Support composite à matrice microgel-extracellulaire pour l’impression 3D intégrée de constructions neuronales humaines

L’impression 3D intégrée dans les composites SHAPE surmonte les limitations traditionnelles de la biofabrication pour permettre une modélisation précise des tissus mécaniquement sensibles à l’intérieur d’hydrogels qui ressemblent à l’environnement extracellulaire natif. La boîte à outils SHAPE repose sur la conception modulaire de biomatériaux, ce qui permet de modifier facilement la formulation du support d’impression. Il tire également parti de matériaux à faible coût et d’équipements accessibles pour une adaptation simple par d’autres groupes de recherche.

Cette approche peut être appliquée pour créer des modèles de tissus neuraux humains définis spatialement pour examiner le développement neuronal et la communication dans les troubles neurodégénératifs tels que la maladie de Parkinson. Commencez par préparer la solution de carbonate de calcium dans de l’eau ultrapure à une concentration de deux milligrammes par millilitre. Mélangez-le avec la solution d’alginate à un rapport égal et agitez-le magnétiquement à 650 RPM pendant une heure à température ambiante.

Ensuite, ajoutez de l’acide acétique à ce mélange dans un rapport de un à 500 et remuez à nouveau pendant la nuit. Le lendemain, fragmenter mécaniquement la solution d’alginate gelée en microparticules à 15 000 tr/min pendant 10 minutes à l’aide d’un homogénéisateur. Puis centrifuger pour obtenir les microparticules.

Jetez soigneusement le surnageant et remettez en suspension les particules dans le DMEM, contenant deux hydroxydes de sodium millimolaires et 1% de pénicilline streptomycine. La couleur de la suspension devrait revenir au rouge. Incuber la suspension pendant une nuit à quatre degrés Celsius.

Après incubation, homogénéiser la suspension pendant trois minutes à 15 000 tr/min et centrifuger à 18 500 g pendant 10 minutes. Après centrifugation, retirer le surnageant et observer la pastille pour les microparticules d’alginate bien emballées. Pour générer le composite SHAPE, mélangez la pastille de microparticules d’alginate avec du collagène dilué et neutralisé dans un rapport de deux pour un et pipetez-le de haut en bas sur de la glace.

Transférer le matériau composite généré dans une plaque refroidie de 24 puits. Avant l’impression, dissociez les cellules souches neurales humaines ou hNSC précédemment cultivées en utilisant une solution de trypsine à 0,025% pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, neutraliser la trypsine avec le milieu de croissance et centrifuger la suspension cellulaire à 400 G pendant cinq minutes à température ambiante.

Après avoir retiré le surnageant, remettre en suspension la pastille de cellule dans deux à trois millilitres de milieu de croissance. À l’aide d’une aiguille métallique émoussée de calibre 21, chargez 100 microlitres de microparticules d’alginate serrées dans la seringue. Chargez ensuite la suspension cellulaire préparée dans une seringue.

Pour l’impression, remplacez l’aiguille de chargement par une aiguille métallique émoussée de calibre 27. À l’aide d’un logiciel référencé, une fois la structure à imprimer conçue, cliquez sur générer pour une génération de code G. Insérez la seringue chargée de cellules dans une tête d’extrusion volumétrique sur une bioimprimante à extrusion et enregistrez la longueur de l’aiguille en cliquant sur Démarrer le processus de mesure de la longueur de l’aiguille.

Placez ensuite la plaque de 24 puits chargée de composite SHAPE sur l’imprimante et cliquez sur SHM pour mesurer la hauteur de la surface du puits vide. Sélectionnez pH 2 suivi du symbole de la clé. Ensuite, sous le jeu de paramètres, modifiez le débit volumique à 3,6 microlitres par seconde et appuyez sur Appliquer le paramètre, puis sur Enregistrer et terminé.

Chargez le code G dans l’interface utilisateur de l’imprimante en cliquant sur une icône pour ouvrir le code G. Sélectionnez l’icône du programme d’exécution pour lancer la procédure d’impression. Immédiatement après l’impression, incuber le gel SHAPE à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour le recuit.

Ajoutez ensuite doucement le milieu de croissance au support de gel SHAPE recuit. Pour l’immunomarquage, retirez l’excès de milieu du gel et, à l’aide d’une spatule, transférez le gel dans un récipient contenant du DPBS. Une fois la plaque placée dans la hotte, retirez le DPBS.

Couvrir le gel avec une solution de formaldéhyde à 4% et incuber pendant une heure à température ambiante. Après le lavage avec DPBS, ajoutez la solution bloquante au gel. Balancer doucement la plaque et incuber pendant six heures à température ambiante pour éviter une liaison non spécifique.

Une fois la solution bloquante retirée, ajoutez l’anticorps primaire au gel et secouez-le doucement. Incuber la plaque pendant 48 heures à quatre degrés Celsius. Après le lavage DPBS, traiter de la même manière le gel avec la solution d’anticorps secondaires pendant 24 heures.

Placez le gel coloré à l’aide d’une spatule dans une plaque de puits avec un fond d’imagerie mince avant l’imagerie. Dans la présente étude, l’encre hNSC a imprimé un filament de cellules d’un diamètre d’environ 200 micromètres. Les brins imprimés étaient riches en cellules viables avec une morphologie autour.

Après 30 jours d’impression, les cellules présentaient une morphologie neuronale avec de petits corps cellulaires et de longs processus minces, ce qui indiquait la différenciation réussie des hNSCs. La coloration à la tubuline bêta trois a permis de visualiser les réseaux neuronaux générés avec une géométrie maintenue. Et pendant le processus de différenciation, les cellules n’ont pas migré hors des brins imprimés.

Le composite SHAPE peut être utilisé pour produire des canaux perfusibles en imprimant de l’encre sacrificielle au lieu de cellules. De plus, le support peut inclure des billes sensibles à l’oxygène pour surveiller la tension d’oxygène dans les structures imprimées en 3D dans le temps et l’espace.