Summary
Publicerade data avseende koncentrationer av kalcitonin-genrelaterade peptider (CGRP) i human plasma är inkonsekventa. Dessa inkonsekvenser kan bero på bristen på en standardiserad, validerad metod för att kvantifiera denna neuropeptid. Här beskriver vi ett validerat enzymkopplat immunosorbentanalysprotokoll (ELISA) för att rena och kvantifiera CGRP i human plasma.
Abstract
Kalcitonin genrelaterad peptid (CGRP) är en vasoaktiv neuropeptid som spelar en förmodad roll i patofysiologin vid migrän och kan vara en kandidat för biomarkörstatus. CGRP frigörs från neuronala fibrer vid aktivering och inducerar steril neurogen inflammation och arteriell vasodilatation i kärlen som får trigeminusefferent innervation. Förekomsten av CGRP i den perifera vaskulaturen har stimulerat undersökningar för att detektera och kvantifiera denna neuropeptid i human plasma med hjälp av proteomiska analyser, såsom den enzymbundna immunosorbentanalysen (ELISA). Dess halveringstid på 6,9 min och variationen i tekniska detaljer i analysprotokoll, som ofta inte beskrivs fullständigt, har dock gett inkonsekventa CGRP ELISA-data i litteraturen. Här presenteras ett modifierat ELISA-protokoll för rening och kvantifiering av CGRP i human plasma. De processuella stegen omfattar provtagning och beredning, extraktion med användning av en polär sorbent som reningsmedel, ytterligare steg för att blockera icke-specifik bindning och kvantifiering via ELISA. Vidare har protokollet validerats med spik och återhämtning och linjäritet av utspädningsexperiment. Detta validerade protokoll kan teoretiskt användas för att kvantifiera CGRP-koncentrationer i plasma hos individer, inte bara med migrän utan också med andra sjukdomar där CGRP kan spela en roll.
Introduction
Kalcitoningenrelaterad peptid (CGRP) är en 37-aminosyraneuropeptid som finns i neuronala fibrer med perivaskulär lokalisering såväl som icke-neuronala vävnader. De två formerna av CGRP, α- och β-CGRP, delar mer än 90% homologi och delar fysiologiska funktioner; αCGRP finns dock i centrala och perifera nervsystemet, medan βCGRP finns i det enteriska nervsystemet 1,2. Vid nociceptoraktivering och kalciumberoende exocytos frisätts CGRP från nervceller, vilket inducerar steril neurogen inflammation som involverar arteriell vasodilatation och plasmaproteinextravasering 3,4,5,6,7. Härifrån visas CGRP i de postkapillära kärlen och kan vara en biomarkör för sjukdomar som orsakar afferent nociceptiv aktivering, såsom migrän 8,9,10,11. Observera att CGRP också har varit inblandad i COVID-19 genom sin roll i angiogenes och immunmodulering, och kan förutsäga ogynnsam sjukdomsutveckling12,13. Således kan ett protokoll för noggrann kvantifiering av CGRP i human plasma ha ett brett värde.
Mest uppmärksamhet har kanske ägnats åt CGRP:s roll vid migrän. Baserat på prekliniska och kliniska studier har CGRP presenterats som en möjlig biomarkör för migrän och som ett mål för behandling 3,4,5,6,7,8,9,10. Vissa studier har funnit en förhöjning av CGRP i kohorter med episodisk migrän i förhållande till kontrolldeltagare10,14,15. Framgången för CGRP-hämmare i kliniska prövningar för behandling av migrän verkar innebära förhöjd CGRP som en orsaksfaktor för migränhuvudvärk. Men inte alla utredare har bekräftat dessa resultat16,17,18,19. Dessutom har CGRP: s roll i icke-huvudvärksymtom på migrän ännu inte klarlagts; det nuvarande arbetet motiverades av en önskan att förstå CGRP: s roll i vestibulära symtom på migrän.
Inkonsekventa CGRP-immunanalysdata i litteraturen kan bero på flera orsaker. För det första är halveringstiden för CGRP i perifer vaskulatur 6,9 min 20, på grund av aktiviteten hos serinproteaser 21, insulinnedbrytande enzymer och andra metalloproteaser 22, neutrala endopeptidaser 23 och endotelinkonverterande enzym-1 24. För det andra beskrivs inte de variabla tekniska detaljerna för de immunanalyser som används för att kvantifiera CGRP fullständigt i sådana studier. Slutligen komplicerar bristen på standardisering av immunanalysmetoden bilden ännu mer.
Denna artikel beskriver ett modifierat enzymkopplat immunosorbentanalysprotokoll (ELISA) som möjliggör rening och noggrann kvantifiering av α- och βCGRP i human plasma. Kitets antikroppar är inte korsreaktiva med amylin, kalcitonin eller substans P. Detta protokoll har genomgått de nödvändiga valideringsexperimenten, såsom spik och återvinning och linjäritet av utspädning, vars data presenteras här. Ett sådant CGRP ELISA-protokoll som har genomgått validering har inte tidigare beskrivits fullständigt i litteraturen. Detta protokoll kan användas för att kvantifiera CGRP i human plasma i samband med migrän såväl som kardiologisk2,25, dermatologisk 26, obstetrisk 27, reumatologisk28,29, muskuloskeletal 30,31, endokrin 32,33 och virussjukdomar 12,13 där CGRP har varit inblandad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll utvecklades med hjälp av humana plasmaprover från samtyckta individer med godkännande från Johns Hopkins Institutional Review Board (NA_00092491).
1. Insamling och beredning av prover
- Samla 5 ml helblod från antecubitalvenen via standard venipunkturmetoder34 i ett 6 ml vakuumtainer etylendiamintetraättiksyra (EDTA) uppsamlingsrör.
- Tillsätt 0,5 ml aprotinin (10 000 KIU/ml) kompetitiv serinproteashämmare till röret efter insamling för att blockera lysen av målpeptiden. Invertera röret 10 gånger så att aprotinin kan blandas tillräckligt med blodet. Förvara sedan rören på is tills nästa steg.
- Centrifugera röret vid 604 x g i 4 min vid 4 °C inom 60 minuter efter blodinsamlingen.
- Ta av plasmafraktionen med en pipett och överför till 2 ml sterila kryovialer med rundbotten.
- Förvara omedelbart kryovialerna vid -80 °C i upp till 2 veckor.
2. Extraktion av plasmaproverna
- Placera en extraktionspatron inuti ett 15 ml koniskt centrifugrör med patronens yttre åsar som stöds av rörets yttre åsar.
- Aktivera cylinderampullen genom att först passera 5 ml 100 % metanol och sedan 10 ml ultrarent vatten genom cylinderampullen.
- När vätska passerar genom patronen via gravitationsdrivet flöde kommer det att samlas i röret.
- Kasta ut överflödig vätska när den ackumuleras för att säkerställa att vätskan inte uppslukar patronen.
- Se till att patronen inte torkar under experimentets gång.
- Späd 250 μL plasma med 750 μl 4% ättiksyra.
- För 1 ml plasma- och ättiksyralösning långsamt genom cylinderampullen.
OBS: Detta steg bör ta cirka 30 s via gravitationsdrivet flöde för varje milliliter som passerar. - Tvätta cylinderampullen med 10 ml 4% ättiksyra. Som gjort tidigare, kasta ut överflödig vätska när den ackumuleras för att säkerställa att vätskan inte uppslukar patronen.
- När den sista droppen ättiksyra har släppts från patronen, ta bort patronen från röret och placera den i ett nytt 15 ml koniskt centrifugrör.
- Förbered en 10: 1-lösning av 100% metanol och 4% ättiksyra genom att blanda 2,7 ml 4% ättiksyra och 0,3 ml 100% metanol. Använd detta för att eluera CGRP genom att föra denna lösning genom cylinderampullen 1 ml åt gången. Pausa i 25 minuter mellan varje milliliter lösning som passeras. Kasta INTE elueringsmedlet.
- Röret kommer att innehålla 3 ml av den eluerade vätskan 25 minuter efter att den sista millilitern av metanol- och ättiksyralösningen har passerat. Placera varje 1 ml av eluenten i ett 1,7 ml mikrocentrifugrör.
OBS: Detta bör ge tre mikrocentrifugrör från varje patron. - Placera varje rör i en minicentrifug i 1 s för att säkerställa att allt elueringsmedel är i botten av varje rör.
- Torka alla prover genom vakuumcentrifugering vid 4 °C (inställd på koncentratorfunktion, för vattenlösningar, vid 1 400 varv/min; g-kraften varierar beroende på rörens läge och varierar därför mellan 130–250 x g).
OBS: Den tid det tar för vakuumcentrifugen att torka proverna beror på vilken typ av mikrocentrifugrör som används. - Omedelbart innan analysförfarandet inleds (steg 4.1) rekonstitueras det tidigare torkade provet med en buffert av enzymimmunanalys (EIA) (se Materialförteckning) tinad till rumstemperatur (RT) eller 20 °C.
Anmärkning: Den volym MKB-buffert som används för att bereda det torkade provet bör vara lika med den ursprungliga provvolymen, eller 250 μl.
3. Förberedelse av ELISA-plattan - blockering för att begränsa icke-specifik bindning
- Tillsätt 250 μL trisbuffrad saltlösning (TBS)/fiskgelatinblockerande buffert till varje brunn på tallriken.
- Lägg ett täckark över plattan och inkubera i 2 timmar vid RT.
- Ta bort täckplåten och töm plattan genom inversion eller aspiration med en flerkanalig pipett. Torka sedan plattan på en pappershandduk för att kasta alla spår av vätska.
- Torka plattan genom att lämna plattan i en laminär flödeshuv i 10 minuter.
- När plattan är synligt torr, placera den i en greppförseglad foliepåse med en torkmedelspåse av kiselgel och förvara påsen vid -20 °C i 24 timmar.
OBS: Plattorna ska användas inom 4 veckor efter plattinkubation.
4. Före analysförfarandet
- Förbered reagenser (EIA-buffert, CGRP-standard, CGRP-kvalitetskontroll, CGRP-spårämne, tvättbuffert) enligt satsinstruktionerna. Förbered Ellmans reagens först efter att inkubationsperioden på 16-20 timmar är slut.
- Tina alla prover och reagens till RT innan resten av protokollet utförs.
5. Analysförfarande
- Skölj varje brunn i den blockerade plattan fem gånger med en diskbuffert (300 μl/brunn). För varje sköljning, pausa 30 s efter att ha placerat tvättbufferten i brunnarna, kasta sedan ut vätskan eller aspirera med en flerkanalig pipett.
- Efter den slutliga sköljningen, avlägsna all buffert från brunnarna genom inversion (invertera plattan för att driva ut vätskan i brunnar) eller aspiration med en flerkanalig pipett. Tappa de sista dropparna på en pappershandduk och knacka på den inverterade plattan tills all vätska synligt avlägsnas från brunnarna.
- Avsätt minst två brunnar utan reagens eller buffert som ska kallas "tomma" brunnar. Avsätt sedan minst två andra brunnar för icke-specifik bindning (NSB).
- Fördela 100 μL MKB-buffert i varje NSB-brunn.
- Fördela 100 μL CGRP-standarderna i två exemplar i lämpliga brunnar.
- Fördela 100 μl prover (rekonstituerade i MKB-buffert) och kvalitetskontroll i två exemplar i lämpliga brunnar.
- Dispensera 100 μL CGRP-spårämne (anti-CGRP-antikropp bunden till acetylkolinesteras) till varje brunn som innehåller NSB, CGRP-standarder, prover och kvalitetskontroll. Dosera inte spårämnen till de "tomma" brunnarna.
- Täck plattan med ett genomskinligt täckark och försegla varje brunn så att proverna och reagenserna i varje brunn inte avdunstar avsevärt. Inkubera plattan i 16–20 timmar vid 4 °C.
- När inkubationen är avslutad, rekonstituera Ellmans reagens enligt satsens instruktioner.
- Vänd plattan för att ta bort all vätska. Skölj varje brunn (enligt beskrivningen ovan) tre gånger med 300 μL tvättbuffert.
- Efter den tredje sköljningen, ta bort vätskan från plattorna, placera plattan på en skakplatta och skaka vid 120 rpm i 2 minuter.
- Tvätta plattan ytterligare tre gånger. Efter den sista sköljningen, avlägsna all buffert från brunnarna genom inversion eller aspiration med en flerkanalig pipett. Tappa de sista dropparna vätska på en pappershandduk och knacka på den inverterade plattan tills all vätska synligt avlägsnas från brunnarna.
OBS: De ytterligare tre tvättarna som beskrivs i detta steg kanske inte är nödvändiga om du använder en ELISA-mikroplattbricka. - Fördela 200 μL av Ellmans reagens i varje brunn (exklusive "Blank"-brunnarna).
- Täck plattan med ett nytt täckplåt och linda in den i aluminiumfolie för att förhindra ljusexponering. Inkubera i mörker vid rumstemperatur i 1 timme.
- Se till att det inte finns någon vätska på baksidan av plattan som kan förvirra spektrofotometeravläsningen genom att torka baksidan med en torr pappershandduk.
- Läs plattan för absorbans vid 405 nm (gul färg).
6. Analys av data
- Beräkna den genomsnittliga absorbansen för varje "Blank", NSB, standard, kvalitetskontroll och proverna.
- Subtrahera NSB: s genomsnittliga absorbansvärden från standard-, kvalitetskontroll- och provabsorbansvärdena.
- Plotabsorbans på y-axeln och koncentration på x-axeln. Konstruera en standardkurva med hjälp av en logistisk regressionsmodell med fyra parametrar.
- När kurvan är konstruerad, använd kurvans ekvation för att bestämma de interpolerade koncentrationerna för kvalitetskontroll och prover, som kan läsas på x-axeln.
Standardkurvan valideras endast om den beräknade interpolerade koncentrationen för kvalitetskontrollen ligger inom 25 % av den förväntade koncentrationen (vanligtvis 125 pg/ml, men se etiketten på injektionsflaskan med kvalitetskontroll).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det finns flera viktiga steg i protokollet som bör markeras. För det första måste aprotinin, en serinproteashämmare, tillsättas till helblodsprover omedelbart efter insamling för att förhindra ytterligare enzymatisk nedbrytning av CGRP. Serinproteaser har visat sig spela en roll i CGRP-metabolismen, och en tidigare studie har också använt aprotinin för att kvantifiera CGRP hos människor21,35. Om proteashämmare inte används, och provberedningen tar längre tid än 60 minuter, kan man förvänta sig minskade nivåer av CGRP vid utförande av ELISA. För det andra koncentrerar fastfasextraktion före ELISA CGRP i eluenten och eliminerar potentiellt störande molekyler från plasmamatrisen. Detta extraktionssteg ökar utbytet av CGRP i spik- och återhämtningsexperiment (diskuteras vidare i nästa avsnitt). Vakuumcentrifugering i ett kylrum efter extraktion begränsar ytterligare förlusten av CGRP. För det tredje, före ELISA, måste mikrotiterplattorna blockeras med en blockerande buffert. Detta möjliggör passiv adsorption av icke-specifika proteiner i bufferten till de återstående bindningsställena i plattorna, vilket minskar bakgrundssignalen. Blockering hjälper till att minska orealistiskt höga utbyten av CGRP.
Spik- och återhämtningsexperiment avgör om CGRP-detektion påverkas av skillnaderna mellan standardkurvspädningsmedlet (här EIA-buffert) och experimentell provmatris (här plasma). Plasma och/eller serum kan innehålla molekyler som blockerar antikroppsbindning till CGRP eller bryter ned peptiden, vilket stör analysens förmåga att detektera och kvantifiera startkoncentrationen av CGRP exakt. För detta ändamål lade vi till kända mängder CGRP till plasmaprover - "spikningssteget" - och beräknade hur mycket CGRP som "återvanns" efter extraktion och ELISA. CGRP-lagret erhölls från tillverkaren och förvarades i en frys på -20 °C fram till användning.
Vid spädningsprovningens linjäritet späds ett prov ut i serie och koncentrationerna av CGRP beräknas för varje spädning. Om de utspädda proverna inte uppvisar lämpliga linjära minskningar av CGRP-koncentrationen, skulle detta indikera att EIA-bufferten eller plasman stör detektionen av CGRP vid vissa koncentrationer eller att standardkurvan inte är korrekt inom det område som påverkas. Vid utförandet av det ovan beskrivna spik- och återhämtningsexperimentet spädde vi seriellt de "spikade" proverna; vi spikade ett plasmaprov för att ge en koncentration av CGRP på 200 pg / ml och spädde därefter provet till 100 pg / ml och sedan 50 pg / ml.
Plasmaprover från tre deltagare utan historia av kardiovaskulär, respiratorisk eller nyligen huvudvärk eller neurologiska symtom spikades med olika koncentrationer av CGRP. Protokollet kördes för dessa prover, förutom icke-spikade kontrollprover. Figur 1 visar ett exempel på en plattkarta för spik och återvinning och linjäritet av utspädningsexperiment. En logistisk passning med fyra parametrar utfördes för att skapa en standardkurva som möjliggjorde anpassning utanför det linjära intervallet (tabell 1 och figur 2). Återhämtningsgraden beräknades för varje spikat prov och låg inom det acceptabla intervallet (tabell 2). Spädningens linjäritet visades i de spetsade proverna (figur 3). Tabell 3 visar resultat från ett misslyckat spik- och återhämtningsexperiment som utförts enligt tillverkarens anvisningar och innan de tillagda stegen för att blockera icke-specifik bindning inkluderades. Dessa data visar återvinningsgrader som överstiger den övre gränsen på 125%, vilket indikerar förekomsten av icke-specifik bindning. Efter att ha lagt till stegen i protokollet för att blockera plattan med en blockerande buffert (steg 3.1-3.5) kunde vi minska denna effekt och uppnå acceptabla återvinningsvärden (tabell 2). Hos tre patienter utan migrän eller vestibulära symtom fann vi att den genomsnittliga koncentrationen av CGRP i plasma var 1,68 ± 0,13 pg / ml. Framtida experiment bör syfta till att använda den nuvarande metoden på en större skala av kontrollpatienter.
Figur 1: Exempel på plattkarta. Varje platta ska innehålla standarder, prover, ämnen och NSB-brunnar, alla i två eller tre exemplar. Blankbrunnar bör inte innehålla någon vätska och NSB-brunnar bör innehålla patentskyddad enzymimmunanalysbuffert, enzymkopplad sekundär antikropp och Ellmans reagens. De genomsnittliga absorbansvärdena för NSB-brunnarna bör subtraheras från standardens absorbansvärden innan standardkurvan skapas. De genomsnittliga absorbansvärdena för NSB-brunnarna bör också subtraheras från provernas absorbansvärden innan den procentuella utbytesprocenten beräknas. Det finns ingen effekt av plattans position. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Exempel på en standardkurva för logistisk regression med fyra parametrar (4PL). Denna standardkurva beskrivs matematiskt med en ekvation i en liknande form som den som ses i tabell 1. En 4PL-regressionskurva är bättre anpassad till biologiska system jämfört med linjära kurvor. Denna kurva och ekvation används för att interpolera kvalitetskontroller och prover på samma platta som standarden skapades på. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Linjäritet i utspädningslinjediagram som visar prover spetsade vid 200 pg/ml och sedan serieutspätt 1:2 och 1:4. Dessa data visar linjäritet över ett brett spektrum av utspädningar, vilket indikerar att analysmetoden är korrekt över ett brett spektrum av CGRP-koncentrationer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Parameter | Värde |
| X50 | 294.75 |
| Ekvation |  |
| Ekvationsform |  |
Tabell 1: Exempel på standardkurvekvation för afour-parameter logistisk (4PL) regressionskurva med titrar X50. En 4PL-regressionskurva rymmer för komplexiteten som ses i biologiska system. Denna kurva användes för att analysera resultaten av ELISA, eftersom den är mer lämplig än linjär regression.
| Absorbans (OD) | Interpolerad koncentration (pg/ml) | Procentuell avkastning | |
| Ospikad kontroll | -0.0434 | Faller inte på kurvan (dvs ~0) | |
| Spikad vid 200 pg/ml | 0.2712 | 214,7 ± 23,4 | 107.40% |
| Spikad vid 100 pg/ml | 0.0966 | 102,7 ± 2,35 | 102.70% |
| Spikad vid 50 pg/ml | 0.0205 | 55,1 ± 12,65 | 110.20% |
Tabell 2: Resultat av ett framgångsrikt spik- och återhämtningsexperiment av tre kontrolldeltagare på grund av brist på fastfasextraktion och plattblockering. Procentandelen av utbytet för spikade prover föll alla inom 20% av det ideala 100% utbytet, vilket indikerar att CGRP-detektion inte påverkas av den experimentella provmatrisen i plasma.
| Absorbans (OD) | Interpolerad koncentration (pg/ml) | Procentuell avkastning | |
| Ospikad kontroll | -0.2087 | Faller inte på kurvan (dvs ~0) | |
| Spikad vid 200 pg/ml | 2.371 | 264,2 ± 104 | 132.10% |
| Spikad vid 100 pg/ml | 1.134 | 167,5 ± 31,2 | 167.50% |
| Spikad vid 50 pg/ml | 0.3218 | 80,55 ± 4,54 | 161.10% |
Tabell 3: Resultat av ett misslyckat spik- och återhämtningsexperiment av tre kontrolldeltagare på grund av brist på plattblockering. Procentandelen avkastning för spikade prover föll alla långt över den övre gränsen på 120% avkastning, vilket indikerar att analysen kan skadas av NSB. Efter att ha erhållit dessa resultat lade vi till steg 3.1-3.5 i protokollet för att blockera NSB på plattan före analysen.
| Absorbans (OD) | Interpolerad koncentration (pg/ml) | Procentuell avkastning | |
| Ospikad kontroll | 0.0401 | 12.93 | |
| Spikad vid 100 pg/ml | 0.0315 | 10.17±2.31 | 10.17% |
| Spikad vid 50 pg/ml | 0.0152 | 4.895±15.4 | 9.79% |
| Spikad vid 25 pg/ml | 0.0007 | 0.2177±6.43 | 0.87% |
Tabell 4: Resultat av ett misslyckat spik- och återhämtningsexperiment av tre kontrolldeltagare. Procentandelen avkastning för spikade prover föll alla långt under den nedre gränsen på 80% avkastning, vilket indikerar att ytterligare optimering behövdes för att hantera eventuell nedbrytning och konkurrenskraftiga bindningsprocesser. Dessa resultat är från en annan tillverkares kompetitiva ELISA-analys, med en lägre detektionsgräns på 2,23 pg / ml, och intra-analys cv < 10% och inter-assay cv < 12%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna artikel beskriver ett validerat protokoll som möjliggör detektion och kvantifiering av CGRP i human plasma. Detta protokoll syntetiserades efter att kommersiella CGRP ELISA-kit inte korrekt kvantifierade denna molekyl. Efter att ha upprättat ett provberedningsprotokoll och en giltig standardkurva visade spik och återhämtning och linjäritet av utspädningsexperiment att andelen återvinningar var mycket lägre än förväntat. Liknande resultat hittades med hjälp av ett annat kommersiellt CGRP ELISA-kit (tabell 4). Som referens är den allmänt accepterade standardåtervinningen 80–120 %36. Dessa resultat kan tyda på förekomst av proteasaktivitet som bryter ned CGRP21,22,23,24, andra molekyler som binder till CGRP, vilket begränsar dess tillgänglighet för bindning till plattans antikroppar, eller kompetitiv bindning av icke-målproteiner till plattans antikroppar.
För att kontrollera för dessa möjliga confounders optimerades ett extraktionsprotokoll för att rena plasma genom extraktion med en proprietär sorbent före ELISA. Denna sorbent isolerar uppenbarligen polära molekyler såsom CGRP. För att bestämma effekten av extraktion före ELISA spetsade humana plasmaprover med kända koncentrationer av CGRP när positiva kontroller genomgick extraktion och sedan ELISA. Dessa spikade prover gav endast ~ 50% -60% återhämtning. Dessa resultat indikerade att exogent tillsatt CGRP inte detekteras i plasma, vilket man kan förvänta sig.
Olika andra steg i protokollet optimerades: tillsats av serinproteashämmare till helblodsprover före centrifugering för att hämma nedbrytning21, sänkning av temperaturen vid vakuumcentrifugering efter extraktion och justering av resuspensionsmetoder efter centrifugering. Ett spik- och återhämtningsexperiment efter dessa förändringar avslöjade orealistiskt höga CGRP-koncentrationer, en återhämtning på mer än 120% (tabell 3). Betryggande nog rapporterades också nyligen högre värden än väntat efter extraktion med en liknande analys av Messlinger et al.37, vilket indikerar att detta fortfarande är ett problem. Messlinger et al. erkänner att analysen efter plasmaextraktion inte reproducerar realistiska CGRP-koncentrationer, utan att ge en anledning till detta fenomen37.
Vi antog att den återstående bindningskapaciteten på ELISA-mikrotiterplattorna som orsakar icke-specifik bindning kan vara ansvarig för de höga återvinningshastigheterna. Före ELISA inkuberades plattan med en blockerande buffert, TBS/fiskgelatinbuffert, för att minska denna bindningsförmåga. Detta ytterligare steg resulterade i lämpligare återvinningsgrader (tabell 2). Således förblir de modifieringar och optimeringar som diskuterats ovan, inklusive användningen av blockeringsbufferten, kritiska steg i protokollet. Dessa steg har möjliggjort en lägre detektionsgräns på 1,05 pg / ml, jämfört med den ursprungliga tillverkarens kit listad som 2 pg / ml.
När det gäller felsökning kräver steg 2.10 vakuumcentrifugering för att torka elueringsmedlet. Längden på detta steg har observerats variera beroende på vilken typ av mikrocentrifugrör proverna befinner sig i. Med hjälp av mikrocentrifugrören som beskrivs i materialtabellen varar detta steg vanligtvis 5 timmar. Men när alternativa mikrocentrifugrör med större volymer används kan detta steg ta upp till 11 timmar. Ett alternativ till vakuumcentrifugering kan vara frystorkning eller frystorkning av proverna, vilket skulle kräva att proverna fryses efter extraktion. Lyofilisering testades emellertid inte vid konstruktionen av detta protokoll. Dessutom, om systematiskt lägre koncentrationer av CGRP än förväntat hittas, bör man se till att alla reagens, särskilt antikropparna, tinas till rumstemperatur före användning. Instabiliteten hos reagens, såsom antikropps- och spårlösningar, kan bidra till systematiska fel i bindningen av CGRP. Om utbytet fortsätter att vara otillräckligt kan antikroppsbindningen till CGRP påverkas av eluentens relativa surhet (metanol och ättiksyralösning), trots beredning med en buffert. I detta fall skulle ett pH-korrigeringssteg vara ett logiskt tillägg efter beredning med buffert.
Begränsningar av detta protokoll inkluderar de begränsningar som är förknippade med någon ELISA-metodik, särskilt antikroppsinstabilitet38. Antikroppsreagenser måste tinas till rumstemperatur innan de används i testet. Uppvärmning under en längre period kan dock orsaka denaturering och följaktligen minskad effektivitet vid bindning av CGRP. Dessutom kan CGRP genomgå nedbrytning av en mängd olika icke-serinproteaser, vilket leder till ökade falska negativa resultat. Även om detta protokoll begränsar nedbrytningen genom att tillsätta ett serinproteas och begränsa provbehandlingstiden till mindre än 60 minuter, kan nedbrytning fortfarande inträffa. En annan begränsning är bristen på frys-tina cykler testade. Lee et al.39 visade att frys-tina cykler kan öka eller minska serum- och plasmaproteinmängder, beroende på proteinets känslighet. CGRP:s känslighet för frys-tö-cykler har inte testats fullt ut i litteraturen, även om Messlinger et al. har noterat att nivåerna av CGRP minskar vid en cykel av frysning och upptining37. Vidare kan detta protokolls utbyte dra nytta av användningen av protein LoBind-rör, utformade med en hydrofil yta, vilket leder till förbättrad proteinåtervinning.
Vi noterar att dessa valideringsexperiment inte verkar ha utförts av författare till nyligen genomförda studier som kvantifierar CGRP i human plasma 16,18,35,40,41. En översyn av ELISA-metoden av Messlinger m.fl.37 betonar behovet av sådana kontroller och ifrågasätter studier som inte har använt dem. Vi tror att vårt arbete med att validera och standardisera ett protokoll kommer att ge framtida CGRP-forskning en bättre grund. Konsekvenserna av ett sådant protokoll är omfattande och kan teoretiskt utvidgas till att undersöka CGRP:s biomarkörstatus i neurologiska och icke-neurologiska sjukdomsprocesser 2,25,26,27,28,29,30,31,32,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga ytterligare upplysningar att lägga till.
Acknowledgments
Vi vill tacka Robert N. Cole, Lauren R. DeVine och Marcos Iglesias för deras hjälpsamma diskussioner om detta protokoll. Detta stöddes delvis av finansiering från American Otological Society (Fellowship Grant, PSK), American Hearing Research Foundation (90066548/90072266, JPC) och National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS), en del av National Institutes of Health (NIH) och NIH Roadmap for Medical Research (UL1 TR003098, NSF). Publikationens innehåll är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis den officiella uppfattningen av Johns Hopkins ICTR, NCATS eller NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube | Sorenson Bioscience, Inc. | 11510 | |
| 99% methanol | ThermoFisher Scientific | L13255.0F | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 14-959-49B | |
| 2 mL round bottom sterile cryovials | CRYO.S | 122263 | |
| 4% acetic acid | ThermoFisher Scientific | 035572.K2 | |
| 6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube | BD | 367863 | |
| Allegra 64R benchtop centrifuge | Beckman Coulter, Inc. | 367586 | |
| Aprotinin | VWR | 76344-814 | |
| CGRP (human) ELISA kit | Bertin Bioreagent | A05481 | |
| CGRP stock | Bertin Bioreagent | ||
| EIA Buffer | Bertin Bioreagent | A07000 | |
| Ellman's Reagent | Bertin Bioreagent | A09000_49+1 | |
| Multichannel pipettes | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges | Waters | WAT094226 | |
| Orbital Shaker | Bellco | 7744-01010 | |
| Precision micropipettes | ThermoFisher Scientific | F144055MG | |
| SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader | Molecular Devices | Part Number M2 | |
| TBS/Fish Gelatin | Bioworld, from Fischer Scientific | 50-199-167 | |
| Ultrapure water ELISA Grade | Bertin Bioreagent | A07001 | |
| Vacufuge plus - Centrifuge Concentrator | Eppendorf | 22820109 | |
| Wash Buffer | Bertin Bioreagent | A17000 |
References
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. -J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Brain, S. D., Grant, A. D. Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiological Reviews. 84 (3), 903-934 (2004).
- Edvinsson, L., Ekman, R., Jansen, I., McCulloch, J., Uddman, R. Calcitonin gene-related peptide and cerebral blood vessels: distribution and vasomotor effects. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 7 (6), 720-728 (1987).
- Donnerer, J., Stein, C. Evidence for an increase in the release of CGRP from sensory nerves during inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 657, 505-506 (1992).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system. Annals of Neurology. 23 (2), 193-196 (1988).
- Markowitz, S., Saito, K., Moskowitz, M. A. Neurogenically mediated leakage of plasma protein occurs from blood vessels in dura mater but not brain. The Journal of Neuroscience. 7 (12), 4129-4136 (1987).
- Saito, K., Markowitz, S., Moskowitz, M. A. Ergot alkaloids block neurogenic extravasation in dura mater: proposed action in vascular headaches. Annals of Neurology. 24 (6), 732-737 (1988).
- Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia. 22 (1), 54-61 (2002).
- Cady, R. K., Vause, C. V., Ho, T. W., Bigal, M. E., Durham, P. L. Elevated saliva calcitonin gene-related peptide levels during acute migraine predict therapeutic response to rizatriptan. Headache. 49 (9), 1258-1266 (2009).
- Cernuda-Morollón, E., et al. Interictal increase of CGRP levels in peripheral blood as a biomarker for chronic migraine. Neurology. 81 (14), 1191-1196 (2013).
- Messlinger, K. The big CGRP flood-sources, sinks and signalling sites in the trigeminovascular system. The Journal of Headache and Pain. 19, 22 (2018).
- Ochoa-Callejero, L., et al. Circulating levels of calcitonin gene-related peptide are lower in COVID-19 patients. Journal of the Endocrine Society. 5 (3), (2021).
- Rizzi, M., et al. CGRP plasma levels correlate with the clinical evolution and prognosis of hospitalized acute COVID-19 patients. Viruses. 14 (10), 2123 (2022).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
- Sarchielli, P., et al. Clinical-biochemical correlates of migraine attacks in rizatriptan responders and non-responders. Cephalalgia. 26 (3), 257-265 (2006).
- Greco, R., et al. Plasma levels of CGRP and expression of specific microRNAs in blood cells of episodic and chronic migraine subjects: towards the identification of a panel of peripheral biomarkers of migraine. The Journal of Headache and Pain. 21 (1), 122 (2020).
- Tvedskov, J. F., et al. No increase of calcitonin gene-related peptide in jugular blood during migraine. Annals of Neurology. 58 (4), 561-568 (2005).
- Pellesi, L., et al. Plasma levels of CGRP during a 2-h infusion of VIP in healthy volunteers and patients with migraine: An exploratory study. Frontiers in Neurology. 13, 871176 (2022).
- Kruuse, C., Iversen, H. K., Jansen-Olesen, I., Edvinsson, L., Olesen, J. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) levels during glyceryl trinitrate (GTN)-induced headache in healthy volunteers. Cephalalgia. 30 (4), 467-474 (2010).
- Kraenzlin, M. E., Ch'ng, J. L., Mulderry, P. K., Ghatei, M. A., Bloom, S. R. Infusion of a novel peptide, calcitonin gene-related peptide (CGRP) in man. Pharmacokinetics and effects on gastric acid secretion and on gastrointestinal hormones. Regulatory Peptides. 10 (2-3), 189-197 (1985).
- Brain, S. D., Williams, T. J. Substance P regulates the vasodilator activity of calcitonin gene-related peptide. Nature. 335 (6185), 73-75 (1988).
- Kim, Y. -G., Lone, A. M., Nolte, W. M., Saghatelian, A. Peptidomics approach to elucidate the proteolytic regulation of bioactive peptides. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8523-8527 (2012).
- Katayama, M., et al. Catabolism of calcitonin gene-related peptide and substance P by neutral endopeptidase. Peptides. 12 (3), 563-567 (1991).
- Hartopo, A. B., et al. Endothelin-converting enzyme-1 gene ablation attenuates pulmonary fibrosis via CGRP-cAMP/EPAC1 pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 48 (4), 465-476 (2013).
- Mair, J., et al. Plasma CGRP in acute myocardial infarction. Lancet. 335 (8682), 168 (1990).
- Antúnez, C., et al. Calcitonin gene-related peptide modulates interleukin-13 in circulating cutaneous lymphocyte-associated antigen-positive T cells in patients with atopic dermatitis. The British Journal of Dermatology. 161 (3), 547-553 (2009).
- Gangula, P. R., et al. Pregnancy and steroid hormones enhance the vasodilation responses to CGRP in rats. The American Journal of Physiology. 276 (1), H284-H288 (1999).
- Hernanz, A., Medina, S., de Miguel, E., Martín-Mola, E. Effect of calcitonin gene-related peptide, neuropeptide Y, substance P, and vasoactive intestinal peptide on interleukin-1beta, interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha production by peripheral whole blood cells from rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients. Regulatory Peptides. 115 (1), 19-24 (2003).
- Takeba, Y., Suzuki, N., Kaneko, A., Asai, T., Sakane, T. Evidence for neural regulation of inflammatory synovial cell functions by secreting calcitonin gene-related peptide and vasoactive intestinal peptide in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism. 42 (11), 2418-2429 (1999).
- Ahmed, M., Srinivasan, G. R., Theodorsson, E., Schultzberg, M., Kreicbergs, A. Effects of surgical denervation on substance P and calcitonin gene-related peptide in adjuvant arthritis. Peptides. 16 (4), 569-579 (1995).
- Neugebauer, V., Rümenapp, P., Schaible, H. G. Calcitonin gene-related peptide is involved in the spinal processing of mechanosensory input from the rat's knee joint and in the generation and maintenance of hyperexcitability of dorsal horn-neurons during development of acute inflammation. Neuroscience. 71 (4), 1095-1109 (1996).
- Wang, L. H., et al. Serum levels of calcitonin gene-related peptide and substance P are decreased in patients with diabetes mellitus and coronary artery disease. The Journal of International Medical Research. 40 (1), 134-140 (2012).
- Zelissen, P. M., Koppeschaar, H. P., Lips, C. J., Hackeng, W. H.
- World Health Organization. WHO Guidelines on Drawing Blood: Best Practices in Phlebotomy. 3, Blood-sampling systems. World Health Organization. , Geneva. (2010).
- Raffaelli, B., et al. Plasma calcitonin gene-related peptide (CGRP) in migraine and endometriosis during the menstrual cycle. Annals of Clinical and Translational Neurology. 8 (6), 1251-1259 (2021).
- Andreasson, U., et al. A practical guide to immunoassay method validation. Frontiers in Neurology. 6, 179 (2015).
- Messlinger, K., et al. CGRP measurements in human plasma-a methodological study. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 41 (13), 1359-1373 (2021).
- Sakamoto, S., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of Natural Medicines. 72 (1), 32-42 (2018).
- Lee, J. -E., Kim, S. Y., Shin, S. -Y. Effect of repeated freezing and thawing on biomarker stability in plasma and serum samples. Osong Public Health and Research Perspectives. 6 (6), 357-362 (2015).
- Fan, P. -C., Kuo, P. -H., Lee, M. T., Chang, S. -H., Chiou, L. -C. Plasma calcitonin gene-related peptide: A potential biomarker for diagnosis and therapeutic responses in pediatric migraine. Frontiers in Neurology. 10, 10 (2019).
- Raffaelli, B., et al. Change of CGRP plasma concentrations in migraine after discontinuation of CGRP-(receptor) monoclonal antibodies. Pharmaceutics. 15 (1), 293 (2023).
