Summary
İnsan plazmasındaki kalsitonin gen ilişkili peptid (CGRP) konsantrasyonları ile ilgili yayınlanmış veriler tutarsızdır. Bu tutarsızlıklar, bu nöropeptidi ölçmek için standartlaştırılmış, doğrulanmış bir metodolojinin eksikliğinden kaynaklanıyor olabilir. Burada, insan plazmasındaki CGRP'yi saflaştırmak ve ölçmek için doğrulanmış bir enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) protokolünü açıklıyoruz.
Abstract
Kalsitonin geni ile ilişkili peptid (CGRP), migren baş ağrılarının patofizyolojisinde varsayılan bir rol oynayan ve biyobelirteç statüsü için aday olabilen vazoaktif bir nöropeptittir. CGRP, aktivasyon üzerine nöronal liflerden salınır ve trigeminal efferent innervasyon alan vaskülatürde steril nörojenik inflamasyon ve arteriyel vazodilatasyonu indükler. Periferik vaskülatüründe CGRP'nin varlığı, enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) gibi proteomik tahliller kullanarak insan plazmasında bu nöropeptidi tespit etmek ve ölçmek için araştırmaları teşvik etmiştir. Bununla birlikte, 6.9 dakikalık yarılanma ömrü ve genellikle tam olarak tanımlanamayan tahlil protokollerinin teknik detaylarındaki değişkenlik, literatürde tutarsız CGRP ELISA verileri vermiştir. Burada, insan plazmasında CGRP'nin saflaştırılması ve nicelleştirilmesi için modifiye edilmiş bir ELISA protokolü sunulmaktadır. Prosedürel adımlar, numune toplama ve hazırlama, saflaştırma aracı olarak polar sorbent kullanarak ekstraksiyon, spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için ek adımlar ve ELISA yoluyla nicelleştirmeyi içerir. Ayrıca, protokol spike ve geri kazanım ve seyreltme deneylerinin doğrusallığı ile doğrulanmıştır. Bu doğrulanmış protokol teorik olarak sadece migren ile değil, aynı zamanda CGRP'nin rol oynayabileceği diğer hastalıklarla da bireylerin plazmasındaki CGRP konsantrasyonlarını ölçmek için kullanılabilir.
Introduction
Kalsitonin geni ile ilişkili peptid (CGRP), perivasküler lokalizasyonu olan nöronal liflerde ve nöronal olmayan dokularda bulunan 37 amino asitlik bir nöropeptittir. CGRP'nin iki formu, α- ve β-CGRP,% 90'dan fazla homolojiyi paylaşır ve fizyolojik fonksiyonları paylaşır; Bununla birlikte, αCGRP merkezi ve periferik sinir sisteminde, βCGRP ise enterik sinir sisteminde bulunur 1,2. Nosiseptör aktivasyonu ve kalsiyuma bağımlı ekzositoz üzerine, CGRP nöronlardan salınır ve arteriyel vazodilatasyon ve plazma protein ekstravazasyonunu içeren steril nörojenik inflamasyonu indükler 3,4,5,6,7. Buradan, CGRP postkapiller damarlarda görülür ve migren 8,9,10,11 gibi afferent nosiseptif aktivasyona neden olan hastalıklar için bir biyobelirteç olabilir. CGRP, anjiyogenez ve immün modülasyondaki rolü nedeniyle COVID-19'a da dahil edilmiştir ve olumsuz hastalık evrimini öngörebilir12,13. Bu nedenle, insan plazmasında CGRP'nin doğru bir şekilde ölçülmesi için bir protokol geniş bir değere sahip olabilir.
Belki de en çok dikkat CGRP'nin migrendeki rolüne verilmiştir. Preklinik ve klinik çalışmalara dayanarak, CGRP migren için olası bir biyobelirteç ve tedavi için bir hedef olarak ortaya konmuştur 3,4,5,6,7,8,9,10. Bazı çalışmalar, kontrol katılımcılarına göre epizodik migreni olan kohortlarda CGRP yüksekliği bulmuştur10,14,15. CGRP inhibitörlerinin migren baş ağrısı tedavisi için klinik çalışmalardaki başarısı, migren baş ağrıları için nedensel bir faktör olarak yüksek CGRP'yi ima ediyor gibi görünmektedir. Bununla birlikte, tüm araştırmacılar bu sonuçları doğrulamamıştır16,17,18,19. Ayrıca, CGRP'nin migrenin baş ağrısı olmayan semptomlarındaki rolü henüz aydınlatılmamıştır; Mevcut çalışma, migrenin vestibüler semptomlarında CGRP'nin rolünü anlama arzusuyla motive edildi.
Literatürdeki tutarsız CGRP immünoassay verileri çeşitli nedenlere bağlı olabilir. İlk olarak, CGRP'nin periferik vaskülatürdeki yarı ömrü, serin proteazlar 21, insülin parçalayıcı enzimler ve diğer metaloproteazlar 22, nötral endopeptidazlar23 ve endotelin dönüştürücü enzim-124'ün aktivitesi nedeniyle 6.9 dakika 20'dir. İkincisi, CGRP'yi ölçmek için kullanılan immünoassayların değişken teknik detayları bu tür çalışmalarda tam olarak tanımlanmamıştır. Son olarak, immünoassay metodolojisinin standardizasyon eksikliği resmi daha da karmaşıklaştırmaktadır.
Bu makalede, insan plazmasında α- ve βCGRP'nin saflaştırılmasına ve doğru bir şekilde nicelleştirilmesine izin veren modifiye enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) protokolü açıklanmaktadır. Kitin antikorları amilin, kalsitonin veya P maddesi ile çapraz reaktif değildir. Bu protokol, verileri burada sunulan ani artış ve geri kazanım ve seyreltmenin doğrusallığı gibi gerekli doğrulama deneylerinden geçmiştir. Validasyondan geçen böyle bir CGRP ELISA protokolü daha önce literatürde tam olarak tanımlanmamıştır. Bu protokol, migrenin yanı sıra kardiyolojik 2,25, dermatolojik26, obstetrik 27, romatolojik28,29, kas-iskelet sistemi30,31, endokrin 32,33 ve CGRP'nin ilişkili olduğu viral hastalıklar12,13 bağlamında insan plazmasındaki CGRP'yi ölçmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, Johns Hopkins Kurumsal İnceleme Kurulu'nun (NA_00092491) onayı ile rıza gösteren bireylerden alınan insan plazma örnekleri kullanılarak geliştirilmiştir.
1. Numune toplama ve hazırlama
- Standart venipunktur yöntemleri 34 ile antekübital venden 5 mL tam kan toplayınve 6 mL'lik bir vakuminer etilendiamintetraasetik asit (EDTA) toplama tüpüne alın.
- Hedef peptidin lizizini bloke etmek için toplandıktan sonra tüpe 0.5 mL aprotinin (10.000 KIU / mL) rekabetçi serin proteaz inhibitörü ekleyin. Aprotinin'in kanla yeterince karışmasını sağlamak için tüpü 10 kez ters çevirin. Daha sonra, tüpleri bir sonraki adıma kadar buz üzerinde saklayın.
- Tüpü 604 x g'de 4 dakika boyunca 4 ° C'de kan toplanmasından sonraki 60 dakika içinde santrifüj edin.
- Plazma fraksiyonunu bir pipetle çıkarın ve 2 mL yuvarlak tabanlı steril kriyovyallere aktarın.
- Kriyoviyalleri hemen -80 ° C'de 2 haftaya kadar saklayın.
2. Plazma örneklerinin ekstraksiyonu
- 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpünün içine, kartuşun dış çıkıntıları tüpün dış çıkıntıları tarafından desteklenen bir ekstraksiyon kartuşu yerleştirin.
- Kartuştan önce 5 mL% 100 metanol ve ardından 10 mL ultra saf su geçirerek kartuşu etkinleştirin.
- Sıvı, yerçekimi tahrikli akış yoluyla kartuştan geçirilirken, tüpte toplanacaktır.
- Sıvının kartuşu yutmamasını sağlamak için biriken fazla sıvıyı dışarı atın.
- Deney sırasında kartuşun kurumadığından emin olun.
- 250 μL plazmayı 750 μL% 4 asetik asit ile seyreltin.
- 1 mL plazma ve asetik asit çözeltisini kartuştan yavaşça geçirin.
NOT: Bu adım, geçirilen her mililitre için yerçekimi güdümlü akış yoluyla yaklaşık 30 s sürmelidir. - Kartuşu 10 mL% 4 asetik asit ile yıkayın. Daha önce yapıldığı gibi, sıvının kartuşu yutmamasını sağlamak için fazla sıvıyı biriktikçe atın.
- Son asetik asit damlası kartuştan serbest bırakıldıktan sonra, kartuşu tüpten çıkarın ve yeni bir 15 mL konik santrifüj tüpüne yerleştirin.
- 2.7 mL% 4 asetik asit ve% 0.3 mL% 100 metanol karıştırarak% 100 metanol ve% 4 asetik asitten oluşan 10: 1'lik bir çözelti hazırlayın. Bu çözeltiyi kartuştan bir seferde 1 mL geçirerek CGRP'yi etkisiz hale getirmek için bunu kullanın. Geçirilen her mililitre çözelti arasında 25 dakika duraklayın. Elüenti atmayın.
- Tüp, metanol ve asetik asit çözeltisinin son mililitresi geçtikten 25 dakika sonra 3 mL salınan sıvıyı içerecektir. Elüentin her 1 mL'sini 1,7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
NOT: Bu, her kartuştan üç mikrosantrifüj tüpü vermelidir. - Tüm elüentin her tüpün dibinde olduğundan emin olmak için her tüpü 1 s boyunca mini bir santrifüje yerleştirin.
- Tüm numuneleri 4 °C'de vakum santrifüjleme ile kurutun (sulu çözeltiler için 1.400 rpm'de yoğunlaştırıcı işlevine ayarlayın; g-kuvveti tüplerin konumuna bağlı olarak değişir ve bu nedenle 130-250 x g arasında değişir).
NOT: Vakumlu santrifüjün numuneleri kurutması için geçen süre, kullanılan mikrosantrifüj tüpünün tipine bağlı olacaktır. - Tahlil prosedürüne geçmeden hemen önce (adım 4.1), önceden kurutulmuş numuneyi oda sıcaklığına (RT) veya 20 ° C'ye çözülmüş enzim immünoassay (EIA) tamponu (bakınız Malzeme Tablosu) ile yeniden oluşturun.
NOT: Kurutulmuş numuneyi yeniden oluşturmak için kullanılan ÇED tamponunun hacmi, orijinal numune hacmine veya 250 μL'ye eşit olmalıdır.
3. ELISA plakasının hazırlanması - spesifik olmayan bağlamayı sınırlamak için bloke etme
- Tabaktaki her bir kuyucuğa 250 μL tris tamponlu salin (TBS)/balık jelatin bloke edici tampon ekleyin.
- Plakanın üzerine bir kapak tabakası yerleştirin ve RT'de 2 saat boyunca inkübe edin.
- Kapak tabakasını çıkarın ve çok kanallı pipet kullanarak ters çevirerek veya aspirasyon yaparak plakayı boşaltın. Ardından, herhangi bir sıvı izini atmak için plakayı bir kağıt havlu üzerinde kurutun.
- Plakayı laminer akış başlığında 10 dakika boyunca bırakarak kurutun.
- Plaka gözle görülür şekilde kuruduktan sonra, silika jel kurutucu poşet ile kavrama sızdırmaz bir folyo torbaya yerleştirin ve torbayı -20 ° C'de 24 saat boyunca saklayın.
NOT: Plakalar, plaka inkübasyonundan sonraki 4 hafta içinde kullanılmalıdır.
4. Tahlil prosedüründen önce
- Reaktifleri (ÇED tamponu, CGRP standardı, CGRP kalite kontrol, CGRP izleyici, yıkama tamponu) kit talimatlarına göre hazırlayın. Ellman'ın reaktifini ancak 16-20 saatlik inkübasyon süresi sona erdikten sonra hazırlayın.
- Protokolün geri kalanını gerçekleştirmeden önce tüm numuneleri ve reaktifleri RT'ye çözün.
5. Tahlil prosedürü
- Bloke plakadaki her bir kuyucuğu, kit tarafından sağlanan bir yıkama tamponu (300 μL / kuyu) ile beş kez durulayın. Her durulama için, yıkama tamponunu kuyucuklara yerleştirdikten sonra 30 s duraklatın, ardından sıvıyı dışarı atın veya çok kanallı bir pipet kullanarak aspire edin.
- Son durulamadan sonra, ters çevirerek (kuyucukların içindeki sıvıyı dışarı atmak için plakayı ters çevirerek) veya çok kanallı bir pipet kullanarak aspirasyon yaparak tüm tamponu kuyucuklardan çıkarın. Son damlaları bir kağıt havluya yerleştirin ve tüm sıvı kuyucuklardan gözle görülür şekilde çıkarılana kadar ters çevrilmiş plakaya dokunun.
- "Boş" kuyular olarak bilinmesi için reaktifleri veya tamponları olmayan en az iki kuyucuğu bir kenara koyun. Ardından, spesifik olmayan bağlama (NSB) için en az iki kuyu daha ayırın.
- Her NSB kuyucuğuna 100 μL ÇED tamponu dağıtın.
- CGRP standartlarının 100 μL'sini uygun kuyucuklara çift olarak dağıtın.
- 100 μL numuneyi (ÇED tamponunda yeniden yapılandırılmış) ve kalite kontrolünü uygun kuyucuklara çift olarak dağıtın.
- NSB, CGRP standartları, numuneler ve kalite kontrol içeren her bir kuyucuğa 100 μL CGRP izleyici (asetilkolinesteraza bağlı anti-CGRP antikoru) dağıtın. İzleyiciyi "Boş" kuyucuklara dağıtmayın.
- Plakayı şeffaf bir kapak tabakası kullanarak örtün, her bir kuyucuğu kapatın, böylece her bir kuyucuktaki numuneler ve reaktifler önemli ölçüde buharlaşmaz. Plakayı 4 ° C'de 16-20 saat inkübe edin.
- İnkübasyon tamamlandıktan sonra, Ellman'ın reaktifini kit talimatlarına göre yeniden oluşturun.
- Tüm sıvıyı çıkarmak için plakayı ters çevirin. Her bir kuyucuğu (yukarıda açıklandığı gibi) 300 μL yıkama tamponu ile üç kez durulayın.
- Üçüncü durulamadan sonra, sıvıyı plakalardan çıkarın, plakayı bir çalkalayıcı plakaya yerleştirin ve 2 dakika boyunca 120 rpm'de çalkalayın.
- Plakayı üç kez daha yıkayın. Son durulamadan sonra, çok kanallı bir pipet kullanarak ters çevirme veya aspirasyon yoluyla tüm tamponları kuyucuklardan çıkarın. Son damla sıvıyı bir kağıt havluya yerleştirin ve tüm sıvı kuyucuklardan gözle görülür şekilde çıkarılana kadar ters çevrilmiş plakaya dokunun.
NOT: Bu adımda açıklanan ilave üç yıkama, bir ELISA mikroplaka yıkayıcı kullanılıyorsa gerekli olmayabilir. - Her bir kuyucuğa 200 μL Ellman reaktifi dağıtın ("Boş" kuyucuklar hariç).
- Plakayı yeni bir kapak tabakasıyla örtün ve ışığa maruz kalmayı önlemek için alüminyum folyoya sarın. RT'de karanlıkta 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
- Arka tarafı kuru bir kağıt havluyla silerek plakanın arka tarafında, spektrofotometre okumasını karıştırabilecek sıvı olmadığından emin olun.
- 405 nm'de (sarı renk) absorbans için plakayı okuyun.
6. Veri analizi
- Her "Boş", NSB, standart, kalite kontrol ve numuneler için ortalama absorbansı hesaplayın.
- NSB ortalama absorbans değerlerini standart, kalite kontrol ve numune absorbans değerlerinden çıkarın.
- Y eksenindeki absorbansı ve x eksenindeki konsantrasyonu çizin. Dört parametreli lojistik regresyon modeli kullanarak standart bir eğri oluşturun.
- Eğri oluşturulduktan sonra, x ekseninde okunabilen kalite kontrol ve numuneler için enterpolasyonlu konsantrasyonları belirlemek için eğrinin denklemini kullanın.
NOT: Standart eğri, yalnızca kalite kontrol için hesaplanan enterpolasyonlu konsantrasyon beklenen konsantrasyonun% 25'i içindeyse doğrulanır (genellikle 125 pg / mL, ancak kalite kontrol şişesinin etiketine bakın).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokolde vurgulanması gereken birkaç önemli adım vardır. İlk olarak, bir serin proteaz inhibitörü olan aprotinin, CGRP'nin daha fazla enzimatik bozulmasını önlemek için toplandıktan hemen sonra tam kan örneklerine eklenmelidir. Serin proteazların CGRP metabolizmasında rol oynadığı gösterilmiştir ve önceki bir çalışmada da insanlarda CGRP'nin ölçülmesinde aprotinin kullanılmıştır21,35. Proteaz inhibitörleri kullanılmazsa ve numune hazırlama 60 dakikadan uzun sürerse, ELISA uygulandığında CGRP seviyelerinin düşmesi beklenebilir. İkincisi, ELISA'dan önce katı faz ekstraksiyonu, CGRP'yi elüentte yoğunlaştırır ve plazma matrisinden potansiyel olarak müdahale eden molekülleri ortadan kaldırır. Bu ekstraksiyon adımı, spike ve geri kazanım deneylerinde CGRP verimini arttırır (bir sonraki bölümde daha ayrıntılı olarak tartışılmıştır). Ekstraksiyondan sonra soğuk bir odada vakumlu santrifüjleme, CGRP kaybını daha da sınırlar. Üçüncü olarak, ELISA'dan önce, mikrotitre plakaları bir bloke tampon kullanılarak bloke edilmelidir. Bu, tampondaki spesifik olmayan proteinlerin plakalardaki kalan bağlanma bölgelerine pasif adsorpsiyonuna izin verir, böylece arka plan sinyalini azaltır. Engelleme, gerçekçi olmayan yüksek CGRP verimini azaltmaya yardımcı olur.
Ani artış ve geri kazanım deneyleri, CGRP tespitinin standart eğri seyreltici (burada, ÇED tamponu) ile deneysel numune matrisi (burada, plazma) arasındaki farklardan etkilenip etkilenmediğini belirler. Plazma ve / veya serum, CGRP'ye antikor bağlanmasını bloke eden veya peptidi parçalayan moleküller içerebilir, böylece tahlilin CGRP'nin başlangıç konsantrasyonunu doğru bir şekilde tespit etme ve ölçme kabiliyetine müdahale eder. Bu amaçla, plazma örneklerine bilinen miktarlarda CGRP ekledik - "spiking" adımı - ve ekstraksiyon ve ELISA'dan sonra ne kadar CGRP'nin "geri kazanıldığını" hesapladık. CGRP stoğu üreticiden alınmış ve kullanıma kadar -20 °C dondurucuda saklanmıştır.
Seyreltme testinin doğrusallığında, bir numune seri olarak seyreltilir ve her seyreltme için CGRP konsantrasyonları hesaplanır. Seyreltilmiş numuneler CGRP konsantrasyonunda uygun doğrusal düşüşler göstermiyorsa, bu, ÇED tamponunun veya plazmasının bazı konsantrasyonlarda CGRP'nin tespitine müdahale ettiğini veya standart eğrinin etkilenen aralıkta doğru olmadığını gösterir. Yukarıda açıklanan başak ve geri kazanım deneyini gerçekleştirirken, "çivili" örnekleri seri olarak seyrelttik; 200 pg / mL'lik bir CGRP konsantrasyonu vermek için bir plazma numunesini çiviledik ve daha sonra numuneyi 100 pg / mL'ye ve daha sonra 50 pg / mL'ye seyrelttik.
Kardiyovasküler, solunum veya yakın zamanda baş ağrısı veya nörolojik semptomlar öyküsü olmayan üç katılımcıdan alınan plazma örnekleri, farklı CGRP konsantrasyonları ile çivilendi. Protokol, çivili olmayan kontrol örneklerine ek olarak bu örnekler için de çalıştırılmıştır. Şekil 1 , seyreltme deneylerinin başak ve geri kazanımı ve doğrusallığı için bir plaka haritası örneği göstermektedir. Doğrusal aralığın ötesine geçmeye izin veren standart bir eğri oluşturmak için dört parametreli bir lojistik uyum gerçekleştirildi (Tablo 1 ve Şekil 2). İyileşme oranları her bir çivili örneklem için hesaplandı ve kabul edilebilir aralıkta idi (Tablo 2). Seyreltmenin doğrusallığı çivili örneklerde gösterilmiştir (Şekil 3). Tablo 3 , üreticinin talimatlarını izleyerek ve spesifik olmayan bağlamayı engellemek için eklenen adımların dahil edilmesinden önce gerçekleştirilen başarısız bir ani artış ve kurtarma deneyinden elde edilen sonuçları göstermektedir. Bu veriler, spesifik olmayan bağlamanın varlığını gösteren %125'lik üst sınırı aşan kurtarma oranlarını göstermektedir. Bir blokaj tamponu kullanarak plakayı bloke etmek için protokoldeki adımları ekledikten sonra (adım 3.1-3.5), bu etkiyi azaltabildik ve kabul edilebilir geri kazanım değerlerine ulaşabildik (Tablo 2). Migren veya vestibüler semptomları olmayan üç hastada, plazmadaki ortalama CGRP konsantrasyonunun 1.68 ± 0.13 pg / mL olduğunu bulduk. Gelecekteki deneyler, mevcut metodolojiyi daha geniş bir kontrol hastası ölçeğinde kullanmayı amaçlamalıdır.
Şekil 1: Örnek plaka haritası. Her plaka, hepsi çift veya üçlü olarak standartlar, numuneler, boşluklar ve NSB kuyuları içermelidir. Boş kuyucuklar sıvı içermemelidir ve NSB kuyuları tescilli enzim immünoassay tamponu, enzime bağlı ikincil antikor ve Ellman reaktifi içermelidir. NSB kuyucukları için ortalama absorbans değerleri, standart eğri oluşturulmadan önce standardın absorbans değerlerinden çıkarılmalıdır. NSB kuyuları için ortalama absorbans değerleri, geri kazanım yüzdesi hesaplanmadan önce numunelerin absorbans değerlerinden de çıkarılmalıdır. Plaka pozisyonunun bir etkisi yoktur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Dört parametreli lojistik (4PL) regresyon standart eğrisi örneği. Bu standart eğri, Tablo 1'de görülene benzer bir biçimde bir denklemle matematiksel olarak tanımlanmıştır. 4PL regresyon eğrisi, doğrusal eğrilere kıyasla biyolojik sistemlere daha uygundur. Bu eğri ve denklem, kalite kontrollerini ve numuneleri standardın oluşturulduğu aynı plaka üzerinde interpolasyon yapmak için kullanılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: 200 pg/mL'de çivilenmiş, daha sonra seri olarak 1:2 ve 1:4 oranında seyreltilmiş örnekleri gösteren seyreltme çizgisi grafiğinin doğrusallığı. Bu veriler, çok çeşitli seyreltmeler üzerinde doğrusallığı gösterir ve bu da tahlil yönteminin çok çeşitli CGRP konsantrasyonlarında doğru olduğunu gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Parametre | Değer |
| X50 | 294.75 |
| Denklem |  |
| Denklem formu |  |
Tablo 1: X50 titreli afour-parametreli lojistik (4PL) regresyon standart eğri denklemi örneği. Bir 4PL regresyon eğrisi, biyolojik sistemlerde görülen karmaşıklığı barındırır. Bu eğri, doğrusal regresyondan daha uygun olduğu için ELISA'nın sonuçlarını analiz etmek için kullanılmıştır.
| Absorbans (OD) | İnterpolasyonlu konsantrasyon (pg/mL) | Yüzde verim | |
| Çivisiz kontrol | -0.0434 | Eğriye düşmez (yani, ~ 0) | |
| 200 pg/mL'de çivili | 0.2712 | 214.7 ± 23.4 | 107.40% |
| 100 pg/mL'de çivili | 0.0966 | 102,7 ± 2,35 | 102.70% |
| 50 pg/mL'de çivili | 0.0205 | 55,1 ± 12,65 | 110.20% |
Tablo 2: Katı faz ekstraksiyonu ve plaka blokajı eksikliği nedeniyle üç kontrol katılımcısının başarılı bir başak ve iyileşme deneyinin sonuçları. Çivili numuneler için verim yüzdesi, ideal %100 verimin% 20'sine düştü, bu da CGRP tespitinin plazmanın deneysel numune matrisinden etkilenmediğini gösteriyor.
| Absorbans (OD) | İnterpolasyonlu konsantrasyon (pg/mL) | Yüzde verim | |
| Çivisiz kontrol | -0.2087 | Eğriye düşmez (yani, ~ 0) | |
| 200 pg/mL'de çivili | 2.371 | 264.2 ± 104 | 132.10% |
| 100 pg/mL'de çivili | 1.134 | 167,5 ± 31,2 | 167.50% |
| 50 pg/mL'de çivili | 0.3218 | 80,55 ± 4,54 | 161.10% |
Tablo 3: Plaka blokajı eksikliği nedeniyle üç kontrol katılımcısının başarısız bir başak ve iyileşme deneyinin sonuçları. Çivili numuneler için verim yüzdesi,% 120 verimin üst sınırının çok üzerine düştü ve bu da tahlilin NSB tarafından bozulabileceğini gösteriyor. Bu sonuçları elde ettikten sonra, testten önce plakadaki NSB'yi bloke etmek için protokole 3.1-3.5 adımlarını ekledik.
| Absorbans (OD) | İnterpolasyonlu konsantrasyon (pg/mL) | Yüzde verim | |
| Çivisiz kontrol | 0.0401 | 12.93 | |
| 100 pg/mL'de çivili | 0.0315 | 10.17±2.31 | 10.17% |
| 50 pg/mL'de çivili | 0.0152 | 4.895±15,4 | 9.79% |
| 25 pg/mL'de çivili | 0.0007 | 0,2177±6,43 | 0.87% |
Tablo 4: Üç kontrol katılımcısının başarısız bir başak ve iyileşme deneyinin sonuçları. Çivili numuneler için verim yüzdesi, %80'lik verim alt sınırının oldukça altına düştü ve bu da olası bozulma ve rekabetçi bağlama süreçlerini ele almak için daha fazla optimizasyona ihtiyaç duyulduğunu gösterdi. Bu sonuçlar, başka bir üreticinin rekabetçi ELISA testinden, alt tespit sınırı 2.23 pg / mL ve tahlil içi cv% 10 ve tahliller arası cv< <% 12 olan ELISA tahlilinden alınmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, insan plazmasında CGRP'nin tespitine ve miktarına izin veren doğrulanmış bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol, ticari CGRP ELISA kitlerinin bu molekülü doğru bir şekilde ölçmediği tespit edildikten sonra sentezlendi. Bir numune hazırlama protokolü ve geçerli bir standart eğri oluşturduktan sonra, spike ve geri kazanım ve seyreltme deneylerinin doğrusallığı, iyileşme yüzdesinin beklenenden çok daha düşük olduğunu göstermiştir. Farklı bir ticari CGRP ELISA kiti kullanılarak da benzer sonuçlar bulunmuştur (Tablo 4). Referans olarak, yaygın olarak kabul edilen standart geri kazanım% 80-120'dir36. Bu sonuçlar, CGRP21,22,23,24'ü parçalayan proteaz aktivitesinin, CGRP'ye bağlanan diğer moleküllerin varlığını, böylece plakanın antikorlarına bağlanma mevcudiyetini sınırladığını veya hedef olmayan proteinlerin plakanın antikorlarına rekabetçi bağlanmasını önerebilir.
Bu olası karışıklıkları kontrol etmek için, ELISA'dan önce tescilli bir sorbent ile ekstraksiyon yoluyla plazmayı saflaştırmak için bir ekstraksiyon protokolü optimize edildi. Bu sorbent görünüşte CGRP gibi polar molekülleri izole eder. ELISA'dan önce ekstraksiyonun etkinliğini belirlemek için, insan plazma örnekleri, pozitif kontroller ekstraksiyona ve daha sonra ELISA'ya tabi tutuldukça, bilinen CGRP konsantrasyonları ile yükseldi. Bu çivili örnekler sadece ~% 50 -% 60 iyileşme sağladı. Bu sonuçlar, eksojen olarak eklenen CGRP'nin, beklendiği gibi plazmada tespit edilmediğini göstermiştir.
Protokolün diğer çeşitli adımları optimize edildi: santrifüjlemeden önce tam kan örneklerine serin proteaz inhibitörü ekleyerekbozunma 21'i inhibe etmek, ekstraksiyondan sonra vakum santrifüjleme sıcaklığını düşürmek ve santrifüjleme sonrası yeniden süspansiyon yöntemlerini ayarlamak. Bu değişikliklerden sonra yapılan bir ani artış ve iyileşme deneyi, gerçekçi olmayan yüksek CGRP konsantrasyonlarını,% 120'den fazla bir iyileşme olduğunu ortaya koymuştur (Tablo 3). Güven verici bir şekilde, Messlinger ve ark.37 tarafından benzer bir tahlil kullanılarak ekstraksiyondan sonra beklenenden daha yüksek değerler de yakın zamanda bildirilmiştir, bu da bunun bir sorun olmaya devam ettiğini göstermektedir. Messlinger ve ark., plazma ekstraksiyonundan sonraki tahlilin, bu fenomen için bir neden belirtmeden, gerçekçi CGRP konsantrasyonlarını yeniden üretmediğini kabul etmektedir37.
Spesifik olmayan bağlanmaya neden olan ELISA mikrotiter plakaları üzerindeki kalıntı bağlama kapasitesinin yüksek geri kazanım oranlarından sorumlu olabileceğini varsaydık. ELISA'dan önce, plaka bu bağlama kapasitesini azaltmak için bir bloke edici tampon, TBS / balık jelatin tamponu ile inkübe edildi. Bu ek adım, daha uygun iyileşme oranları ile sonuçlandı (Tablo 2). Bu nedenle, engelleme arabelleğinin kullanımı da dahil olmak üzere yukarıda tartışılan değişiklikler ve optimizasyonlar, protokolde kritik adımlar olmaya devam etmektedir. Bu adımlar, orijinal üreticinin kitinin 2 pg/mL olarak listelenmesine kıyasla 1,05 pg/mL'lik daha düşük bir algılama sınırına izin vermiştir.
Sorun giderme ile ilgili olarak, adım 2.10, elüenti kurutmak için vakum santrifüjleme gerektirir. Bu adımın uzunluğunun, numunelerin içinde bulunduğu mikrosantrifüj tüpünün tipine bağlı olarak değiştiği gözlenmiştir. Malzeme Tablosunda açıklanan mikrosantrifüj tüplerini kullanarak, bu adım genellikle 5 saat sürer. Bununla birlikte, daha büyük hacimli alternatif mikrosantrifüj tüpleri kullanıldığında, bu adım 11 saate kadar sürebilir. Vakumlu santrifüjlemeye bir alternatif, numunelerin ekstraksiyondan sonra dondurulmasını gerektiren liyofilizasyon veya numunelerin dondurularak kurutulması olabilir. Bununla birlikte, bu protokolün yapımında liyofilizasyon test edilmemiştir. Ek olarak, beklenenden sistematik olarak daha düşük CGRP konsantrasyonları bulunursa, tüm reaktiflerin, özellikle de antikorların, kullanımdan önce oda sıcaklığına çözülmesi sağlanmalıdır. Antikor ve izleyici çözeltileri gibi reaktiflerin instabilitesi, CGRP'nin bağlanmasında sistematik hataya katkıda bulunabilir. Verim yetersiz kalmaya devam ederse, CGRP'ye bağlanan antikor, bir tamponla sulandırılmasına rağmen, elüentin (metanol ve asetik asit çözeltisi) nispi asitliğinden etkilenebilir. Bu durumda, bir pH düzeltme adımı, tamponla sulandırıldıktan sonra mantıklı bir ekleme olacaktır.
Bu protokolün sınırlamaları, herhangi bir ELISA metodolojisiyle, özellikle antikor instabilitesi38 ile ilişkili sınırlamaları içerir. Antikor reaktifleri, tahlilde kullanılmadan önce oda sıcaklığına çözülmelidir; Bununla birlikte, uzun bir süre ısınma, denatürasyona ve sonuç olarak CGRP'nin bağlanmasında etkinliğin azalmasına neden olabilir. Ek olarak, CGRP çeşitli serin olmayan proteazlar tarafından bozunmaya uğrayabilir ve bu da yanlış negatif sonuçların artmasına neden olabilir. Bu protokol, bir serin proteaz ekleyerek ve numune işleme süresini 60 dakikadan daha azıyla sınırlayarak bozulmayı sınırlandırsa da, bozulma hala meydana gelebilir. Diğer bir sınırlama, test edilen donma-çözülme döngülerinin olmamasıdır. Lee ve ark.39 , donma-çözülme döngülerinin, proteinin duyarlılığına bağlı olarak serum ve plazma protein miktarlarını artırabileceğini veya azaltabileceğini göstermiştir. CGRP'nin donma-çözülme döngülerine duyarlılığı literatürde tam olarak test edilmemiştir, ancak Messlinger ve ark. CGRP seviyelerinin bir donma ve çözülme döngüsü37 üzerine azaldığını belirtmişlerdir. Ayrıca, bu protokolün verimi, hidrofilik bir yüzeyle tasarlanmış protein LoBind tüplerinin kullanımından yararlanabilir ve böylece protein geri kazanımının artmasına neden olabilir.
Bu doğrulama deneylerinin, insan plazmasındaki CGRP'yi ölçen son çalışmaların yazarları tarafından gerçekleştirilmiş gibi görünmediğini not ediyoruz 16,18,35,40,41. ELISA metodolojisinin Messlinger ve ark.37 tarafından gözden geçirilmesi, bu tür kontrollere duyulan ihtiyacı vurgulamakta ve bunları kullanmayan çalışmaları sorgulamaktadır. Bir protokolün doğrulanması ve standartlaştırılması konusundaki çalışmalarımızın gelecekteki CGRP araştırmalarını daha iyi bir temele oturtacağına inanıyoruz. Böyle bir protokolün etkileri çok çeşitlidir ve teorik olarak nörolojik ve nörolojik olmayan hastalık süreçlerinde CGRP'nin biyobelirteç durumunu araştırmaya genişletilebilir 2,25,26,27,28,29,30,31,32,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ekleyeceği başka bir açıklama yoktur.
Acknowledgments
Robert N. Cole, Lauren R. DeVine ve Marcos Iglesias'a bu protokolle ilgili yararlı tartışmaları için teşekkür ederiz. Bu kısmen Amerikan Otoloji Derneği (Fellowship Grant, PSK), Amerikan İşitme Araştırma Vakfı (90066548/90072266, JPC) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin (NIH) bir bileşeni olan Ulusal Translasyonel Bilimleri Geliştirme Merkezi (NCATS) ve NIH Tıbbi Araştırma Yol Haritası (UL1 TR003098, NSF) tarafından finanse edilerek desteklenmiştir. Yayının içeriği yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Johns Hopkins ICTR, NCATS veya NIH'nin resmi görüşünü temsil etmek zorunda değildir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube | Sorenson Bioscience, Inc. | 11510 | |
| 99% methanol | ThermoFisher Scientific | L13255.0F | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 14-959-49B | |
| 2 mL round bottom sterile cryovials | CRYO.S | 122263 | |
| 4% acetic acid | ThermoFisher Scientific | 035572.K2 | |
| 6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube | BD | 367863 | |
| Allegra 64R benchtop centrifuge | Beckman Coulter, Inc. | 367586 | |
| Aprotinin | VWR | 76344-814 | |
| CGRP (human) ELISA kit | Bertin Bioreagent | A05481 | |
| CGRP stock | Bertin Bioreagent | ||
| EIA Buffer | Bertin Bioreagent | A07000 | |
| Ellman's Reagent | Bertin Bioreagent | A09000_49+1 | |
| Multichannel pipettes | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges | Waters | WAT094226 | |
| Orbital Shaker | Bellco | 7744-01010 | |
| Precision micropipettes | ThermoFisher Scientific | F144055MG | |
| SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader | Molecular Devices | Part Number M2 | |
| TBS/Fish Gelatin | Bioworld, from Fischer Scientific | 50-199-167 | |
| Ultrapure water ELISA Grade | Bertin Bioreagent | A07001 | |
| Vacufuge plus - Centrifuge Concentrator | Eppendorf | 22820109 | |
| Wash Buffer | Bertin Bioreagent | A17000 |
References
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. -J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Brain, S. D., Grant, A. D. Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiological Reviews. 84 (3), 903-934 (2004).
- Edvinsson, L., Ekman, R., Jansen, I., McCulloch, J., Uddman, R. Calcitonin gene-related peptide and cerebral blood vessels: distribution and vasomotor effects. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 7 (6), 720-728 (1987).
- Donnerer, J., Stein, C. Evidence for an increase in the release of CGRP from sensory nerves during inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 657, 505-506 (1992).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system. Annals of Neurology. 23 (2), 193-196 (1988).
- Markowitz, S., Saito, K., Moskowitz, M. A. Neurogenically mediated leakage of plasma protein occurs from blood vessels in dura mater but not brain. The Journal of Neuroscience. 7 (12), 4129-4136 (1987).
- Saito, K., Markowitz, S., Moskowitz, M. A. Ergot alkaloids block neurogenic extravasation in dura mater: proposed action in vascular headaches. Annals of Neurology. 24 (6), 732-737 (1988).
- Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia. 22 (1), 54-61 (2002).
- Cady, R. K., Vause, C. V., Ho, T. W., Bigal, M. E., Durham, P. L. Elevated saliva calcitonin gene-related peptide levels during acute migraine predict therapeutic response to rizatriptan. Headache. 49 (9), 1258-1266 (2009).
- Cernuda-Morollón, E., et al. Interictal increase of CGRP levels in peripheral blood as a biomarker for chronic migraine. Neurology. 81 (14), 1191-1196 (2013).
- Messlinger, K. The big CGRP flood-sources, sinks and signalling sites in the trigeminovascular system. The Journal of Headache and Pain. 19, 22 (2018).
- Ochoa-Callejero, L., et al. Circulating levels of calcitonin gene-related peptide are lower in COVID-19 patients. Journal of the Endocrine Society. 5 (3), (2021).
- Rizzi, M., et al. CGRP plasma levels correlate with the clinical evolution and prognosis of hospitalized acute COVID-19 patients. Viruses. 14 (10), 2123 (2022).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
- Sarchielli, P., et al. Clinical-biochemical correlates of migraine attacks in rizatriptan responders and non-responders. Cephalalgia. 26 (3), 257-265 (2006).
- Greco, R., et al. Plasma levels of CGRP and expression of specific microRNAs in blood cells of episodic and chronic migraine subjects: towards the identification of a panel of peripheral biomarkers of migraine. The Journal of Headache and Pain. 21 (1), 122 (2020).
- Tvedskov, J. F., et al. No increase of calcitonin gene-related peptide in jugular blood during migraine. Annals of Neurology. 58 (4), 561-568 (2005).
- Pellesi, L., et al. Plasma levels of CGRP during a 2-h infusion of VIP in healthy volunteers and patients with migraine: An exploratory study. Frontiers in Neurology. 13, 871176 (2022).
- Kruuse, C., Iversen, H. K., Jansen-Olesen, I., Edvinsson, L., Olesen, J. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) levels during glyceryl trinitrate (GTN)-induced headache in healthy volunteers. Cephalalgia. 30 (4), 467-474 (2010).
- Kraenzlin, M. E., Ch'ng, J. L., Mulderry, P. K., Ghatei, M. A., Bloom, S. R. Infusion of a novel peptide, calcitonin gene-related peptide (CGRP) in man. Pharmacokinetics and effects on gastric acid secretion and on gastrointestinal hormones. Regulatory Peptides. 10 (2-3), 189-197 (1985).
- Brain, S. D., Williams, T. J. Substance P regulates the vasodilator activity of calcitonin gene-related peptide. Nature. 335 (6185), 73-75 (1988).
- Kim, Y. -G., Lone, A. M., Nolte, W. M., Saghatelian, A. Peptidomics approach to elucidate the proteolytic regulation of bioactive peptides. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8523-8527 (2012).
- Katayama, M., et al. Catabolism of calcitonin gene-related peptide and substance P by neutral endopeptidase. Peptides. 12 (3), 563-567 (1991).
- Hartopo, A. B., et al. Endothelin-converting enzyme-1 gene ablation attenuates pulmonary fibrosis via CGRP-cAMP/EPAC1 pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 48 (4), 465-476 (2013).
- Mair, J., et al. Plasma CGRP in acute myocardial infarction. Lancet. 335 (8682), 168 (1990).
- Antúnez, C., et al. Calcitonin gene-related peptide modulates interleukin-13 in circulating cutaneous lymphocyte-associated antigen-positive T cells in patients with atopic dermatitis. The British Journal of Dermatology. 161 (3), 547-553 (2009).
- Gangula, P. R., et al. Pregnancy and steroid hormones enhance the vasodilation responses to CGRP in rats. The American Journal of Physiology. 276 (1), H284-H288 (1999).
- Hernanz, A., Medina, S., de Miguel, E., Martín-Mola, E. Effect of calcitonin gene-related peptide, neuropeptide Y, substance P, and vasoactive intestinal peptide on interleukin-1beta, interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha production by peripheral whole blood cells from rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients. Regulatory Peptides. 115 (1), 19-24 (2003).
- Takeba, Y., Suzuki, N., Kaneko, A., Asai, T., Sakane, T. Evidence for neural regulation of inflammatory synovial cell functions by secreting calcitonin gene-related peptide and vasoactive intestinal peptide in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism. 42 (11), 2418-2429 (1999).
- Ahmed, M., Srinivasan, G. R., Theodorsson, E., Schultzberg, M., Kreicbergs, A. Effects of surgical denervation on substance P and calcitonin gene-related peptide in adjuvant arthritis. Peptides. 16 (4), 569-579 (1995).
- Neugebauer, V., Rümenapp, P., Schaible, H. G. Calcitonin gene-related peptide is involved in the spinal processing of mechanosensory input from the rat's knee joint and in the generation and maintenance of hyperexcitability of dorsal horn-neurons during development of acute inflammation. Neuroscience. 71 (4), 1095-1109 (1996).
- Wang, L. H., et al. Serum levels of calcitonin gene-related peptide and substance P are decreased in patients with diabetes mellitus and coronary artery disease. The Journal of International Medical Research. 40 (1), 134-140 (2012).
- Zelissen, P. M., Koppeschaar, H. P., Lips, C. J., Hackeng, W. H.
- World Health Organization. WHO Guidelines on Drawing Blood: Best Practices in Phlebotomy. 3, Blood-sampling systems. World Health Organization. , Geneva. (2010).
- Raffaelli, B., et al. Plasma calcitonin gene-related peptide (CGRP) in migraine and endometriosis during the menstrual cycle. Annals of Clinical and Translational Neurology. 8 (6), 1251-1259 (2021).
- Andreasson, U., et al. A practical guide to immunoassay method validation. Frontiers in Neurology. 6, 179 (2015).
- Messlinger, K., et al. CGRP measurements in human plasma-a methodological study. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 41 (13), 1359-1373 (2021).
- Sakamoto, S., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of Natural Medicines. 72 (1), 32-42 (2018).
- Lee, J. -E., Kim, S. Y., Shin, S. -Y. Effect of repeated freezing and thawing on biomarker stability in plasma and serum samples. Osong Public Health and Research Perspectives. 6 (6), 357-362 (2015).
- Fan, P. -C., Kuo, P. -H., Lee, M. T., Chang, S. -H., Chiou, L. -C. Plasma calcitonin gene-related peptide: A potential biomarker for diagnosis and therapeutic responses in pediatric migraine. Frontiers in Neurology. 10, 10 (2019).
- Raffaelli, B., et al. Change of CGRP plasma concentrations in migraine after discontinuation of CGRP-(receptor) monoclonal antibodies. Pharmaceutics. 15 (1), 293 (2023).
