Summary
このプロトコルは免疫学の汚損および得られた顕微鏡のハイコンテント画像からのニューロンの表現型のプロフィールの生成に先行している人間の中脳のdopaminergicニューロンの細胞の培養を、記述し、遺伝か化学調節による表現型の変化の同一証明を可能にする。
Abstract
パーキンソン病(PD)は、中脳ドーパミン作動性(mDA)ニューロンの喪失を引き起こすさまざまな細胞生物学的プロセスに関連しています。現在の 多くのin vitro PD細胞モデルは複雑さに欠けており、複数の表現型を考慮していません。ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)由来のmDAニューロンの表現型プロファイリングは、PD関連細胞タイプのニューロン表現型の範囲を同時に並行して測定することで、これらの欠点に対処することができます。ここでは、市販のヒトmDAニューロンから表現型プロファイルを取得して解析するためのプロトコルについて説明します。ニューロン特異的蛍光染色パネルを使用して、核、α-シヌクレイン、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)、および微小管関連タンパク質2(MAP2)関連の表現型を可視化します。記載された表現型プロファイリングプロトコルは、384ウェルプレート、自動リキッドハンドリング、ハイスループット顕微鏡を使用するため、スケーラブルです。プロトコルの有用性は、健康なドナーmDAニューロンおよびロイシンリッチリピートキナーゼ2(LRRK2)遺伝子のPD結合G2019S変異を有するmDAニューロンを用いて例証される。両細胞株をLRRK2キナーゼ阻害剤PFE-360で処理し、表現型の変化を測定した。さらに、クラスタリングまたは機械学習主導の教師あり分類手法を使用して、多次元表現型プロファイルを分析する方法を示します。記載されたプロトコルは、神経疾患のモデリングに取り組んでいる研究者や、ヒトニューロンにおける化合物効果の研究に特に興味を引くでしょう。
Introduction
パーキンソン病(PD)では、さまざまな細胞生物学的プロセスが妨げられています。例えば、ミトコンドリアの機能不全、酸化ストレス、タンパク質分解の欠陥、小胞輸送の破壊、およびエンドリソソーム機能は、中脳ドーパミン作動性(mDA)ニューロンの喪失と関連しており、PD1で一般的に観察されます。したがって、PDには、互いに相互作用して悪化する可能性のある複数の疾患メカニズムが関与しているようです。この機構の相互作用を調査する有用な方法の1つは、中脳ドーパミン作動性(mDA)ニューロンの包括的な表現型フィンガープリントまたはプロファイルの作成です。
表現型プロファイリングは、測定可能な特性のコレクションに基づいてサンプルのプロファイルを作成するアプローチであり、次に、このプロファイルに基づいてサンプルに関する予測を行うことが含まれます2,3。プロファイリングの目的は、多様な特徴を捉えることであり、その一部はこれまで疾患や治療と関連付けられていなかった可能性がある3。その結果、プロファイリングにより、予期しない生物学的プロセスを明らかにすることができます。表現型プロファイリングは、通常、蛍光染色された細胞に依存しており、表現型プロファイルを作成するために、セルペインティングなどの標準化されたアッセイが開発されています4。最近では、表現型プロファイリングは、例えば、低分子の特性評価や、患者由来の線維芽細胞のみに基づくPDサブタイプの正確な予測に適用されています5,6。これらの進歩にもかかわらず、表現型プロファイリングは、LRRK2 G2019SなどのPD関連変異を発現するヒト人工多能性幹細胞(iPSC)由来のmDAニューロンなど、有糸分裂後の分化細胞に適用されることはめったにありません。iPS細胞由来モデルの重要な課題には、分化バッチまたは遺伝子型にわたって微妙または可変の病理学的特徴が存在すること、および単離されたPD表現型が疾患の複雑さを完全に捉えていないという事実が含まれます。さらに、iPS細胞の神経モデルは生理学的に関連性があるが、技術的な複雑さが懸念されるため、PD創薬プロセスで使用されることはほとんどない7,8。
私たちは以前、遺伝的および化合物による表現型の変化に敏感なヒトmDAニューロンにおける複数のPD関連の病態生理学的表現型を測定するための堅牢な方法論を開発しました9。本稿では、mDAニューロンから表現型プロファイルを作成するために、この方法論をさらに最適化したバージョンについて詳しく説明します(図1)。このプロトコルには、高品質のmDAニューロンの使用や技術的な再現性など、前述の表現型プロファイリングアプローチに比べていくつかの利点があります。このプロトコルは、化学的摂動後の生理学的に関連する有糸分裂後mDAニューロンの表現型プロファイリングを、初めて拡張可能な方法で可能にします。完全に分化して凍結保存されたmDAニューロンが市販されており、バッチ間の分化のばらつきが大幅に減少しています。第二に、明確に定義された実験計画(培養期間やエッジウェルの回避など)、自動リキッドハンドリング、自動顕微鏡を使用することで、技術的なばらつきをさらに減らすことができます。さらに、教師なしクラスタリングまたは教師あり分類アプローチを使用した表現型プロファイル分析の最初のステップをここで概説し、表現型プロファイリングデータを分析する方法を示します。このプロトコルは、遺伝的または化学的摂動によって引き起こされるmDAニューロンの表現型の変化に関心のある研究者にとって、特に、スクリーニングキャンペーン中など、非常にスケーラブルな研究セットアップが必要な場合、または毒性作用を決定するために少数の化合物の効果を研究する場合などに使用されます。要約すると、ヒトニューロンの表現型プロファイリングの応用は、複雑な疾患関連の表現型を研究し、薬剤候補の細胞効果を特徴付けるための貴重な技術であると予想されます。
図1:ヒトiPS細胞由来のmDAニューロンから画像ベースの表現型プロファイルを生成するための実験プロトコルの概略図。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Protocol
1.ニューロン播種用の培地とプレートの準備(1日目)
- 1日目にニューロン播種用のプレートを準備するには、使用直前にラミニンを室温(RT)に温めます。ラミニン原液(0.1 mg/mL)を冷たいPBS+/+(Ca2+ およびMg2+)で1/10に希釈して、ラミニン溶液を調製します。
注:すべての試薬は 材料表に記載されています。溶液および緩衝液の組成を 表1〜4に記載する。 - 次に、ポリ-D-リジン(PDL)プレコートした384ウェルプレートの各ウェルに25 μLのラミニン溶液を加え、4°Cで一晩インキュベートします。 コーティングされたプレートは、4°Cで最大1週間保存できます。
注:プロトコルはここで最大1週間一時停止できます。プラスチックフィルムを使用したシールプレートです。 - コンプリートメンテナンス培地を調製し、4°Cで最長1ヶ月間保管します(表1)。
2.ニューロンの融解(0日目)
- 0日目にニューロンを融解するには、ウォーターバスを37°Cに予熱し、完全維持培地を光から保護したRTに平衡化します。
- 市販の凍結ニューロン( 材料表を参照)が入ったバイアルを液体窒素タンクから取り出し、ドライアイスの上に置きます。次に、バイアルをウォーターバスに2分間入れます。液体が完全に解凍されたら、バイアルを70%エタノールで消毒します。.
- 融解したニューロンをP1000ピペット(約370 μL)で吸引し、上下ピペッティングなしで50 mLの遠心チューブに移します。次に、バイアルを630 μLのコンプリートメンテナンス培地ですすぎ、50 mLチューブに一滴ずつ(45°の角度で)分注します。分注しながらゆっくりと攪拌します。
注:細胞の浸透圧破裂を避けるために、培地を一滴ずつゆっくりと分注することが重要です。45°の角度と軽い撹拌により、ピペッティング中の局所浸透圧の高さが最小限に抑えられます。 - 同様に、P1000ピペットで50 mL遠心分離管に1 mLの完全維持培地を加えます。次に、2 mLの完全維持培地をゆっくりと加えます。分注中は慎重に攪拌してください。
- セルを数えます。10 μLのトリパンブルーと10 μLの細胞懸濁液を入れたマイクロチューブを調製し、計数チャンバースライド(10 μL)に加えます。自動セルカウンター( 材料表を参照)または手動で計数します。
- カウント後、ニューロンを含む50 mLチューブを400 x g で室温で5分間遠心分離し、上清を除去します。P1000ピペットと1 mLの完全維持培地を使用して、ペレットを慎重に再懸濁します。次に、必要な容量を添加して目的の濃度(300,000細胞/mL、次のステップも参照)にします。
3.準備したプレートへのニューロンの播種(0日目)
- 0日目に調製したプレートにニューロンを播種するには、コーティングされたプレートを冷蔵庫から取り出し、細胞培養フードの下に置き、RTに約30分間平衡化させます。
- 播種直前に、15 μLのコーティング溶液を自動リキッドハンドラーまたは16チャンネルピペットで吸引します。コーティングの損傷を防ぐために、ウェルあたり約10 μLを残します。
- 次に、ウェルあたり300,000細胞/mL(ステップ2.6で調製)を含む細胞溶液50 μLを16チャンネルピペットで分注し、ウェルあたり15,000個の播種ニューロン、ウェルあたりの最終容量60 μLになります。
- 384ウェルプレートでは、1列目、2列目、23列目、24列目、列A、B、O、Pの使用は避けて、表現型プロファイルに影響を与える可能性のあるエッジ効果を最小限に抑えます。未使用の空のウェルに 80 μL の PBS を充填します。プレートを 37 °C および 5% CO2 でインキュベートします。
4.培地交換または複合処理(3日目)
- ウェルの数に応じて、RTで適切な量の完全メンテナンス培地を予め温めます。
- 中程度の変更が必要な場合は、手順4.4に進みます。化合物処理をご希望の場合は、化合物のストック濃度と使用する溶媒(水、DMSO、メタノールなど)を確認してください。
- 1.5倍濃縮の化合物溶液を調製し、必要なすべての濃度を試験します。コンパウンド希釈液は、完全維持培地を使用して調製します。
注:中性コントロールとして、試験した化合物と同じ濃度の溶媒を使用してください。異なる濃度の複数の化合物または未知の化合物を使用する場合は、表現型プロファイルに対する溶媒の影響を測定するために、別の用量反応実験を実施することをお勧めします。 - 自動ピペッティングシステムを使用する場合は、1.5倍の複合溶液60 μLを384ウェル保存プレートに加えます。または、16チャンネルピペットを使用します。培地の交換が必要な場合は、代わりに60 μLの完全維持培地を追加してください。
- 自動ピペッティングシステムを使用して、ニューロン含有プレートからウェルあたり40 μLの培地を吸引して廃棄し、20 μL/ウェルを保持します。次に、40 μL/ウェルの 1.5 倍化合物溶液を 384 ウェル保存プレートから各ウェルに添加し、目的の最終濃度を得ます。
注:完全な培地交換を行うのではなく、ニューロンカーペットやコーティングの損傷を防ぐために、常にウェルに残留培地を残すことが重要です。 - 神経細胞培養がこのプロトコルに記載されている6日を超えて行われる場合は、2〜3日ごとに培地を交換してください。
5.ニューロンの固定と染色(6〜7日目)
- 6日目と7日目にニューロンを固定して染色するには、すべての分注および洗浄ステップに自動リキッドハンドラーを使用します。または、16チャンネルピペットを使用します。
- Triton X-100 を 1x PBS で希釈して、10% Triton X-100 溶液を調製します。溶液が均一になるまでボルテックスします。4°Cで保存してください。
- ニューロンを固定するには、20 μL/ウェルの 16% PFA を分注し、最終濃度が 4% になるようにします。プレートを室温で30分間インキュベートし、1x PBSで3回洗浄します。最後の洗浄後、20 μL/ウェルのPBSを残します。
注意:PFAは、経口、皮膚、および呼吸器毒性を引き起こすことが知られている有害物質として認識されています。また、目にも脅威を与え、遺伝子変異や癌につながる可能性があります。PFAを適切に取り扱うには、適切な換気を確保することに加えて、目や顔の保護具などの適切な個人用保護具を使用する必要があります。PFAの環境への放出を防ぐことが重要です。 - 透過処理とブロッキングのために、2倍ブロッキング溶液を調製します(表2)。
- 20 μL/ウェルの2倍ブロッキング溶液(最終濃度1倍)を加え、室温で1時間インキュベートし、PBSで1回洗浄します。洗浄後はPBSを20 μL/ウェルに保管してください。
- 一次抗体( 材料表を参照)染色の場合は、2x一次染色バッファー(表3)を調製します。
- 20 μL/ウェルの2x 一次染色バッファー(最終濃度1倍)を加え、4°Cで一晩インキュベートします。 翌朝、7日目にPBSで3回洗います。洗浄後、PBSを20 μL/ウェル残します。
- 二次抗体( 材料表を参照)染色の場合は、2x二次染色バッファーを調製します(表4)。
- 20 μL/ウェルの2x 二次染色バッファー(最終濃度 1x )を加え、光を避けた室温で 2 時間インキュベートし、PBS で 3 回洗浄します。最後の洗浄後、100 μLのPBS/ウェルを残します。
- 蒸発を最小限に抑えるために、プレートにアルミニウムシーリングを追加します。または、プラスチックフィルムとアルミホイルを使用してプレートを覆います。画像取得に進むか、プレートを4°Cで保管してください。
注:プロトコルはここで最大1週間一時停止できます。バックグラウンド蛍光が観察される場合は、ブロッキング時間を長くすることを検討してください。染色が不十分な場合は、一次抗体の濃度を上げるか、インキュベーション時間を増やしてみてください。
- 蒸発を最小限に抑えるために、プレートにアルミニウムシーリングを追加します。または、プラスチックフィルムとアルミホイルを使用してプレートを覆います。画像取得に進むか、プレートを4°Cで保管してください。
6.蛍光染色されたニューロンのイメージング(7日目)
- 7日目に播種、培養、染色したニューロンの画像を取得します。理想的には、自動共焦点蛍光顕微鏡を使用します( 材料表を参照)。または、画像を手動で取得します。
- 405 nm、488 nm、561 nm、647 nmのレーザーを使用して、Hoechst、TH、α-シヌクレイン、MAP2チャネルをそれぞれ取得します(図2)。
注:表現型プロファイリングに十分な量の詳細データを生成するには、40倍の対物レンズを使用し、2 μmで分離された3つのZスライスで構成されるZスタックを使用して16フィールド/ウェルを取得します。ニューロンカーペットにピペッティング関連の損傷がある場合は、これらの領域のイメージングを避けるようにしてください。 - 顕微鏡とカメラに応じて、4つの蛍光チャンネルのそれぞれについて露光時間と励起強度を個別に調整し、蛍光強度の最適なダイナミックレンジを取得します。
注意: イメージングソフトウェアは、多くの場合、理想的な露光時間を決定するためのヒストグラムを提供します。低信号範囲でヒストグラムが左にシフトしすぎる場合は、露光時間が短すぎるか、励起強度が低すぎます。右側の最大信号レベルに鋭い崖がある場合、信号値は飽和しています。この場合、励起強度を下げるか、露光時間を短くしてください。 - .tifなどのロスのないオープン形式で画像を保存します。
7. 画像処理(8日目)
- 定量的な表現型プロファイルの作成には、画像のセグメンテーションと表現型の特徴抽出が必要です。画像のセグメンテーションと特徴抽出には、PhenoLinkソフトウェアを使用します(材料表)。PhenoLinkのインストール手順は、GitHubリポジトリ(https://github.com/Ksilink/PhenoLink)にあります。
注:画像セグメンテーションは、画像内のさまざまなオブジェクトまたは領域を識別して分離するために使用され、表現型特徴抽出は、それらの領域から関連情報を分析および抽出するために使用されます。CellProfiler 10、ImageJ/FIJI 11、Napari12、Knime Analytics Platform13 など、マルチチャンネル蛍光画像から定量的な情報を抽出するための代替ソフトウェアソリューションがいくつか用意されています。 - 照明補正されたRAW画像に対して画像セグメンテーションを実行します。バックグラウンドシグナルが最小になり、所望のセグメント化されたシグナルが生画像のシグナルに対応するように、プレートごとにそれぞれの蛍光チャネル強度閾値を経験的に決定します。同じ日に処理および染色されたプレートは、通常、セグメンテーションに同等のチャネル強度閾値を必要とします。
- 核のサイズと強度を定義して、生きている細胞と死んだ細胞を分離します。40倍の画像を使用する場合は、他のすべてのデフォルトパラメータを保持し、ソフトウェアを実行します。1ウェルあたり126の定量的画像特徴量が計算されます(付表1)。
- 得られた表形式の定量データを使用して、表現型プロファイルを構築し、異なる細胞株または処理条件からの表現型プロファイルを比較します。各行は生物学的条件(ウェル)に対応し、各列は決定された表現型の特徴に対応します。
注: 使用方法を説明するために、データ分析パイプラインとともに出力ファイルの例を提供します ( 材料表を参照)。さらに、 図3 は表現型プロファイルの構成を示しています。
8.表現型プロファイルの生成と視覚化(8日目)
- コンピューターに Python と Jupyter がインストールされていない場合は、Anaconda ディストリビューションをインストールし、Jupyter ソフトウェアを開きます。提供されている Jupyter Notebook とその他すべての提供されているファイルをダウンロードし、同じディレクトリに保存します ( 「材料表」を参照)。Jupyter ソフトウェアを使用して Jupyter Notebook ファイルを開きます。
注:Anacondaは、Pythonなどのプログラミング言語用の無料のオープンソースプラットフォームです。このプラットフォームには、提供された Jupyter Notebook を実行して表現型プロファイル (https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling) を作成および分析できる Python インタープリター Jupyter が付属しています。 - Jupyter ソフトウェアを使用して、Jupyter Notebook をセルごとに実行します。提供されているサンプル データ .fth ファイルと要件 ..txt ファイルは、Jupyter ノートブックと同じディレクトリに配置する必要があります。Jupyter Notebook の各セルには、その機能を説明する注釈が付けられています。
注: Jupyter Notebook は、データの読み込みとスケーリングから正しい順序で使用し、セルごとに最後まで進めることが重要です。すべてのデータとグラフィックスの出力は、Jupyter Notebook ソース ディレクトリに新しく作成されたフォルダーに格納されます。 図 4 は、ワークフローとワークフロー出力を示しています。
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Representative Results
mDAニューロンの表現型プロファイリングは、細胞生物学の複数の側面と実験変調中のそれらの変化を定量化するための効率的な方法です。この方法論を実証するために、この研究では、凍結保存されたLRRK2 G2019Sと健康なドナーmDAニューロンを利用しました。これらのニューロンは約37日間分化しており、有糸分裂後および発現ニューロンマーカー(TUBB3およびMAP2)およびFOXA2と組み合わせたチロシンヒドロキシラーゼ(TH)を含むドーパミン作動性ニューロンマーカーであるが、グリアマーカーのグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)は存在しない14。記載されたプロトコルに従って、両方の細胞株を6日間培養し、LRRK2キナーゼ阻害剤である0.1μMのPFE-360で処理しました。ニューロンは、核染色剤Hoechstと、α-シヌクレイン、TH、およびMAP2に対する抗体を使用して染色しました(図2)。
次に、画像をセグメント化し、表現型の特徴を抽出しました。126の定量的特徴を決定し、適切に基づいた表現型プロファイルに集約しました(図3A、B)。各特徴量と実験条件ごとの値にアクセスできます。いくつかの特徴は、化合物処理で変化を示しました。例えば、TH陽性細胞のα-シヌクレイン蛍光強度は、PFE-360処理後に低下しました(図3C、左パネル)。その他の特徴は、試験した細胞株間の違いのみを示しましたが、化合物処理では違いを示しませんでした。これは、例えば、MAP2神経突起ネットワークの長さやTH陽性ニューロンの比率の場合であった(図3C、中央および右パネル)。異なる細胞株または化合物処理における表現型変異を、選択性や包括性を低く抑えて解析するには、完全な表現型プロファイルを考慮することが不可欠です。
画像解析のステップでは、常に 126 個の特徴がすべて計算されます。同様に、データ分析ではすべての特徴が考慮されますが、機械学習アルゴリズムは個々の特徴に重みを割り当てて生物学的クラスを分離します。データ分析ワークフローは、データの読み込みと特徴量のスケーリング (図4A).スケーリングは、データを正規化し、各特徴量が同様のスケールになるようにするため、機械学習にとって重要です。これにより、機械学習アルゴリズムが入力特徴のスケールの影響を受けにくくなるため、パフォーマンスが向上します。さらに、スケーリングは、さまざまな特徴の相対的な重要性を簡単に比較できるようにすることで、機械学習モデルの解釈可能性を向上させるのに役立ちます。次のステップでは、クラスタリング分析が実行されます (図4B).クラスタリングは、高次元データセットの構造を探索し、個々のフィーチャを見てもすぐにはわからないデータのパターンを特定するのに役立ちます。よく基づいた表現型プロファイル間のコサイン距離に基づく階層的クラスタリングは、細胞株間で強い差を示しましたが、薬物治療ではより少なかった。PFE-360で処理したウェルのデータは、DMSO処理されたコントロール内にクラスター化されており、この比較指標を使用しても大きな違いはないことを示しています。クラスタリングに次いで、次元削減アプローチも、多次元表現型プロファイリングデータの類似点と相違点を視覚化するための有用なツールです。ここでは、ペアワイズ制御マニホールド近似(PaCMAP)を利用しました15 (図4C).以前のコサイン距離ベースのアプローチと同様に、PaCMAPは、主に2つの細胞株間、およびPFE-360またはDMSOコントロール処理ウェル間での差を示しました。コサイン距離クラスタリングとPaCMAPはどちらも教師なし手法であり、例えば、化合物が少数の表現型(すなわち、ニューライト関連の特徴のみ)しか変化させないため、選択された表現型の特徴にのみ存在する小さな違いを拾う可能性は低いです。表現型プロファイル分析のこの制限に対処するために、機械学習主導の教師あり分類を実行しました。具体的には、Light gradient-boosting machine (LightGBM) (図4D).LightGBM は、デシジョン ツリー アルゴリズムを使用して、ランク付けまたは分類に使用できるモデルを作成する教師あり機械学習アルゴリズムです16.LightGBM は、ランダム フォレスト アルゴリズムなどの従来のツリー ベースのアルゴリズムよりも高速かつ効率的になるように設計されています。このアルゴリズムは、1 つのプレートの表現型プロファイル データでトレーニングされ、2 番目の独立したプレートからのデータでトレーニングされたモデルがテストされました。LightGBMモデルの全体的な精度は85%で、ほとんどのウェルの実験カテゴリー(細胞株または化合物)を正しく予測しました。細胞株の予測精度は化合物予測よりも高かったが、化合物処理ウェルの60%が正しく予測され、従来の教師なし法よりも優れていた。LightGBMは、4つのクラス(図4D).細胞株および薬物処理を区別する重要な表現型の特徴は、例えば、細胞表面積またはMAP2およびTH染色の細胞強度に関連している。THおよびα-シヌクレインの二重陽性細胞質の表面は、細胞株と化合物処理を区別する最も重要な特徴であり、死細胞の割合がそれに続きました。データプロットと、ここで説明するすべての教師なし分析方法と教師なし分析方法を実行するJupyterノートブックを提供します( 材料表).得られた結果は、ヒトmDAニューロンにおける細胞株と複合処理効果を区別するための表現型プロファイリングの可能性を示しています。
図2:ヒトiPS細胞由来mDAニューロンの免疫染色。 取得したすべての蛍光チャンネルの代表的な画像を示します。健康なドナーまたはLRRK2 G2019S変異を持つmDAニューロンをDMSOまたは0.1μMのLRRK2キナーゼ阻害剤PFE-360で処理しました。治療は 3 日目に実施され、プロトコルに記載されているように 6 日目に細胞が固定されました。スケールバー:20 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:個々の表現型の特徴からの表現型プロファイルの作成。 (A)個々の蛍光チャネルから抽出できる選択された表現型の特徴が示されています。(b)表現型の特徴は、表現型プロファイルに集約され得る。384ウェルプレート上に存在するさまざまな実験条件で複数の表現型プロファイルを生成できます。(C)表現型の特徴の例と実験条件ごとの対応する値。各データポイントは、1つのウェルからの測定値に対応しています。ウェルチの不等分散t検定は、有意性検定に使用されました。統計的有意性は、* = p < 0.05、** = p < 0.01、*** = p < 0.001、**** = p < 0.0001、有意ではない(ns = p > 0.05)として 表されます。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:mDAニューロンの表現型プロファイルには定量的な情報が含まれており、表現型の分類に使用できます 。 (A)データ解析ワークフローの概略図。(B)対照および薬物処理されたmDAニューロンの集約された表現型プロファイル。(C)表現型プロファイルデータのペアワイズ制御マニホールド近似(PaCMAP)の教師なし次元削減。(D)光勾配ブースティングマシン(LightGBM)は、表現型プロファイルデータの分類を教師ありで分類しました。分類アルゴリズムは、1 つのプレートの表現型プロファイル データでトレーニングされ、2 番目のプレートの実験クラスを予測するために適用されました。左のパネル: 混同行列は、4 つの真のデータ クラスとモデルによる 4 つの予測クラスの間の関係を示しています。全体として、モデルは 85% のケースでデータ クラスを正しく予測します。右パネル:LightGBM分類器の最も重要な10の表現型の特徴。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 試薬 | 100mLの場合 |
| iCellベース培地1 | 100 mLの |
| iCellニューラルサプリメントB | 2 mLの |
| iCell神経系サプリメント | 1 mLの |
表1:完全なメンテナンスメディアの組成。
| 試薬 | 2xソリューション | 最終濃度 | 100mLの場合 |
| PBSの1x | 1 | 1 | 78 mLの |
| トリトン 10% | 0.20% | 0.10% | 2 mLの |
| FBSストック溶液 | 20% | 10% | 20 mLの |
表2:2xブロッキング溶液の組成。
| 試薬 | 2倍の濃度 | 最終濃度 | 100mLの場合 |
| PBSの1x | 1 | 1 | 87.36メートル |
| トリトン 10% | 0.20% | 0.10% | 2 mLの |
| FBSストック溶液 | 10% | 5% | 10 mLの |
| アンチTH | 1/500 | 1/1000 | 0.2 mLの |
| 抗α-シヌクレイン | 1/250 | 1/500 | 0.4 mLの |
| アンチMAP2 | 1/2500 | 1/5000 | 0.04 mLの |
表3:一次染色バッファーの組成。
| 試薬 | 2倍の濃度 | 最終濃度 | 100mLの場合 |
| PBSの1x | 1 | 1 | 86.7mLの |
| トリトン 10% | 0.20% | 0.10% | 2 mLの |
| FBSストック溶液 | 10% | 5% | 10 mLの |
| アンチマウスA488 | 1/500 | 1/1000 | 0.2 mLの |
| 抗ウサギA555 | 1/500 | 1/1000 | 0.2 mLの |
| アンチチキンA647 | 1/125 | 1/250 | 0.8 mLの |
| ヘキスト | 1/1000 | 1/2000 | 0.1 mLの |
表4:2x二次染色バッファーの組成。
補足表1:抽出されたすべての表現型の特徴の概要。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
表現型プロファイリングは、蛍光染色、顕微鏡、画像解析を適用することにより、細胞内の多数の表現型を測定する技術です3。表現型プロファイルを取得し、細胞株やその他の実験条件で比較することで、単一の読み出しでは見過ごされがちな細胞生物学の複雑な変化を理解することができます。ここでは、PD細胞生物学のモデル化によく使用される細胞型であるヒトiPS細胞由来mDAニューロンへの表現型プロファイリングの応用について説明します17,18,19。mDAニューロンの表現型プロファイリングは、一般的な蛍光染色4、非ニューロン細胞タイプ5,6、またはスケーラブルではない7,8を使用する以前に使用されたプロファイリングアプローチに比べていくつかの利点があります。ここで紹介する方法は、生理学的に重要な有糸分裂後mDAニューロンの表現型プロファイリングを可能にします。第二に、iPS細胞由来の凍結保存されたmDAニューロンを使用すると、バッチ間の分化のばらつきが大幅に減少します。第三に、明確に定義された実験計画、自動化された液体処理、および自動顕微鏡法を利用することにより、技術的なばらつきをさらに低減し、プロトコルを高度にスケーラブルにし、表現型スクリーニングキャンペーンにmDAニューロンを使用する可能性を開きます。最後に、教師あり分類により、ユーザーは表現型プロファイルの主要な特徴をグループ化して理解することができるため、新しい生物学の発見に役立つ可能性があります。
表現型プロファイリングにより、個々の特徴を探索してフォローアップ仮説を立て、フォローアップのメカニズム研究につながります。例えば、LRRK2 G2019S mDAニューロンは、α-シヌクレイン含量、MAP2ニューリン突起長、TH陽性細胞の比率に基づいて、対照mDAニューロンと異なることを示しました(図3C)。しかし、LRRK2キナーゼ阻害剤PFE-360による化合物処理は、α-シヌクレイン含量を変化させるだけで、MAP2神経突起の長さやTH陽性細胞の比率には影響を与えません。望ましい化合物は、表現型のアンサンブルを救うはずです。表現型プロファイルには必要な情報が含まれており、クラスタリングまたは次元削減手法を使用して探索できるため、複雑な特徴量の相互作用を 2 次元プロットで視覚化するのに役立ちます。コサイン距離ベースのクラスタリングにより、両方の細胞株を正確に分離できます(図4B)。PaCMAPを用いた次元縮小は、両方の細胞株がどのようにして異なるクラスターを形成するか、そしてPFE-360処理が区別可能ではあるが、依然として類似した全体的な表現型をもたらすことをさらに示しているが、これはおそらく、α-シヌクレイン含量などの測定された特徴にのみ影響するためである(図4C)。対照的に、教師あり機械学習は、特徴に基づいて関心のあるプロファイルを予測するのに役立ちます。このデータでトレーニングされたLightGBMモデルは、テストデータ内の健康なドナーとLRRK2変異mDAニューロンを正確に予測しました。PFE-360で処理されたニューロンの同定は、おそらく表現型に対する化合物の影響が遺伝的影響よりも弱いため、精度が低かった(図4C)。THおよびα-シヌクレイン二重陽性細胞質の表面は、細胞株と化合物処理を区別する最も重要な特徴であり、死細胞の割合がそれに続きました。他のいくつかの主要な特徴は、細胞の表面積に関連していました。したがって、細胞の大きさは、健常な対照とLRRK2変異mDAニューロンの全体的な特徴であるように思われます(図4D)。したがって、このアプローチは、機械学習が複雑なデータセットから最も決定的な表現型の特徴を特定し、それを使用して新しい仮説を開発し、それらの仮説を二次アッセイで検証する方法を示しています。
CellPaintingは、表現型プロファイルを作成するための一般的なアプローチとなっており、標準化された蛍光プローブのセットと定義されたプロトコル3,4,20,21,22,23を使用しています。ここでは、ヘキスト核染色とα-シヌクレイン、TH、およびMAP2に対する抗体からなる、よりmDAニューロン特異的な染色パネルを使用することが決定されました。リソソーム関連LAMP1抗体またはミトコンドリア標的色素TMRMまたはMitoTrackerを使用した他の蛍光染色は、過去に適用されており、PD細胞生物学のより特異的な側面に焦点を当てています9。標準的な光学顕微鏡法では、4つの蛍光波長しか分解できないという点で限界があります。したがって、リソソーム染色またはミトコンドリア染色を現在の染色パネルに追加することは容易ではありません。生物学的な問題に応じて、染色物を交換することができます。あるいは、2つの生物学的構造を、それらの形態が区別可能であり、異なる細胞区画に局在しているという条件の下で、同じ波長を用いて染色することができる。
プロトコールのスクリーニング適合性を高めるために、最小限のピペッティングステップ数と短い培養時間で済むように設計されました。この分析法にとって重要なのは、コーティングに影響を与えたり、ニューロンの剥離を引き起こしたりする可能性があるため、すべての液体処理ステップです。プロトコルに示されているように、残留量の培地が常にウェルに残っていることが推奨されます。また、mDAニューロンは非常に脆弱な細胞タイプであるため、取り扱いに注意することも重要です。細胞膜の浸透圧破裂による過剰な細胞死を防ぐために、指示どおりに融解を行ってください。播種密度は、画像内の神経突起や核などの構造が過度に重なり合うのを防ぎながら、ウェルごとに十分なデータを生成するように最適化されました。表現型プロファイルは、プレート2,4,23内の位置効果に非常に敏感です。プロトコルに示されているように、エッジウェルは使用しないでください。さらに、実験を計画する際には、実験条件ごとに少なくとも5つの技術的反復を使用することをお勧めします。理想的には、反復をプレート上にランダムに分散させます。
他の方法と同様に、ニューロンの表現型プロファイリングには限界があります。表現型プロファイリングデータセットは、特に単一細胞に対して計算された場合、非常に大きくなる可能性があります。より多くの表現型の特徴を持つことは、これまで知られていなかったメカニズムを明らかにしたり、アッセイシステムの安定性を確保したりするなど、有利ですが、望ましくないノイズが発生し、慎重に選択された個々の特徴よりも解釈が困難になる可能性もあります。たとえば、モデルの過学習や誤った相関関係は、大規模なデータセットでより頻繁に発生する課題です4,24。したがって、表現型プロファイリングは、仮説主導の実験計画に取って代わることを意図したものではなく、テスト可能な新しい仮説の出発点として機能することを目的としています。パーキンソン病は神経変性疾患であり、多くの場合、人生の後半にのみ現れます。したがって、iPS細胞由来のニューロンにおけるPD関連疾患生物学の研究は、特にα-シヌクレイン凝集などのPDの古典的な後期の特徴に焦点を当てている場合、制限となる可能性があります17,25,26。それどころか、PDの発症が比較的遅いため、発症前の段階は長いと推定されます。したがって、iPS細胞mDAニューロンモデルでは、細胞ベースですでに重要な病状が検出されている可能性がありますが、全身レベルでは、脳は長年にわたってニューロンと機能の喪失を補うことができます27,28。
将来的には、このプロトコルは、mDAニューロン関連の染色を、例えばシナプス生物学や細胞内凝集体に焦点を当てた染色に置き換えることで、皮質ニューロンや運動ニューロンなど、他のiPS細胞由来のニューロンタイプに適合させることができます。皮質ニューロンは、例えば、β-チューブリンIIIやシナプス前部およびシナプス後部タンパク質(高品質の抗体が報告されている29)に対する汎神経突起染色を用いて特徴付けることができる。運動ニューロンは、コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)、タールDNA結合タンパク質43(TDP-43)およびRNA顆粒マーカー30に対する抗体を用いて表現型決定することができる。要約すると、ニューロンの表現型プロファイルを作成するために提示されたプロトコルは、研究コミュニティが幅広いニューロン表現型に対する化学的または遺伝的摂動の影響を調査するのに役立つと予想されます。
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Disclosures
すべての著者はKsilinkに雇用されています。
Acknowledgments
著者らは、提示されたプロトコルの設計につながる貴重な支援と議論をしてくれたKsilinkのすべての同僚に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti- chicken – Alexa 647 | Jackson ImmunoRearch | 703-605-155 | Immunofluorescence |
| Anaconda | https://www.anaconda.com/download | ||
| Anti-Map2 | Novus | NB300-213 | Immunofluorescence |
| Anti-mouse - Alexa 488 | Thermo Fisher | A11001 | Immunofluorescence |
| Anti-rabbit - Alexa 555 | Thermo Fisher | A21429 | Immunofluorescence |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase | Merck | T2928 | Immunofluorescence |
| Anti-α-synuclein | Abcam | 138501 | Immunofluorescence |
| Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head | Agilent | If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. | |
| Confocal microscope | Yokogawa | CV7000 | The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency. |
| Countess Automated cell counter | Invitrogen | Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber. | |
| DPBS +/+ | Gibco | 14040-133 | Buffer for washing |
| EL406 Washer Dispenser | BioTek (Agilent) | If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. | |
| Formaldehyde Solution (PFA 16 %) | Euromedex | EM-15710-S | Fixation before staining |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining |
| iCell Base Medium 1 | Fujifilm | M1010 | Base medium for neurons |
| iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M | Fujifilm | C1087 | Apparently healthy donor |
| iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139 | Fujifilm | C1149 | Donor carrying LRRK2 G2019S mutation |
| iCell Nervous System Supplement | Fujifilm | M1031 | Supplement for base medium |
| iCell Neural Supplement B | Fujifilm | M1029 | Supplement for base medium |
| Jupyter Python Notebook | In-house development | https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling | Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data. |
| Laminin | Biolamina | LN521 | Plate coating |
| PFE-360 | MedChemExpress | HY-120085 | LRRK2 kinase inhibitor |
| PhenoLink | In-house development | https://github.com/Ksilink/PhenoLink | Software for image analysis |
| PhenoPlate 384w, PDL coated | Perkin Elmer | 6057500 | Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope. |
| Storage plates Abgene 120 µL | Thermo Scientific | AB-0781 | Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. |
| Triton | Sigma | T9284 | Permeabilization before lysis |
| Trypan Blue | Sigma | T8154-20ML | Determination of living cells |
| Vprep Pipetting System | Agilent | Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used. |
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