deze stap duurt ongeveer 30 s via door zwaartekracht aangedreven stroom voor elke gepasseerde milliliter. - Was de patroon met 10 ml 4% azijnzuur. Zoals eerder gedaan, gooi de overtollige vloeistof weg terwijl deze zich ophoopt om ervoor te zorgen dat de vloeistof de patroon niet overspoelt.
- Nadat de laatste druppel azijnzuur uit de patroon is vrijgegeven, verwijdert u de patroon uit de buis en plaatst u deze in een nieuwe conische centrifugebuis van 15 ml.
- Bereid een 10:1 oplossing van 100% methanol en 4% azijnzuur door 2,7 ml 4% azijnzuur en 0,3 ml 100% methanol te mengen. Gebruik dit om de CGRP te elueren door deze oplossing 1 ml per keer door de patroon te laten gaan. Pauzeer gedurende 25 minuten tussen elke milliliter oplossing die wordt doorgegeven. Gooi het eluent NIET weg.
- De buis bevat 3 ml van de geëlueerde vloeistof 25 minuten nadat de laatste milliliter van de methanol- en azijnzuuroplossing is gepasseerd. Plaats elke 1 ml van het eluent in een microcentrifugebuis van 1,7 ml.
OPMERKING: Dit zou drie microcentrifugebuizen van elke patroon moeten opleveren. - Plaats elke buis gedurende 1 s in een minicentrifuge om ervoor te zorgen dat al het eluent zich op de bodem van elke buis bevindt.
- Droog alle monsters door vacuümcentrifugatie bij 4 °C (ingesteld op concentratorfunctie, voor waterige oplossingen, bij 1.400 tpm; de g-kracht varieert afhankelijk van de positie van de buizen en varieert daarom van 130-250 x g).
OPMERKING: De tijd die de vacuümcentrifuge nodig heeft om de monsters te drogen, is afhankelijk van het type microcentrifugebuis dat wordt gebruikt. - Reconstitueert onmiddellijk voordat u overgaat tot de testprocedure (stap 4.1) het eerder gedroogde monster met enzymimmunoassaybuffer (EIA) (zie tabel met materialen) ontdooid tot kamertemperatuur (RT) of 20 °C.
OPMERKING: Het volume EIA-buffer dat wordt gebruikt om het gedroogde monster te reconstitueren, moet gelijk zijn aan het oorspronkelijke monstervolume of 250 μL.
3. Voorbereiding van de ELISA-plaat - blokkering om niet-specifieke binding te beperken
- Voeg 250 μL tris-gebufferde zoutoplossing (TBS)/visgelatine blokkerende buffer toe aan elk putje op het bord.
- Leg een afdekvel over de plaat en incubeer gedurende 2 uur bij RT.
- Verwijder het afdekblad en maak de plaat leeg door inversie of aspiratie met behulp van een meerkanaalspipet. Dep de plaat vervolgens op een papieren handdoek om elk spoor van vloeistof weg te gooien.
- Droog de plaat door de plaat 10 minuten in een laminaire flowkap te laten staan.
- Nadat de plaat zichtbaar droog is, plaatst u deze in een met grip afgesloten foliezakje met een silicagel droogmiddelzakje en bewaart u het zakje gedurende 24 uur bij -20 °C.
OPMERKING: De platen moeten binnen 4 weken na incubatie van de plaat worden gebruikt.
4. Voorafgaand aan de testprocedure
- Bereid reagentia voor (EIA-buffer, CGRP-standaard, CGRP-kwaliteitscontrole, CGRP-tracer, wasbuffer) volgens de instructies van de kit. Bereid Ellman's reagens pas voor nadat de incubatietijd van 16-20 uur is afgelopen.
- Ontdooi alle monsters en reagentia tot RT voordat u de rest van het protocol uitvoert.
5. Testprocedure
- Spoel elk putje in de verstopte plaat vijf keer af met een wasbuffer (300 μL/put). Pauzeer voor elke spoeling 30 s na het plaatsen van de wasbuffer in de putjes en gooi de vloeistof of het aspiraat eruit met behulp van een meerkanaalspipet.
- Verwijder na de laatste spoeling alle buffer uit de putten door inversie (het omkeren van de plaat om de vloeistof in putten te verdrijven) of aspiratie met behulp van een meerkanaalspipet. Dep de laatste druppels op keukenpapier en tik op de omgekeerde plaat totdat alle vloeistof zichtbaar uit de putjes is verwijderd.
- Zet ten minste twee putten zonder reagentia of buffer opzij om bekend te staan als "Blanke" putten. Zet vervolgens ten minste twee andere putten opzij voor niet-specifieke binding (NSB).
- Doseer 100 μL EIA-buffer in elke NSB-put.
- Doseer 100 μL van de CGRP-normen in tweevoud in geschikte putten.
- Doseer 100 μL monsters (gereconstitueerd in EIA-buffer) en kwaliteitscontrole in tweevoud in geschikte putten.
- Doseer 100 μL CGRP-tracer (anti-CGRP-antilichaam gehecht aan acetylcholinesterase) aan elke put met NSB-, CGRP-normen, monsters en kwaliteitscontrole. Geef geen tracer af aan de "Blank" putten.
- Bedek de plaat met een doorzichtig afdekvel en sluit elke put zodanig af dat de monsters en reagentia in elke put niet significant verdampen. Incubeer de plaat gedurende 16-20 uur bij 4 °C.
- Nadat de incubatie is voltooid, reconstitueert u het reagens van de Ellman volgens de instructies van de kit.
- Keer de plaat om om alle vloeistof te verwijderen. Spoel elk putje (zoals hierboven beschreven) drie keer af met 300 μL wasbuffer.
- Verwijder na de derde spoeling de vloeistof van de platen, plaats de plaat op een schudplaat en schud gedurende 2 minuten bij 120 tpm.
- Was het bord nog eens drie keer. Verwijder na de laatste spoeling alle buffer uit de putten door inversie of aspiratie met behulp van een meerkanaalspipet. Dep de laatste druppels vloeistof op een papieren handdoek en tik op de omgekeerde plaat totdat alle vloeistof zichtbaar uit de putjes is verwijderd.
OPMERKING: De drie extra wasbeurten die in deze stap worden beschreven, zijn mogelijk niet nodig als u een ELISA-microplaatwasser gebruikt. - Doseer 200 μL Ellman's reagens in elke put (exclusief de "Blank" putjes).
- Bedek de plaat met een nieuw afdekvel en wikkel het in aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen. Incubeer in het donker bij RT gedurende 1 uur.
- Zorg ervoor dat er geen vloeistof aan de achterkant van de plaat zit die de aflezing van de spectrofotometer kan verstoren door de achterkant af te vegen met een droge papieren handdoek.
- Lees de plaat voor absorptie bij 405 nm (gele kleur).
6. Data-analyse
- Bereken de gemiddelde absorptie voor elke "Blank", NSB, standaard, kwaliteitscontrole en de monsters.
- Trek de gemiddelde absorptiewaarden van de NSB af van de standaard-, kwaliteitscontrole- en monsterabsorptiewaarden.
- Plot absorptie op de y-as en concentratie op de x-as. Construeer een standaardcurve met behulp van een logistisch regressiemodel met vier parameters.
- Zodra de curve is geconstrueerd, gebruikt u de vergelijking van de curve om de geïnterpoleerde concentraties te bepalen voor kwaliteitscontrole en monsters, die op de x-as kunnen worden gelezen.
OPMERKING: De standaardcurve wordt alleen gevalideerd als de berekende geïnterpoleerde concentratie voor de kwaliteitscontrole binnen 25% van de verwachte concentratie ligt (meestal 125 pg/ml, maar zie het etiket van de injectieflacon voor kwaliteitscontrole).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Er zijn verschillende belangrijke stappen in het protocol die moeten worden benadrukt. Ten eerste moet aprotinine, een serineproteaseremmer, onmiddellijk na het verzamelen aan volbloedmonsters worden toegevoegd om verdere enzymatische afbraak van CGRP te voorkomen. Van serineproteasen is aangetoond dat ze een rol spelen in het CGRP-metabolisme en een eerdere studie heeft ook aprotinine gebruikt bij het kwantificeren van CGRP bij mensen21,35. Als proteaseremmers niet worden gebruikt en de monstervoorbereiding langer dan 60 minuten duurt, kan men lagere CGRP-niveaus verwachten bij het uitvoeren van ELISA. Ten tweede concentreert vaste fase extractie voorafgaand aan ELISA CGRP in het eluent en elimineert potentieel storende moleculen uit de plasmamatrix. Deze extractiestap verhoogt de opbrengst van CGRP in spike- en herstelexperimenten (verder besproken in de volgende sectie). Vacuümcentrifugatie in een koelcel na extractie beperkt het verlies van CGRP verder. Ten derde moeten de microtiterplaten voorafgaand aan ELISA worden geblokkeerd met behulp van een blokkeringsbuffer. Dit maakt de passieve adsorptie van niet-specifieke eiwitten in de buffer naar de resterende bindingsplaatsen in de platen mogelijk, waardoor het achtergrondsignaal wordt verminderd. Blokkeren helpt onrealistisch hoge opbrengsten van CGRP te verminderen.
Spike- en herstelexperimenten bepalen of CGRP-detectie wordt beïnvloed door de verschillen tussen het standaard curveverdunningsmiddel (hier, EIA-buffer) en experimentele monstermatrix (hier plasma). Plasma en/of serum kunnen moleculen bevatten die de binding van antilichamen aan CGRP blokkeren of het peptide afbreken, waardoor het vermogen van de test om de beginconcentratie van CGRP nauwkeurig te detecteren en te kwantificeren, wordt verstoord. Hiertoe voegden we bekende hoeveelheden CGRP toe aan plasmamonsters - de "spiking" -stap - en berekenden we hoeveel CGRP werd "teruggewonnen" na extractie en ELISA. De CGRP-voorraad werd verkregen van de fabrikant en bewaard in een vriezer van -20 °C tot gebruik.
Bij lineariteit van verdunningstests wordt een monster serieel verdund en worden voor elke verdunning CGRP-concentraties berekend. Als de verdunde monsters geen geschikte lineaire dalingen van de CGRP-concentratie vertonen, zou dit erop wijzen dat de EIA-buffer of het plasma de detectie van CGRP bij bepaalde concentraties verstoort of dat de standaardcurve niet nauwkeurig is in het bereik dat wordt beïnvloed. Bij het uitvoeren van het hierboven beschreven spike- en herstelexperiment hebben we de "spiked" -monsters serieel verdund; we prikten een plasmamonster om een concentratie CGRP van 200 pg / ml te geven en verdunden het monster vervolgens tot 100 pg / ml en vervolgens 50 pg / ml.
Plasmamonsters van drie deelnemers zonder voorgeschiedenis van cardiovasculaire, respiratoire of recente hoofdpijn of neurologische symptomen werden gepiekt met verschillende concentraties CGRP. Het protocol werd uitgevoerd voor deze monsters, naast niet-spiked controlemonsters. Figuur 1 toont een voorbeeld van een plaatkaart voor spike en recovery en lineariteit van verdunningsexperimenten. Een logistische fit met vier parameters werd uitgevoerd om een standaardcurve te creëren die het mogelijk maakte om buiten het lineaire bereik te passen (tabel 1 en figuur 2). De terugwinningspercentages werden berekend voor elk monster met spikes en lagen binnen het aanvaardbare bereik (tabel 2). De lineariteit van de verdunning werd aangetoond in de spikemonsters (figuur 3). Tabel 3 toont de resultaten van een mislukt spike- en herstelexperiment dat is uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant en voorafgaand aan de opname van de toegevoegde stappen om niet-specifieke binding te blokkeren. Deze gegevens tonen herstelpercentages die de bovengrens van 125% overschrijden, wat wijst op de aanwezigheid van niet-specifieke binding. Na het toevoegen van de stappen in het protocol om de plaat te blokkeren met behulp van een blokkeringsbuffer (stappen 3.1-3.5), konden we dit effect verminderen en acceptabele herstelwaarden bereiken (tabel 2). Bij drie patiënten zonder migraine of vestibulaire symptomen vonden we dat de gemiddelde concentratie CGRP in plasma 1,68 ± 0,13 pg/ml was. Toekomstige experimenten moeten gericht zijn op het gebruik van de huidige methodologie op een grotere schaal van controlepatiënten.
Figuur 1: Voorbeeld plaatkaart. Elke plaat moet standaarden, monsters, blanco's en NSB-putten bevatten, allemaal in tweevoud of drievoud. Blanco putten mogen geen vloeistof bevatten en NSB-putten moeten gepatenteerde enzymimmunoassaybuffer, enzymgebonden secundair antilichaam en Ellman's reagens bevatten. De gemiddelde absorptiewaarden voor de NSB-putten moeten worden afgetrokken van de absorptiewaarden van de standaard voordat de standaardcurve wordt gemaakt. De gemiddelde absorptiewaarden voor de NSB-putten moeten ook worden afgetrokken van de absorptiewaarden van de monsters, voordat het percentage terugwinning wordt berekend. Er is geen effect van de plaatpositie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Voorbeeld van een vier-parameter logistische (4PL) regressie standaardcurve. Deze standaardkromme wordt wiskundig beschreven door een vergelijking in een vergelijkbare vorm als in tabel 1. Een 4PL-regressiecurve is geschikter voor biologische systemen in vergelijking met lineaire curven. Deze curve en vergelijking worden gebruikt om kwaliteitscontroles en monsters te interpoleren op dezelfde plaat waarop de standaard is gemaakt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Lineariteit van de verdunningslijngrafiek met monsters met een piek van 200 pg/ml en vervolgens serieel verdund 1:2 en 1:4. Deze gegevens tonen lineariteit aan over een breed scala aan verdunningen, wat aangeeft dat de testmethode nauwkeurig is over een breed scala aan CGRP-concentraties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Parameter | Waarde |
| X50 | 294.75 |
| Vergelijking |  |
| Vergelijkingsformulier |  |
Tabel 1: Voorbeeld van een afour-parameter logistische (4PL) regressie standaard kromme vergelijking met titers X50. Een 4PL-regressiecurve houdt rekening met de complexiteit die wordt gezien in biologische systemen. Deze curve werd gebruikt om de resultaten van de ELISA te analyseren, omdat deze geschikter is dan lineaire regressie.
| Absorptie (OD) | Geïnterpoleerde concentratie (pg/ml) | Procentuele opbrengst | |
| Niet-spiked controle | -0.0434 | Valt niet op curve (d.w.z. ~0) | |
| Piek op 200 pg / ml | 0.2712 | 214,7 ± 23,4 | 107.40% |
| Piek op 100 pg / ml | 0.0966 | 102,7 ± 2,35 | 102.70% |
| Piek bij 50 pg / ml | 0.0205 | 55,1 ± 12,65 | 110.20% |
Tabel 2: Resultaten van een succesvol spike- en herstelexperiment van drie controledeelnemers vanwege een gebrek aan vaste fase-extractie en plaatblokkering. Het percentage van de opbrengst voor spiked samples viel allemaal binnen 20% van de ideale 100% opbrengst, wat aangeeft dat CGRP-detectie niet wordt beïnvloed door de experimentele monstermatrix van plasma.
| Absorptie (OD) | Geïnterpoleerde concentratie (pg/ml) | Procentuele opbrengst | |
| Niet-spiked controle | -0.2087 | Valt niet op curve (d.w.z. ~0) | |
| Piek op 200 pg / ml | 2.371 | 264,2 ± 104 | 132.10% |
| Piek op 100 pg / ml | 1.134 | 167,5 ± 31,2 | 167.50% |
| Piek bij 50 pg / ml | 0.3218 | 80,55 ± 4,54 | 161.10% |
Tabel 3: Resultaten van een mislukt spike- en herstelexperiment van drie controledeelnemers vanwege een gebrek aan plaatblokkering. Het percentage van de opbrengst voor spiked monsters viel allemaal ruim boven de bovengrens van 120% opbrengst, wat aangeeft dat de test mogelijk door NSB is beschadigd. Na het verkrijgen van deze resultaten hebben we stappen 3.1-3.5 in het protocol toegevoegd om NSB op de plaat te blokkeren voorafgaand aan de test.
| Absorptie (OD) | Geïnterpoleerde concentratie (pg/ml) | Procentuele opbrengst | |
| Niet-spiked controle | 0.0401 | 12.93 | |
| Piek op 100 pg / ml | 0.0315 | 10.17±2.31 | 10.17% |
| Piek bij 50 pg / ml | 0.0152 | 4.895±15.4 | 9.79% |
| Piek bij 25 pg / ml | 0.0007 | 0,2177±6,43 | 0.87% |
Tabel 4: Resultaten van een mislukt spike- en herstelexperiment van drie controledeelnemers. Het percentage van de opbrengst voor spiked samples viel allemaal ver onder de ondergrens van 80% opbrengst, wat aangeeft dat verdere optimalisatie nodig was om mogelijke degradatie en concurrerende bindingsprocessen aan te pakken. Deze resultaten zijn afkomstig van de competitieve ELISA-test van een andere fabrikant, met een ondergrens van detectie van 2,23 pg / ml, en intra-assay cv < 10% en inter-assay cv < 12%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel beschrijft een gevalideerd protocol dat de detectie en kwantificering van CGRP in menselijk plasma mogelijk maakt. Dit protocol werd gesynthetiseerd nadat commerciële CGRP ELISA-kits dit molecuul niet nauwkeurig bleken te kwantificeren. Na het vaststellen van een monstervoorbereidingsprotocol en een geldige standaardcurve, toonden spike- en herstel- en lineariteitsexperimenten aan dat het percentage terugvorderingen veel lager was dan verwacht. Vergelijkbare resultaten werden gevonden met behulp van een andere commerciële CGRP ELISA-kit (tabel 4). Ter referentie, het algemeen aanvaarde standaardherstel is 80-120%36. Deze resultaten kunnen wijzen op de aanwezigheid van proteaseactiviteit die CGRP21,22,23,24 afbreekt, andere moleculen die binden aan CGRP, waardoor de beschikbaarheid ervan voor binding aan de antilichamen van de plaat wordt beperkt, of concurrerende binding van niet-doeleiwitten aan de antilichamen van de plaat.
Om deze mogelijke confounders te controleren, werd een extractieprotocol geoptimaliseerd om plasma te zuiveren door extractie met een eigen sorptiemiddel voorafgaand aan ELISA. Dit sorptiemiddel isoleert ogenschijnlijk polaire moleculen zoals CGRP. Om de werkzaamheid van extractie voorafgaand aan ELISA te bepalen, piekten menselijke plasmamonsters met bekende concentraties CGRP als positieve controles ondergingen extractie en vervolgens ELISA. Deze spiked monsters leverden slechts ~ 50% -60% herstel op. Deze resultaten gaven aan dat exogeen toegevoegde CGRP niet wordt gedetecteerd in plasma, zoals men zou verwachten.
Verschillende andere stappen van het protocol werden geoptimaliseerd: het toevoegen van serineproteaseremmer aan volbloedmonsters voorafgaand aan centrifugatie om afbraak te remmen21, het verlagen van de temperatuur van vacuümcentrifugatie na extractie en het aanpassen van postcentrifugatieresuspensiemethoden. Een piek- en herstelexperiment na deze veranderingen onthulde onrealistisch hoge CGRP-concentraties, een herstel van meer dan 120% (tabel 3). Geruststellend is dat onlangs ook hoger dan verwachte waarden werden gemeld na extractie met behulp van een vergelijkbare test door Messlinger et al.37, wat aangeeft dat dit een probleem blijft. Messlinger et al. erkennen dat de test na plasma-extractie geen realistische CGRP-concentraties reproduceert, zonder een reden te geven voor dit fenomeen37.
We veronderstelden dat de resterende bindingscapaciteit op de ELISA-microtiterplaten die niet-specifieke binding veroorzaken, verantwoordelijk kan zijn voor de hoge herstelsnelheden. Voorafgaand aan ELISA werd de plaat geïncubeerd met een blokkerende buffer, TBS/visgelatinebuffer, om deze bindingscapaciteit te verminderen. Deze extra stap resulteerde in meer geschikte terugwinningspercentages (tabel 2). De hierboven besproken wijzigingen en optimalisaties, waaronder het gebruik van de blokkeringsbuffer, blijven dus kritieke stappen in het protocol. Deze stappen hebben gezorgd voor een ondergrens van detectie van 1,05 pg / ml, vergeleken met die van de originele fabrikant kit vermeld als 2 pg / ml.
Wat het oplossen van problemen betreft, vraagt stap 2.10 om vacuümcentrifugatie om het eluent te drogen. De lengte van deze stap is waargenomen te variëren, afhankelijk van het type microcentrifugebuis waarin de monsters zich bevinden. Met behulp van de microcentrifugebuizen die in de materiaaltabel worden beschreven, duurt deze stap meestal 5 uur. Wanneer echter alternatieve microcentrifugebuizen met grotere volumes worden gebruikt, kan deze stap tot 11 uur duren. Een alternatief voor vacuümcentrifugatie kan lyofilisatie of vriesdrogen van de monsters zijn, waardoor de monsters na extractie moeten worden ingevroren. Lyofilisatie werd echter niet getest bij de constructie van dit protocol. Bovendien, als systematisch lager dan verwachte concentraties CGRP worden gevonden, moet men ervoor zorgen dat alle reagentia, met name de antilichamen, vóór gebruik tot kamertemperatuur worden ontdooid. De instabiliteit van reagentia, zoals de antilichaam- en traceroplossingen, kan bijdragen tot systematische fouten bij het binden van CGRP. Als de opbrengst ontoereikend blijft, kan de antilichaambinding aan CGRP worden beïnvloed door de relatieve zuurgraad van het eluent (methanol en azijnzuuroplossing), ondanks reconstitutie met een buffer. In dit geval zou een pH-rectificatiestap een logische toevoeging zijn na reconstitutie met buffer.
Beperkingen van dit protocol omvatten de beperkingen die verband houden met elke ELISA-methodologie, met name antilichaaminstabiliteit38. Antilichaamreagentia moeten vóór gebruik in de test tot kamertemperatuur worden ontdooid; opwarming gedurende een langere periode kan echter denaturatie veroorzaken en bijgevolg een verminderde effectiviteit bij het binden van CGRP. Bovendien kan CGRP degradatie ondergaan door een verscheidenheid aan niet-serineproteasen, wat leidt tot verhoogde vals-negatieve resultaten. Hoewel dit protocol de afbraak beperkt door een serineprotease toe te voegen en de verwerkingstijd van het monster te beperken tot minder dan 60 minuten, kan degradatie nog steeds optreden. Een andere beperking is het ontbreken van geteste vries-dooicycli. Lee et al.39 toonden aan dat vries-dooicycli de serum- en plasma-eiwithoeveelheden kunnen verhogen of verlagen, afhankelijk van de gevoeligheid van het eiwit. De gevoeligheid van CGRP voor vries-dooicycli is niet volledig getest in de literatuur, hoewel Messlinger et al. hebben opgemerkt dat de niveaus van CGRP afnemen na één cyclus van bevriezen en ontdooien37. Verder kan de opbrengst van dit protocol profiteren van het gebruik van eiwit LoBind-buizen, ontworpen met een hydrofiel oppervlak, wat leidt tot een verbeterd eiwitherstel.
We merken op dat deze validatie-experimenten niet lijken te zijn uitgevoerd door auteurs van recente studies die CGRP kwantificeren in menselijk plasma 16,18,35,40,41. Een herziening van de ELISA-methodologie door Messlinger et al.37 benadrukt de noodzaak van dergelijke controles en zet vraagtekens bij studies die ze niet hebben gebruikt. Wij geloven dat ons werk in het valideren en standaardiseren van een protocol toekomstig CGRP-onderzoek op een betere basis zal zetten. De implicaties van een dergelijk protocol zijn breed en kunnen theoretisch worden uitgebreid tot het onderzoeken van de biomarkerstatus van CGRP in neurologische en niet-neurologische ziekteprocessen 2,25,26,27,28,29,30,31,32,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen verdere onthullingen toe te voegen.
Acknowledgments
We willen Robert N. Cole, Lauren R. DeVine en Marcos Iglesias bedanken voor hun nuttige discussies over dit protocol. Dit werd gedeeltelijk ondersteund door financiering van de American Otological Society (Fellowship Grant, PSK), de American Hearing Research Foundation (90066548 / 90072266, JPC) en het National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS), een onderdeel van de National Institutes of Health (NIH) en NIH Roadmap for Medical Research (UL1 TR003098, NSF). De inhoud van de publicatie is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de Johns Hopkins ICTR, NCATS of NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube | Sorenson Bioscience, Inc. | 11510 | |
| 99% methanol | ThermoFisher Scientific | L13255.0F | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 14-959-49B | |
| 2 mL round bottom sterile cryovials | CRYO.S | 122263 | |
| 4% acetic acid | ThermoFisher Scientific | 035572.K2 | |
| 6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube | BD | 367863 | |
| Allegra 64R benchtop centrifuge | Beckman Coulter, Inc. | 367586 | |
| Aprotinin | VWR | 76344-814 | |
| CGRP (human) ELISA kit | Bertin Bioreagent | A05481 | |
| CGRP stock | Bertin Bioreagent | ||
| EIA Buffer | Bertin Bioreagent | A07000 | |
| Ellman's Reagent | Bertin Bioreagent | A09000_49+1 | |
| Multichannel pipettes | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges | Waters | WAT094226 | |
| Orbital Shaker | Bellco | 7744-01010 | |
| Precision micropipettes | ThermoFisher Scientific | F144055MG | |
| SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader | Molecular Devices | Part Number M2 | |
| TBS/Fish Gelatin | Bioworld, from Fischer Scientific | 50-199-167 | |
| Ultrapure water ELISA Grade | Bertin Bioreagent | A07001 | |
| Vacufuge plus - Centrifuge Concentrator | Eppendorf | 22820109 | |
| Wash Buffer | Bertin Bioreagent | A17000 |
References
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. -J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Brain, S. D., Grant, A. D. Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiological Reviews. 84 (3), 903-934 (2004).
- Edvinsson, L., Ekman, R., Jansen, I., McCulloch, J., Uddman, R. Calcitonin gene-related peptide and cerebral blood vessels: distribution and vasomotor effects. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 7 (6), 720-728 (1987).
- Donnerer, J., Stein, C. Evidence for an increase in the release of CGRP from sensory nerves during inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 657, 505-506 (1992).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system. Annals of Neurology. 23 (2), 193-196 (1988).
- Markowitz, S., Saito, K., Moskowitz, M. A. Neurogenically mediated leakage of plasma protein occurs from blood vessels in dura mater but not brain. The Journal of Neuroscience. 7 (12), 4129-4136 (1987).
- Saito, K., Markowitz, S., Moskowitz, M. A. Ergot alkaloids block neurogenic extravasation in dura mater: proposed action in vascular headaches. Annals of Neurology. 24 (6), 732-737 (1988).
- Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia. 22 (1), 54-61 (2002).
- Cady, R. K., Vause, C. V., Ho, T. W., Bigal, M. E., Durham, P. L. Elevated saliva calcitonin gene-related peptide levels during acute migraine predict therapeutic response to rizatriptan. Headache. 49 (9), 1258-1266 (2009).
- Cernuda-Morollón, E., et al. Interictal increase of CGRP levels in peripheral blood as a biomarker for chronic migraine. Neurology. 81 (14), 1191-1196 (2013).
- Messlinger, K. The big CGRP flood-sources, sinks and signalling sites in the trigeminovascular system. The Journal of Headache and Pain. 19, 22 (2018).
- Ochoa-Callejero, L., et al. Circulating levels of calcitonin gene-related peptide are lower in COVID-19 patients. Journal of the Endocrine Society. 5 (3), (2021).
- Rizzi, M., et al. CGRP plasma levels correlate with the clinical evolution and prognosis of hospitalized acute COVID-19 patients. Viruses. 14 (10), 2123 (2022).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
- Sarchielli, P., et al. Clinical-biochemical correlates of migraine attacks in rizatriptan responders and non-responders. Cephalalgia. 26 (3), 257-265 (2006).
- Greco, R., et al. Plasma levels of CGRP and expression of specific microRNAs in blood cells of episodic and chronic migraine subjects: towards the identification of a panel of peripheral biomarkers of migraine. The Journal of Headache and Pain. 21 (1), 122 (2020).
- Tvedskov, J. F., et al. No increase of calcitonin gene-related peptide in jugular blood during migraine. Annals of Neurology. 58 (4), 561-568 (2005).
- Pellesi, L., et al. Plasma levels of CGRP during a 2-h infusion of VIP in healthy volunteers and patients with migraine: An exploratory study. Frontiers in Neurology. 13, 871176 (2022).
- Kruuse, C., Iversen, H. K., Jansen-Olesen, I., Edvinsson, L., Olesen, J. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) levels during glyceryl trinitrate (GTN)-induced headache in healthy volunteers. Cephalalgia. 30 (4), 467-474 (2010).
- Kraenzlin, M. E., Ch'ng, J. L., Mulderry, P. K., Ghatei, M. A., Bloom, S. R. Infusion of a novel peptide, calcitonin gene-related peptide (CGRP) in man. Pharmacokinetics and effects on gastric acid secretion and on gastrointestinal hormones. Regulatory Peptides. 10 (2-3), 189-197 (1985).
- Brain, S. D., Williams, T. J. Substance P regulates the vasodilator activity of calcitonin gene-related peptide. Nature. 335 (6185), 73-75 (1988).
- Kim, Y. -G., Lone, A. M., Nolte, W. M., Saghatelian, A. Peptidomics approach to elucidate the proteolytic regulation of bioactive peptides. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8523-8527 (2012).
- Katayama, M., et al. Catabolism of calcitonin gene-related peptide and substance P by neutral endopeptidase. Peptides. 12 (3), 563-567 (1991).
- Hartopo, A. B., et al. Endothelin-converting enzyme-1 gene ablation attenuates pulmonary fibrosis via CGRP-cAMP/EPAC1 pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 48 (4), 465-476 (2013).
- Mair, J., et al. Plasma CGRP in acute myocardial infarction. Lancet. 335 (8682), 168 (1990).
- Antúnez, C., et al. Calcitonin gene-related peptide modulates interleukin-13 in circulating cutaneous lymphocyte-associated antigen-positive T cells in patients with atopic dermatitis. The British Journal of Dermatology. 161 (3), 547-553 (2009).
- Gangula, P. R., et al. Pregnancy and steroid hormones enhance the vasodilation responses to CGRP in rats. The American Journal of Physiology. 276 (1), H284-H288 (1999).
- Hernanz, A., Medina, S., de Miguel, E., Martín-Mola, E. Effect of calcitonin gene-related peptide, neuropeptide Y, substance P, and vasoactive intestinal peptide on interleukin-1beta, interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha production by peripheral whole blood cells from rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients. Regulatory Peptides. 115 (1), 19-24 (2003).
- Takeba, Y., Suzuki, N., Kaneko, A., Asai, T., Sakane, T. Evidence for neural regulation of inflammatory synovial cell functions by secreting calcitonin gene-related peptide and vasoactive intestinal peptide in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism. 42 (11), 2418-2429 (1999).
- Ahmed, M., Srinivasan, G. R., Theodorsson, E., Schultzberg, M., Kreicbergs, A. Effects of surgical denervation on substance P and calcitonin gene-related peptide in adjuvant arthritis. Peptides. 16 (4), 569-579 (1995).
- Neugebauer, V., Rümenapp, P., Schaible, H. G. Calcitonin gene-related peptide is involved in the spinal processing of mechanosensory input from the rat's knee joint and in the generation and maintenance of hyperexcitability of dorsal horn-neurons during development of acute inflammation. Neuroscience. 71 (4), 1095-1109 (1996).
- Wang, L. H., et al. Serum levels of calcitonin gene-related peptide and substance P are decreased in patients with diabetes mellitus and coronary artery disease. The Journal of International Medical Research. 40 (1), 134-140 (2012).
- Zelissen, P. M., Koppeschaar, H. P., Lips, C. J., Hackeng, W. H.
- World Health Organization. WHO Guidelines on Drawing Blood: Best Practices in Phlebotomy. 3, Blood-sampling systems. World Health Organization. , Geneva. (2010).
- Raffaelli, B., et al. Plasma calcitonin gene-related peptide (CGRP) in migraine and endometriosis during the menstrual cycle. Annals of Clinical and Translational Neurology. 8 (6), 1251-1259 (2021).
- Andreasson, U., et al. A practical guide to immunoassay method validation. Frontiers in Neurology. 6, 179 (2015).
- Messlinger, K., et al. CGRP measurements in human plasma-a methodological study. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 41 (13), 1359-1373 (2021).
- Sakamoto, S., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of Natural Medicines. 72 (1), 32-42 (2018).
- Lee, J. -E., Kim, S. Y., Shin, S. -Y. Effect of repeated freezing and thawing on biomarker stability in plasma and serum samples. Osong Public Health and Research Perspectives. 6 (6), 357-362 (2015).
- Fan, P. -C., Kuo, P. -H., Lee, M. T., Chang, S. -H., Chiou, L. -C. Plasma calcitonin gene-related peptide: A potential biomarker for diagnosis and therapeutic responses in pediatric migraine. Frontiers in Neurology. 10, 10 (2019).
- Raffaelli, B., et al. Change of CGRP plasma concentrations in migraine after discontinuation of CGRP-(receptor) monoclonal antibodies. Pharmaceutics. 15 (1), 293 (2023).
