Summary
Os dados publicados relativos às concentrações de peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) no plasma humano são inconsistentes. Essas inconsistências podem ser devidas à falta de uma metodologia padronizada e validada para quantificar esse neuropeptídeo. Aqui, descrevemos um protocolo validado de ensaio imunoenzimático (ELISA) para purificar e quantificar CGRP em plasma humano.
Abstract
O peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) é um neuropeptídeo vasoativo que desempenha um papel putativo na fisiopatologia das enxaquecas e pode ser um candidato ao status de biomarcador. A CGRP é liberada das fibras neuronais após a ativação e induz inflamação neurogênica estéril e vasodilatação arterial na vasculatura que recebe inervação eferente do trigêmeo. A presença de CGRP na vasculatura periférica tem estimulado investigações para detectar e quantificar esse neuropeptídeo no plasma humano usando ensaios proteômicos, como o ensaio imunoenzimático (ELISA). No entanto, sua meia-vida de 6,9 min e a variabilidade nos detalhes técnicos dos protocolos de ensaio, que muitas vezes não são totalmente descritos, têm gerado dados inconsistentes de ELISA CGRP na literatura. Aqui, um protocolo ELISA modificado para purificação e quantificação de CGRP em plasma humano é apresentado. As etapas processuais envolvem coleta e preparação da amostra, extração usando um sorvente polar como meio de purificação, etapas adicionais para bloquear a ligação não específica e quantificação via ELISA. Além disso, o protocolo foi validado com experimentos de spike e recuperação e linearidade de diluição. Este protocolo validado pode, teoricamente, ser usado para quantificar as concentrações de CGRP no plasma de indivíduos não apenas com enxaqueca, mas também com outras doenças nas quais a CGRP pode desempenhar um papel.
Introduction
O peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) é um neuropeptídeo de 37 aminoácidos que está presente em fibras neuronais com localização perivascular, bem como em tecidos não neuronais. As duas formas de CGRP, α- e β-CGRP, compartilham mais de 90% de homologia e compartilham funções fisiológicas; entretanto, o αCGRP é encontrado no sistema nervoso central e periférico, enquanto o βCGRP é encontrado no sistema nervoso entérico 1,2. Após a ativação do nociceptor e exocitose cálcio-dependente, a CGRP é liberada dos neurônios, induzindo inflamação neurogênica estéril envolvendo vasodilatação arterial e extravasamento de proteínas plasmáticas 3,4,5,6,7. A partir daí, a CGRP surge nos vasos pós-capilares e pode ser um biomarcador para doenças que causam ativação nociceptiva aferente, como a migrânea8,9,10,11. De notar, CGRP igualmente tem sido implicado em COVID-19 através de seu papel na angiogénese e modulação imune, e pode prever a evolução desfavorável da doença12,13. Assim, um protocolo para a quantificação precisa de CGRP em plasma humano poderia ter um valor amplo.
A maior atenção talvez tenha sido dada ao papel da CGRP na enxaqueca. Com base em estudos pré-clínicos e clínicos, a CGRP tem sido apontada como um possível biomarcador para enxaqueca e como alvo de tratamento 3,4,5,6,7,8,9,10. Alguns estudos encontraram elevação da CGRP em coortes com migrânea episódica em relação aos participantes controles10,14,15. O sucesso dos inibidores de CGRP em ensaios clínicos para o tratamento da enxaqueca parece implicar CGRP elevado como um fator causal para enxaqueca. Entretanto, nem todos os pesquisadores corroboraram esses resultados16,17,18,19. Além disso, o papel da CGRP nos sintomas não cefálicos da enxaqueca ainda não foi elucidado; o presente trabalho foi motivado pelo desejo de compreender o papel da CGRP nos sintomas vestibulares da migrânea.
Dados inconsistentes de imunoensaio de CGRP na literatura podem ser devidos a várias razões. Em primeiro lugar, a meia-vida da CGRP na vasculatura periférica é de 6,9 min 20, devido à atividade de serinoproteases 21, enzimas degradadoras de insulina e outras metaloproteases 22, endopeptidases neutras 23 e enzima conversora de endotelina-1 24. Em segundo lugar, os detalhes técnicos variáveis dos imunoensaios usados para quantificar a CGRP não são totalmente descritos nesses estudos. Por fim, a falta de padronização da metodologia de imunoensaio complica ainda mais o quadro.
Este artigo descreve um protocolo de ensaio imunoenzimático modificado (ELISA) que permite a purificação e quantificação precisa de α- e βCGRP em plasma humano. Os anticorpos do kit não são reativos cruzados com amilina, calcitonina ou substância P. Esse protocolo passou pelos experimentos de validação necessários, como spike e recuperação e linearidade de diluição, cujos dados são aqui apresentados. Este protocolo de ELISA CGRP que passou por validação não foi descrito anteriormente na literatura. Esse protocolo pode ser utilizado para quantificar a CGRP no plasma humano no contexto da migrânea, bem como das doenças cardiológicas2,25, dermatológicas26, obstétricas27, reumatológicas28,29, musculoesqueléticas30,31, endócrinas32,33 e virais12,13, nas quais a CGRP tem sido implicada.
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Protocol
Este protocolo foi desenvolvido utilizando amostras de plasma humano de indivíduos consentidos, com aprovação do Johns Hopkins Institutional Review Board (NA_00092491).
1. Coleta e preparo das amostras
- Coletar 5 mL de sangue total da veia antecubital por métodos padrão de punção venosa34 em um tubo de coleta de 6 mL de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) vacutainer.
- Adicionar 0,5 mL de inibidor competitivo de serinoprotease de aprotinina (10.000 KUI/mL) ao tubo após a coleta para bloquear a lise do peptídeo alvo. Inverter o tubo 10 vezes para permitir que a aprotinina se misture adequadamente com o sangue. Depois, guarde os tubos no gelo até a próxima etapa.
- Centrifugar o tubo a 604 x g durante 4 minutos a 4 °C no prazo de 60 minutos após a colheita de sangue.
- Retire a fração de plasma com uma pipeta e transfira para crióvios estéreis de fundo redondo de 2 mL.
- Conservar imediatamente os crióscos a -80 °C até 2 semanas.
2. Extração das amostras de plasma
- Coloque um cartucho de extracção dentro de um tubo de centrífuga cónica de 15 ml com as cristas exteriores do cartucho apoiadas pelas cristas exteriores do tubo.
- Ative o cartucho passando primeiro 5 mL de metanol a 100% e, em seguida, 10 mL de água ultrapura através do cartucho.
- À medida que o fluido é passado através do cartucho através do fluxo impulsionado pela gravidade, ele se acumulará no tubo.
- Jogue fora o excesso de líquido à medida que ele se acumula para garantir que o fluido não engula o cartucho.
- Certifique-se de que o cartucho não seque durante o curso do experimento.
- Diluir 250 μL de plasma com 750 μL de ácido acético a 4%.
- Passar lentamente o 1 ml de solução de plasma e ácido acético através do cartucho.
NOTA: Esta etapa deve levar aproximadamente 30 s via fluxo acionado por gravidade para cada mililitro passado. - Lave o cartucho com 10 mL de ácido acético a 4%. Como feito anteriormente, jogue fora o excesso de líquido à medida que ele se acumula para garantir que o fluido não engula o cartucho.
- Depois que a última gota de ácido acético for liberada do cartucho, retire o cartucho do tubo e coloque-o em um novo tubo de centrífuga cônica de 15 mL.
- Preparar uma solução 10:1 de metanol a 100% e ácido acético a 4%, misturando 2,7 ml de ácido acético a 4% e 0,3 ml de metanol a 100%. Use-o para eluir o CGRP passando esta solução através do cartucho 1 mL de cada vez. Pausa por 25 min entre cada mililitro de solução passado. NÃO jogue fora o eluente.
- O tubo conterá 3 mL do líquido eluído 25 minutos após a passagem do último mililitro da solução de metanol e ácido acético. Colocar cada 1 ml do eluente num tubo de microcentrífuga de 1,7 ml.
NOTA: Isso deve render três tubos de microcentrífuga de cada cartucho. - Coloque cada tubo em uma mini centrífuga por 1 s para garantir que todo o eluente esteja no fundo de cada tubo.
- Secar todas as amostras por centrifugação a vácuo a 4 °C (regulado para função concentradora, para soluções aquosas, a 1.400 rpm; a força g varia de acordo com a posição dos tubos e, portanto, varia de 130-250 x g).
NOTA: O tempo necessário para a centrífuga a vácuo secar as amostras dependerá do tipo de tubo de microcentrífuga utilizado. - Imediatamente antes de proceder ao procedimento de ensaio (passo 4.1), reconstituir a amostra previamente seca com tampão de ensaio imunoenzimático (EIA) (ver Tabela de Materiais) descongelada à temperatura ambiente (RT) ou a 20 °C.
NOTA: O volume de tampão EIA utilizado para reconstituir a amostra seca deve ser igual ao volume da amostra original ou 250 μL.
3. Preparação da placa ELISA - bloqueio para limitar a ligação inespecífica
- Adicionar 250 μL de solução salina tris-tamponada (TBS)/tampão de bloqueio de gelatina de peixe a cada poço no prato.
- Coloque uma folha de cobertura sobre a placa e incube por 2 h no TR.
- Retire a folha de cobertura e esvazie a placa por inversão ou aspiração usando uma pipeta multicanal. Em seguida, coloque o prato em um papel toalha para descartar qualquer vestígio de líquido.
- Seque a placa deixando a placa em uma capela de fluxo laminar por 10 min.
- Depois que a placa estiver visivelmente seca, coloque-a em uma bolsa de papel alumínio selada com uma saqueta dessecante de sílica gel e guarde a bolsa a -20 °C por 24 horas.
NOTA: As placas devem ser usadas dentro de 4 semanas após a incubação da placa.
4. Antes do procedimento de ensaio
- Preparar reagentes (tampão EIA, padrão CGRP, controle de qualidade CGRP, traçador CGRP, tampão de lavagem) de acordo com as instruções do kit. Prepare o reagente de Ellman somente após o término do período de incubação de 16-20 h.
- Descongelar todas as amostras e reagentes para RT antes de realizar o restante do protocolo.
5. Procedimento de ensaio
- Enxaguar cada poço na placa bloqueada cinco vezes com um tampão de lavagem fornecido pelo kit (300 μL/poço). Para cada enxágue, pause 30 s depois de colocar o tampão de lavagem nos poços e, em seguida, jogue fora o líquido ou aspirar usando uma pipeta multicanal.
- Após o enxágue final, remova todo o tampão dos poços por inversão (invertendo a placa para expelir o líquido dentro dos poços) ou aspiração usando uma pipeta multicanal. Coloque as últimas gotas em um papel toalha e bata na placa invertida até que todo o líquido seja visivelmente removido dos poços.
- Separe pelo menos dois poços sem reagentes ou tampão para serem conhecidos como poços "em branco". Em seguida, reserve pelo menos outros dois poços para ligação não específica (NSB).
- Distribuir 100 μL de tampão EIA em cada poço NSB.
- Distribuir 100 μL dos padrões CGRP em duplicata em poços apropriados.
- Dispensar 100 μL de amostras (reconstituídas em tampão EIA) e controle de qualidade em duplicata em poços apropriados.
- Dispensar 100 μL do traçador CGRP (anticorpo anti-CGRP ligado à acetilcolinesterase) para cada poço contendo NSB, padrões CGRP, amostras e controle de qualidade. Não dispense traçador para os poços "em branco".
- Cubra a placa com uma folha de cobertura transparente, selando cada poço de modo que as amostras e reagentes em cada poço não evaporem significativamente. Incubar a placa durante 16-20 h a 4 °C.
- Após a conclusão da incubação, reconstitua o reagente de Ellman de acordo com as instruções do kit.
- Inverta a placa para retirar todo o líquido. Enxaguar cada poço (conforme descrito acima) três vezes com 300 μL de tampão de lavagem.
- Após o terceiro enxágue, retire o líquido das placas, coloque a placa em uma placa agitadora e agite a 120 rpm por 2 min.
- Lave o prato mais três vezes. Após o enxágue final, remova todo o tampão dos poços por inversão ou aspiração usando uma pipeta multicanal. Coloque as últimas gotas de líquido em um papel toalha e bata na placa invertida até que todo o líquido seja visivelmente removido dos poços.
NOTA: As três lavagens adicionais descritas nesta etapa podem não ser necessárias se estiver usando uma lavadora de microplacas ELISA. - Distribuir 200 μL do reagente de Ellman em cada poço (não incluindo os poços "Blank").
- Cubra a placa com uma nova folha de cobertura e envolva-a em papel alumínio para evitar qualquer exposição à luz. Incubar no escuro em TR por 1 h.
- Certifique-se de que não há líquido na parte de trás da placa que possa confundir a leitura do espectrofotômetro limpando a parte de trás com uma toalha de papel seca.
- Leia a placa para absorbância a 405 nm (cor amarela).
6. Análise dos dados
- Calcule a absorbância média para cada "Blank", NSB, padrão, controle de qualidade e as amostras.
- Subtrair os valores médios de absorbância do NSB dos valores padrão, de controle de qualidade e de absorbância da amostra.
- Plotar a absorbância no eixo y e a concentração no eixo x. Construa uma curva padrão usando um modelo de regressão logística de quatro parâmetros.
- Uma vez que a curva é construída, use a equação da curva para determinar as concentrações interpoladas para controle de qualidade e amostras, que podem ser lidas no eixo x.
NOTA: A curva padrão só é validada se a concentração interpolada calculada para o controlo de qualidade estiver dentro de 25% da concentração esperada (normalmente 125 pg/ml, mas consulte o rótulo do frasco para injetáveis de controlo de qualidade).
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Representative Results
Existem várias etapas importantes no protocolo que devem ser destacadas. Em primeiro lugar, a aprotinina, um inibidor da serina protease, deve ser adicionada às amostras de sangue total imediatamente após a coleta para evitar maior degradação enzimática da CGRP. Demonstrou-se que as serinoproteases desempenham um papel no metabolismo do CGRP, e um estudo anterior também utilizou a aprotinina na quantificação do CGRP em humanos21,35. Se inibidores de protease não forem usados e a preparação da amostra demorar mais de 60 minutos, pode-se esperar uma diminuição dos níveis de CGRP ao realizar o ELISA. Em segundo lugar, a extração em fase sólida antes do ELISA concentra CGRP no eluente e elimina moléculas potencialmente interferentes da matriz plasmática. Esta etapa de extração aumenta o rendimento do CGRP em experimentos de espiga e recuperação (discutido na próxima seção). A centrifugação a vácuo em uma câmara fria após a extração limita ainda mais a perda de CGRP. Em terceiro lugar, antes do ELISA, as placas de microtitulação devem ser bloqueadas usando um tampão de bloqueio. Isso permite a adsorção passiva de proteínas inespecíficas no tampão aos sítios de ligação remanescentes nas placas, reduzindo assim o sinal de fundo. O bloqueio ajuda a reduzir os rendimentos irrealisticamente altos do CGRP.
Experimentos de spike e recuperação determinam se a detecção de CGRP é afetada pelas diferenças entre o diluente de curva padrão (aqui, tampão EIA) e a matriz de amostra experimental (aqui, plasma). O plasma e/ou o soro podem conter moléculas que bloqueiam a ligação de anticorpos ao CGRP ou degradam o peptídeo, interferindo assim na capacidade do ensaio de detectar e quantificar com precisão a concentração inicial de CGRP. Para este fim, adicionamos quantidades conhecidas de CGRP às amostras de plasma - a etapa de "pico" - e calculamos quanto CGRP foi "recuperado" após a extração e ELISA. O estoque de CGRP foi obtido do fabricante e armazenado em freezer de -20 °C até o uso.
No ensaio de linearidade da diluição, uma amostra é diluída em série e as concentrações de CGRP são calculadas para cada diluição. Se as amostras diluídas não apresentarem diminuições lineares apropriadas na concentração de CGRP, isso indicaria que o tampão EIA ou plasma interfere na detecção de CGRP em algumas concentrações ou que a curva padrão não é precisa na faixa afetada. Ao realizar o experimento de spike e recuperação descrito acima, diluímos em série as amostras "cravadas"; adicionamos uma amostra de plasma para dar uma concentração de CGRP de 200 pg/mL e, posteriormente, diluímos a amostra para 100 pg/mL e, em seguida, 50 pg/mL.
Amostras de plasma de três participantes sem história de sintomas cardiovasculares, respiratórios ou cefaleia recente ou sintomas neurológicos foram aumentadas com diferentes concentrações de CGRP. O protocolo foi executado para essas amostras, além de amostras controle não pontiagudas. A Figura 1 mostra um exemplo de um mapa de placas para experimentos de espiga e recuperação e linearidade de diluição. Um ajuste logístico de quatro parâmetros foi realizado para criar uma curva padrão que permitisse o ajuste além da faixa linear (Tabela 1 e Figura 2). As taxas de recuperação foram calculadas para cada amostra fortificada e estavam dentro da faixa aceitável (Tabela 2). A linearidade da diluição foi demonstrada nas amostras fortificadas (Figura 3). A Tabela 3 mostra os resultados obtidos a partir de um experimento malsucedido de spike e recuperação realizado seguindo as instruções do fabricante e antes da inclusão das etapas adicionais para bloquear a ligação não específica. Esses dados mostram taxas de recuperação excedendo o limite superior de 125%, indicando a presença de vinculação não específica. Após a adição dos passos do protocolo de bloqueio da placa com tampão de blocagem (passos 3.1-3.5), conseguimos reduzir esse efeito e alcançar valores aceitáveis de recuperação (Tabela 2). Em três pacientes sem migrânea ou sintomas vestibulares, observamos que a concentração média de CGRP no plasma foi de 1,68 ± 0,13 pg/mL. Experimentos futuros devem ter como objetivo utilizar a presente metodologia em uma escala maior de pacientes controle.
Figura 1: Exemplo de mapa de placa. Cada placa deve conter padrões, amostras, espaços em branco e poços NSB, todos em duplicata ou triplicata. Os poços em branco não devem conter líquido, e os poços NSB devem conter tampão de ensaio imunoenzimático patenteado, anticorpo secundário ligado à enzima e reagente de Ellman. Os valores médios de absorbância para os poços NSB devem ser subtraídos dos valores de absorbância do padrão antes de criar a curva padrão. Os valores médios de absorbância dos poços NSB também devem ser subtraídos dos valores de absorbância das amostras, antes do cálculo do percentual de recuperação. Não há efeito da posição da placa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Exemplo de uma curva padrão de regressão logística de quatro parâmetros (4PL). Essa curva padrão é descrita matematicamente por uma equação de forma semelhante à observada na Tabela 1. Uma curva de regressão 4PL é mais adequada aos sistemas biológicos em comparação com as curvas lineares. Essa curva e equação são usadas para interpolar controles de qualidade e amostras na mesma placa em que o padrão foi criado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Linearidade do gráfico de linhas de diluição mostrando amostras cravadas a 200 pg/mL e, em seguida, diluídas em série 1:2 e 1:4. Esses dados demonstram linearidade em uma ampla gama de diluições, indicando que o método de ensaio é preciso em uma ampla gama de concentrações de CGRP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Parâmetro | Valor |
| X50 | 294.75 |
| Equação |  |
| Forma de equação |  |
Tabela 1: Exemplo de equação padrão da curva padrão de regressão de quatro parâmetros logísticos (4PL) com títulos X50. Uma curva de regressão 4PL acomoda a complexidade observada em sistemas biológicos. Essa curva foi utilizada para analisar os resultados do ELISA, por ser mais adequada que a regressão linear.
| Absorbância (OD) | Concentração interpolada (pg/mL) | Rendimento percentual | |
| Controle sem picos | -0.0434 | Não cai na curva (ou seja, ~0) | |
| Cravado a 200 pg/mL | 0.2712 | 214,7 ± 23,4 | 107.40% |
| Cravado a 100 pg/mL | 0.0966 | 102,7 ± 2,35 | 102.70% |
| Cravado a 50 pg/mL | 0.0205 | 55,1 ± 12,65 | 110.20% |
Tabela 2: Resultados de um experimento bem-sucedido de spike e recuperação de três participantes controle devido à falta de extração em fase sólida e bloqueio de placas. A porcentagem de rendimento para as amostras fortificadas ficou dentro de 20% do rendimento ideal de 100%, indicando que a detecção de CGRP não é afetada pela matriz de amostra experimental de plasma.
| Absorbância (OD) | Concentração interpolada (pg/mL) | Rendimento percentual | |
| Controle sem picos | -0.2087 | Não cai na curva (ou seja, ~0) | |
| Cravado a 200 pg/mL | 2.371 | 264,2 ± 104 | 132.10% |
| Cravado a 100 pg/mL | 1.134 | 167,5 ± 31,2 | 167.50% |
| Cravado a 50 pg/mL | 0.3218 | 80,55 ± 4,54 | 161.10% |
Tabela 3: Resultados de um experimento malsucedido de pico e recuperação de três participantes do grupo controle devido à falta de bloqueio de placas. A porcentagem de rendimento para amostras fortificadas caiu bem acima do limite superior de 120% de rendimento, indicando que o ensaio pode estar corrompido pelo NSB. Após a obtenção desses resultados, foram acrescentadas as etapas 3.1-3.5 no protocolo para bloqueio do BNS na placa antes do ensaio.
| Absorbância (OD) | Concentração interpolada (pg/mL) | Rendimento percentual | |
| Controle sem picos | 0.0401 | 12.93 | |
| Cravado a 100 pg/mL | 0.0315 | 10.17±2.31 | 10.17% |
| Cravado a 50 pg/mL | 0.0152 | 4.895±15.4 | 9.79% |
| Cravado a 25 pg/mL | 0.0007 | 0,2177±6,43 | 0.87% |
Tabela 4: Resultados de um experimento malsucedido de pico e recuperação de três participantes de controle. A porcentagem de rendimento para amostras fortificadas caiu bem abaixo do limite inferior de 80% de rendimento, indicando que uma otimização adicional era necessária para lidar com possíveis processos de degradação e ligação competitiva. Estes resultados são provenientes de ensaio ELISA competitivo de outro fabricante, com limite inferior de detecção de 2,23 pg/mL, e cv intraensaio < 10% e cv interensaio < 12%.
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Discussion
Este artigo descreve um protocolo validado que permite a detecção e quantificação de CGRP em plasma humano. Este protocolo foi sintetizado depois que kits comerciais de ELISA CGRP não quantificaram com precisão esta molécula. Após o estabelecimento de um protocolo de preparo da amostra e de uma curva padrão válida, os experimentos de spike e recuperação e linearidade da diluição mostraram que a porcentagem de recuperações foi muito menor do que o esperado. Resultados semelhantes foram encontrados com outro kit comercial de ELISA para CGRP (Tabela 4). Para referência, a recuperação padrão amplamente aceita é de 80-120%36. Esses resultados podem sugerir a presença de atividade proteásica degradando o CGRP21,22,23,24, outras moléculas se ligando ao CGRP, limitando assim sua disponibilidade para ligação aos anticorpos da placa, ou ligação competitiva de proteínas não-alvo aos anticorpos da placa.
Para controlar esses possíveis fatores de confusão, um protocolo de extração foi otimizado para purificar o plasma através da extração com um sorvente patenteado antes do ELISA. Este sorvente isola ostensivamente moléculas polares como CGRP. Para determinar a eficácia da extração antes do ELISA, amostras de plasma humano com concentrações conhecidas de CGRP como controles positivos foram submetidas à extração e, em seguida, ELISA. Essas amostras cravadas produziram apenas ~50%-60% de recuperação. Esses resultados indicaram que a adição exógena de CGRP não é detectada no plasma, como seria de se esperar.
Várias outras etapas do protocolo foram otimizadas: adição de inibidor de serina protease em amostras de sangue total antes da centrifugação para inibir a degradação21, redução da temperatura de centrifugação a vácuo após a extração e ajuste dos métodos de ressuspensão pós-centrifugação. Um experimento de pico e recuperação após essas mudanças revelou concentrações irrealisticamente altas de CGRP, uma recuperação superior a 120% (Tabela 3). De forma tranquilizadora, valores acima do esperado também foram relatados recentemente após a extração usando um ensaio semelhante de Messlinger et al.37, indicando que isso continua sendo um problema. reconhecem que o ensaio após extração plasmática não reproduz concentrações realísticas de CGRP, sem fornecer uma razão para esse fenômeno37.
Nós hipotetizamos que a capacidade de ligação residual nas placas de microtitulação de ELISA causando ligação inespecífica pode ser responsável pelas altas taxas de recuperação. Antes do ELISA, a placa foi incubada com um tampão de bloqueio, TBS/tampão gelatina de peixe, para reduzir essa capacidade de ligação. Essa etapa adicional resultou em taxas de recuperação mais adequadas (Tabela 2). Assim, as modificações e otimizações discutidas acima, incluindo o uso do buffer de bloqueio, permanecem etapas críticas no protocolo. Essas etapas permitiram um limite inferior de detecção de 1,05 pg/mL, comparado ao do kit original do fabricante, listado como 2 pg/mL.
Em relação à solução de problemas, a etapa 2.10 exige centrifugação a vácuo para secar o eluente. Observou-se que o comprimento desta etapa varia dependendo do tipo de tubo de microcentrífuga em que as amostras se encontram. Utilizando os tubos de microcentrífuga descritos na Tabela de Materiais, essa etapa costuma durar 5 h. No entanto, quando tubos alternativos de microcentrífuga de maiores volumes são utilizados, essa etapa pode durar até 11 h. Uma alternativa à centrifugação a vácuo pode ser a liofilização ou liofilização das amostras, o que exigiria que as amostras fossem congeladas após a extração. No entanto, a liofilização não foi testada na construção desse protocolo. Além disso, se forem encontradas concentrações sistematicamente abaixo do esperado de CGRP, deve-se garantir que todos os reagentes, especialmente os anticorpos, sejam descongelados à temperatura ambiente antes do uso. A instabilidade de reagentes, como as soluções de anticorpos e traçadores, poderia contribuir para o erro sistemático na ligação ao CGRP. Se o rendimento continuar a ser inadequado, a ligação de anticorpos ao CGRP pode ser afetada pela acidez relativa do eluente (solução de metanol e ácido acético), apesar da reconstituição com um tampão. Neste caso, uma etapa de retificação do pH seria uma adição lógica após a reconstituição com tampão.
As limitações desse protocolo incluem as limitações associadas a qualquer metodologia de ELISA, especificamente a instabilidade de anticorpos38. Os reagentes de anticorpos devem ser descongelados à temperatura ambiente antes da utilização no ensaio; no entanto, o aquecimento por um período prolongado pode causar desnaturação e, consequentemente, diminuição da eficácia na ligação ao CGRP. Além disso, CGRP pode sofrer degradação por uma variedade de proteases não-serinas, levando ao aumento de resultados falso-negativos. Embora este protocolo limite a degradação adicionando uma serina protease e limitando o tempo de processamento da amostra a menos de 60 min, a degradação ainda pode ocorrer. Outra limitação é a falta de ciclos de congelamento-descongelamento testados. Lee et al.39 demonstraram que os ciclos de congelamento-descongelamento podem aumentar ou diminuir as quantidades de proteínas séricas e plasmáticas, dependendo da suscetibilidade da proteína. A suscetibilidade do CGRP aos ciclos de congelamento-descongelamento não foi totalmente testada na literatura, embora Messlinger e col. tenham observado que os níveis de CGRP diminuem após um ciclo de congelamento e descongelamento37. Além disso, o rendimento deste protocolo pode se beneficiar do uso de tubos de proteína LoBind, projetados com uma superfície hidrofílica, levando assim a uma melhor recuperação de proteínas.
Ressalta-se que esses experimentos de validação não parecem ter sido realizados por autores de estudos recentes quantificando CGRP em plasma humano 16,18,35,40,41. Uma revisão da metodologia ELISA por Messlinger et al.37 enfatiza a necessidade de tais controles e questiona estudos que não os utilizaram. Acreditamos que nosso trabalho de validação e padronização de um protocolo colocará em melhores bases futuras pesquisas com CGRP. As implicações de tal protocolo são amplas e teoricamente podem ser estendidas para a investigação do status de biomarcador de CGRP em processos patológicos neurológicos e não neurológicos2,25,26,27,28,29,30,31,32,33.
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Disclosures
Os autores não têm mais divulgações a acrescentar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Robert N. Cole, Lauren R. DeVine e Marcos Iglesias por suas discussões úteis sobre este protocolo. Isso foi apoiado em parte pelo financiamento da American Otological Society (Fellowship Grant, PSK), da American Hearing Research Foundation (90066548/90072266, JPC) e do National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS), um componente dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) e do NIH Roadmap for Medical Research (UL1 TR003098, NSF). O conteúdo da publicação é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a visão oficial do Johns Hopkins ICTR, NCATS ou NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube | Sorenson Bioscience, Inc. | 11510 | |
| 99% methanol | ThermoFisher Scientific | L13255.0F | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 14-959-49B | |
| 2 mL round bottom sterile cryovials | CRYO.S | 122263 | |
| 4% acetic acid | ThermoFisher Scientific | 035572.K2 | |
| 6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube | BD | 367863 | |
| Allegra 64R benchtop centrifuge | Beckman Coulter, Inc. | 367586 | |
| Aprotinin | VWR | 76344-814 | |
| CGRP (human) ELISA kit | Bertin Bioreagent | A05481 | |
| CGRP stock | Bertin Bioreagent | ||
| EIA Buffer | Bertin Bioreagent | A07000 | |
| Ellman's Reagent | Bertin Bioreagent | A09000_49+1 | |
| Multichannel pipettes | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges | Waters | WAT094226 | |
| Orbital Shaker | Bellco | 7744-01010 | |
| Precision micropipettes | ThermoFisher Scientific | F144055MG | |
| SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader | Molecular Devices | Part Number M2 | |
| TBS/Fish Gelatin | Bioworld, from Fischer Scientific | 50-199-167 | |
| Ultrapure water ELISA Grade | Bertin Bioreagent | A07001 | |
| Vacufuge plus - Centrifuge Concentrator | Eppendorf | 22820109 | |
| Wash Buffer | Bertin Bioreagent | A17000 |
References
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