Summary
이 프로토콜은 인간 중뇌 도파민 뉴런의 세포 배양에 이어 면역학적 염색 및 획득된 현미경 high-content 이미지에서 신경 세포 표현형 프로파일 생성을 설명하여 유전적 또는 화학적 조절로 인한 표현형 변이를 식별할 수 있습니다.
Abstract
파킨슨병(PD)은 중뇌 도파민(mDA) 뉴런 손실을 유발하는 다양한 세포 생물학적 과정과 관련이 있습니다. 현재의 많은 in vitro PD 세포 모델은 복잡성이 부족하고 여러 표현형을 고려하지 않습니다. 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 mDA 뉴런의 표현형 프로파일링은 PD 관련 세포 유형에서 다양한 뉴런 표현형을 동시에 측정하여 이러한 단점을 해결할 수 있습니다. 여기서는 상업적으로 이용 가능한 인간 mDA 뉴런에서 표현형 프로파일을 얻고 분석하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 뉴런 특이적 형광 염색 패널은 핵, α-시누클레인, 티로신 하이드록실라제(TH) 및 미세소관 관련 단백질 2(MAP2) 관련 표현형을 시각화하는 데 사용됩니다. 설명된 표현형 프로파일링 프로토콜은 384웰 플레이트, 자동 액체 처리 및 고처리량 현미경을 사용하기 때문에 확장 가능합니다. 프로토콜의 유용성은 건강한 기증자 mDA 뉴런과 류신이 풍부한 반복 키나아제 2(LRRK2) 유전자에서 PD 결합 G2019S 돌연변이를 운반하는 mDA 뉴런을 사용하여 예시됩니다. 두 세포주 모두 LRRK2 키나아제 억제제 PFE-360으로 처리하고 표현형 변화를 측정했습니다. 또한 클러스터링 또는 기계 학습 기반 지도 분류 방법을 사용하여 다차원 표현형 프로파일을 분석하는 방법을 보여줍니다. 설명된 프로토콜은 신경 질환 모델링을 연구하거나 인간 신경 세포의 화합물 효과를 연구하는 연구자들에게 특히 흥미로울 것입니다.
Introduction
파킨슨병(PD)에서는 다양한 세포 생물학적 과정이 방해를 받습니다. 예를 들어, 미토콘드리아 기능 장애, 산화 스트레스, 단백질 분해 결함, 소포 이동 및 엔도리소좀 기능 장애는 중뇌 도파민(mDA) 뉴런 손실과 관련이 있으며, PD1에서 일반적으로 관찰됩니다. 따라서 파킨슨병은 서로 상호작용하고 악화시킬 수 있는 여러 질병 기전을 포함하는 것으로 보입니다. 이 기계론적 상호 작용을 조사하는 한 가지 유용한 방법은 중뇌 도파민(mDA) 뉴런의 포괄적인 표현형 지문 또는 프로필을 생성하는 것입니다.
표현형 프로파일링은 측정 가능한 특성의 모음을 기반으로 샘플의 프로필을 생성하는 것과 관련된 접근 방식이며, 둘째, 이 프로필 2,3을 기반으로 샘플에 대한 예측을 수행하는 것을 포함합니다. 프로파일링의 목표는 다양한 특징을 포착하는 것이며, 그 중 일부는 이전에 질병이나 치료와 관련이 없었을 수 있다3. 결과적으로 프로파일링을 통해 예상치 못한 생물학적 과정을 밝힐 수 있습니다. 표현형 프로파일링은 일반적으로 형광 염색된 세포에 의존하며, 표현형 프로파일을 생성하기 위해 셀 페인팅(Cell Painting)과 같은 표준화된 분석법이 개발되었습니다4. 최근에, 표현형 프로파일링은 예를 들어, 소분자의 특성 분석 또는 환자 유래 섬유아세포만을 기반으로 하는 PD 아형의 정확한 예측에 적용되고 있다 5,6. 이러한 발전에도 불구하고 표현형 프로파일링은 LRRK2 G2019S와 같은 PD 연결 돌연변이를 발현하는 인간 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 mDA 뉴런과 같은 유사분열 후 분화 세포에 거의 적용되지 않았습니다. iPSC 유래 모델의 중요한 과제로는 분화 배치 또는 유전자형에 걸쳐 미묘하거나 가변적인 병리학적 특징이 존재한다는 점과 분리된 PD 표현형이 질병의 전체 복잡성을 포착하지 못한다는 사실이 있습니다. 또한, iPSC 신경 세포 모델은 생리학적으로 관련이 있지만, 기술적 복잡성에 대한 우려로 인해 PD 약물 발견 프로세스에서는 거의 사용되지 않습니다 7,8.
우리는 이전에 유전적 및 화학적 화합물 유도 표현형 변화에 민감한 인간 mDA 뉴런에서 여러 PD 관련 병태생리학적 표현형을 측정하기 위한 강력한 방법론을 개발했습니다9. 이 기사에서는 mDA 뉴런에서 표현형 프로파일을 생성하기 위해 이 방법론을 더욱 최적화된 버전으로 만드는 방법에 대해 자세히 설명합니다(그림 1). 이 프로토콜은 고품질 mDA 뉴런의 사용 및 기술적 재현성과 같은 앞서 설명한 표현형 프로파일링 접근 방식에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 처음으로, 이 프로토콜은 확장성이 뛰어난 방식으로 화학적 섭동 후 생리학적으로 관련된 유사분열 후 mDA 뉴런에서 표현형 프로파일링을 가능하게 합니다. 완전히 분화되고 동결 보존된 mDA 뉴런은 상용화되어 배치 간 분화 변동성을 크게 줄여줍니다. 둘째, 잘 정의된 실험 설계(예: 배양 기간 또는 에지 웰 방지), 자동화된 액체 처리 및 자동화된 현미경을 사용하여 기술적 변동성을 더욱 줄일 수 있습니다. 또한 비지도 클러스터링 또는 지도 분류 접근 방식을 사용한 표현형 프로파일 분석의 초기 단계가 여기에 요약되어 표현형 프로파일링 데이터를 분석할 수 있는 방법을 나타냅니다. 이 프로토콜은 유전적 또는 화학적 섭동에 의해 유도된 mDA 뉴런의 표현형 변화에 관심이 있는 연구자, 특히 스크리닝 캠페인 중 또는 독성 효과를 결정하기 위해 더 적은 수의 화합물의 효과를 연구해야 하는 경우와 같이 확장성이 뛰어난 연구 설정이 필요한 경우에 사용됩니다. 요약하면, 인간 뉴런의 표현형 프로파일링의 적용은 복잡한 질병 관련 표현형을 연구하고 약물 후보의 세포 효과를 특성화하는 데 유용한 기술일 것으로 예상됩니다.
그림 1: 인간 iPSC 유래 mDA 뉴런에서 이미지 기반 표현형 프로파일을 생성하기 위한 실험 프로토콜의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
1. 뉴런 파종을 위한 배지 및 플레이트 준비(1일차)
- Day-1에 뉴런 파종을 위해 플레이트를 준비하려면 사용 직전에 라미닌을 실온(RT)으로 데우십시오. 라미닌 원액(0.1mg/mL)을 차가운 PBS+/+(Ca 2+ 및 Mg2+ 포함)에 1/10로 희석하여 라미닌 용액을 준비합니다.
알림: 모든 시약은 재료 표에 나열되어 있습니다. 용액 및 완충액의 조성은 표 1-4에 기재되어 있다. - 그런 다음 25μL의 라미닌 용액을 PDL(Poly-D-Lysine) 사전 코팅된 384웰 플레이트의 각 웰에 추가하고 4°C에서 밤새 배양합니다. 코팅된 플레이트는 4°C에서 최대 1주일 동안 보관할 수 있습니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 최대 1주일 동안 일시 중지할 수 있습니다. 플라스틱 필름을 사용하여 플레이트를 밀봉합니다. - 전체 유지보수 매체를 준비하고 4°C에서 최대 1개월 동안 보관합니다(표 1).
2. 뉴런의 해동(0일차)
- 0일째에 뉴런을 해동하려면 수조를 37°C로 예열하고 빛으로부터 보호되는 전체 유지 관리 배지를 RT로 평형화합니다.
- 상업적으로 얻어진 냉동 뉴런( 재료 표 참조)이 들어 있는 바이알을 액체 질소 탱크에서 꺼내 드라이아이스 위에 놓습니다. 그런 다음 바이알을 수조에 2분 동안 넣습니다. 액체가 완전히 해동되면 70% 에탄올로 바이알을 소독합니다.
- P1000 피펫(약 370μL)으로 해동된 뉴런을 흡인하고 상하 피펫팅 없이 50mL 원심분리 튜브에 전달합니다. 그런 다음 630μL의 Complete Maintenance Medium으로 바이알을 헹구고 50mL 튜브에 한 방울씩 떨어뜨립니다(45° 각도). 분배하는 동안 천천히 저어줍니다.
알림: 세포의 삼투압 파열을 방지하기 위해 배지를 천천히 한 방울씩 분배하는 것이 중요합니다. 45° 각도와 가벼운 교반은 피펫팅 중 높은 국부 삼투압을 최소화합니다. - 마찬가지로, P1000 피펫을 사용하여 50mL 원심분리기 튜브에 1mL의 Complete Maintenance Medium을 추가합니다. 그런 다음 Complete Maintenance Medium 2mL를 천천히 추가합니다. 분배하는 동안 조심스럽게 저어줍니다.
- 셀을 셉니다. 10 μL Trypan Blue 및 10 μL 세포 현탁액이 있는 마이크로튜브를 준비하고 계수 챔버 슬라이드(10 μL)에 추가합니다. 자동화된 셀 카운터( 재료 표 참조)를 사용하거나 수동으로 계수를 수행합니다.
- 카운팅 후 뉴런이 포함된 50mL 튜브를 RT에서 400 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. P1000 피펫과 1mL의 Complete Maintenance Medium을 사용하여 펠릿을 조심스럽게 재현탁시킵니다. 그런 다음 원하는 농도에 도달하기 위해 필요한 부피를 추가합니다(300,000세포/mL, 다음 단계 참조).
3. 준비된 판에 뉴런 파종(Day 0)
- 0일째에 준비된 플레이트에 뉴런을 파종하려면 코팅된 플레이트를 냉장고에서 꺼내 세포 배양 후드 아래에 놓고 약 30분 동안 RT와 평형을 이루도록 합니다.
- 파종 직전에 자동 액체 처리기 또는 16채널 피펫을 사용하여 15μL 코팅 용액을 흡입합니다. 코팅 손상을 방지하기 위해 웰당 약 10μL를 남겨 둡니다.
- 다음으로, 웰당 300,000 cells/mL(2.6단계에서 준비)를 포함하는 세포 용액 50μL를 16채널 피펫으로 분주하여 웰당 15,000개의 시드된 뉴런과 웰당 60μL의 최종 부피를 생성합니다.
- 384웰 플레이트에서는 표현형 프로파일에 영향을 줄 수 있는 가장자리 효과를 최소화하기 위해 열 1, 2, 23, 24 및 열 A, B, O, P를 사용하지 마십시오. 사용하지 않는 빈 웰을 80μL의 PBS로 채웁니다. 플레이트를 37 °C 및 5 % CO2 에서 배양합니다.
4. 배지 변화 또는 복합 처리(3일차)
- 웰 수에 따라 적절한 양의 Complete Maintenance Medium을 RT에서 미리 예열합니다. 빛으로부터 보호하십시오.
- 매체 변경이 필요한 경우 4.4단계로 진행합니다. 복합 처리가 필요한 경우 화합물 스톡 농도와 사용된 용매(물, DMSO, 메탄올 등)를 확인합니다.
- 테스트할 모든 원하는 농도에 대해 1.5x 농축 화합물 용액을 준비합니다. Complete Maintenance Medium을 사용하여 화합물 희석액을 준비합니다.
알림: 중성 대조군으로 테스트된 화합물과 동일한 농도의 각 용매를 사용하십시오. 서로 다른 농도의 여러 또는 알려지지 않은 화합물을 사용하는 경우 표현형 프로파일에 대한 용매 효과를 측정하기 위해 별도의 용량-반응 실험을 수행하는 것이 좋습니다. - 자동 피펫팅 시스템을 사용하는 경우 60μL의 1.5x 복합 용액을 384웰 보관 플레이트에 추가합니다. 또는 16채널 피펫을 사용하십시오. 배지 교체가 필요한 경우 대신 60μL의 Complete Maintenance Medium을 추가합니다.
- 자동 피펫팅 시스템을 사용하여 뉴런 함유 플레이트에서 웰당 40μL의 배지를 흡입 및 폐기하여 20μL/웰을 유지합니다. 그런 다음 384웰 보관 플레이트에서 40μL/웰의 1.5x 복합 용액을 각 웰에 추가하여 원하는 최종 농도를 얻습니다.
알림: 전체 배지 교체를 수행하지 말고 신경 카펫이나 코팅의 손상을 방지하기 위해 항상 웰에 잔류 배지를 남겨 두는 것이 중요합니다. - 이 프로토콜에 설명된 6일 이상 신경 세포 배양을 수행하는 경우 2-3일마다 배지를 교체하십시오.
5. 뉴런 고정 및 염색(6-7일)
- 6일과 7일에 뉴런을 고정하고 염색하려면 모든 분주 및 세척 단계에 자동 액체 처리기를 사용하십시오. 또는 16채널 피펫을 사용하십시오.
- Triton X-100을 1x PBS에 희석하여 10% Triton X-100 용액을 준비합니다. 용액이 균질해질 때까지 소용돌이칩니다. 4 °C에서 보관하십시오.
- 뉴런을 고정하기 위해 16% PFA의 20μL/웰을 분주하여 최종 농도를 4%로 만듭니다. 플레이트를 RT에서 30분 동안 배양하고 1x PBS로 세 번 세척합니다. 마지막 세척 후 PBS 20μL/웰을 남겨 둡니다.
주의: PFA는 구강, 피부 및 호흡기 독성을 유발하는 것으로 알려진 유해 물질로 인식되고 있습니다. 또한 눈에 위협이 되며 유전적 돌연변이와 암을 유발할 수 있습니다. PFA를 적절하게 취급하려면 적절한 환기를 보장하는 것 외에도 눈 및 얼굴 보호구와 같은 적절한 개인 보호 장비를 사용해야 합니다. PFA가 환경으로 방출되는 것을 방지하는 것이 중요합니다. - 투과화 및 차단을 위해 2x 차단 용액을 준비합니다(표 2).
- 2x 차단 용액(1x 최종 농도)의 20μL/웰을 추가하고 RT에서 1시간 동안 배양한 후 PBS로 한 번 세척합니다. 세척 후 PBS 20μL/웰을 보관하십시오.
- 1차 항체( 재료 표 참조) 염색을 위해 2x 1차 염색 완충액을 준비합니다(표 3).
- 2x 1차 염색 완충액(1x 최종 농도)의 웰당 20μL를 추가하고 4°C에서 밤새 배양합니다. 다음날 아침 7일째 PBS로 세 번 씻으십시오. 세척 후 PBS 20μL/웰을 남겨 둡니다.
- 2차 항체( 재료 표 참조) 염색을 위해 2x 2차 염색 완충액을 준비합니다(표 4).
- 2x 2차 염색 완충액(1x 최종 농도)의 웰당 20μL를 추가하고, 빛을 피해 RT에서 2시간 동안 배양한 후 PBS로 3회 세척합니다. 마지막 세척 후 100μL PBS/well을 그대로 두십시오.
- 증발을 최소화하기 위해 플레이트에 알루미늄 밀봉을 추가하십시오. 또는 플라스틱 필름과 알루미늄 호일을 사용하여 플레이트를 덮습니다. 이미지 획득을 진행하거나 플레이트를 4°C에서 보관합니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 최대 1주일 동안 일시 중지할 수 있습니다. 배경 형광이 관찰되면 차단 시간을 늘리는 것이 좋습니다. 염색이 충분하지 않은 경우 1차 항체 농도 또는 배양 시간을 늘려 보십시오.
- 증발을 최소화하기 위해 플레이트에 알루미늄 밀봉을 추가하십시오. 또는 플라스틱 필름과 알루미늄 호일을 사용하여 플레이트를 덮습니다. 이미지 획득을 진행하거나 플레이트를 4°C에서 보관합니다.
6. 형광 염색 뉴런의 이미징(7일차)
- 7일째에 도금, 배양 및 염색된 뉴런의 이미지를 획득합니다. 이상적으로는 자동 컨포칼 형광 현미경을 사용하는 것이 좋습니다( 재료 표 참조). 또는 수동으로 이미지를 획득합니다.
- 각각 405nm, 488nm, 561nm 및 647nm 레이저를 사용하여 Hoechst, TH, α-synuclein 및 MAP2 채널을 획득합니다(그림 2).
참고: 표현형 프로파일링을 위한 충분한 양의 상세 데이터를 생성하려면 40x 대물렌즈를 사용하고 2μm로 분리된 3개의 Z 슬라이스로 구성된 Z 스택을 사용하여 16개의 필드/웰을 획득합니다. 신경 카펫에 피펫팅 관련 손상이 있는 경우 이러한 영역을 이미징하지 마십시오. - 현미경과 카메라에 따라 4개의 형광 채널 각각에 대한 노출 시간과 여기 강도를 개별적으로 조정하여 형광 강도의 최적 동적 범위를 얻을 수 있습니다.
참고: 이미징 소프트웨어는 이상적인 노출 시간을 결정하기 위해 히스토그램을 제공하는 경우가 많습니다. 낮은 신호 범위에서 히스토그램이 너무 왼쪽으로 치우치면 노출 시간이 너무 짧거나 여기 강도가 너무 낮은 것입니다. 오른쪽의 최대 신호 레벨에 급격한 절벽이 있으면 신호 값이 포화 상태입니다. 이 경우 여기 강도를 줄이거나 노출 시간을 줄이십시오. - .tif와 같은 손실 없는 개방형 형식으로 이미지를 저장합니다.
7. 이미지 처리(8일차)
- 이미지 분할 및 표현형 특징 추출은 정량적 표현형 프로파일을 생성하는 데 필요합니다. 이미지 분할 및 특징 추출을 위해 PhenoLink 소프트웨어를 사용하십시오(재료 표). PhenoLink 설치 지침은 GitHub 저장소(https://github.com/Ksilink/PhenoLink)에서 찾을 수 있습니다.
참고: 이미지 분할은 이미지에서 서로 다른 개체 또는 영역을 식별하고 분리하는 데 사용되는 반면, 표현형 특징 추출은 해당 영역에서 관련 정보를 분석하고 추출하는 데 사용됩니다. CellProfiler 10, ImageJ/FIJI 11, Napari12 또는 Knime Analytics Platform13과 같은 여러 대체 소프트웨어 솔루션을 사용하여 다중 채널 형광 이미지에서 정량적 정보를 추출할 수 있습니다. - 조명이 보정된 Raw 이미지에 대해 이미지 분할을 수행합니다. 각 형광 채널 강도 임계값을 플레이트별로 경험적으로 결정하여 배경 신호가 최소화되고 원하는 분할 신호가 원시 이미지의 신호에 대응하도록 합니다. 같은 날에 처리되고 염색된 플레이트는 일반적으로 분할을 위해 유사한 채널 강도 임계값이 필요합니다.
- 살아있는 세포와 죽은 세포를 분리하기 위해 핵의 크기와 강도를 정의합니다. 40x 이미지를 사용하는 경우 다른 모든 기본 매개변수를 유지하고 소프트웨어를 실행합니다. 웰당 126개의 정량적 이미지 특징이 계산됩니다(보충 표 1).
- 결과 표 형식의 정량 데이터를 사용하여 표현형 프로파일을 구성하고 다양한 세포주 또는 처리 조건의 표현형 프로파일을 비교할 수 있습니다. 각 행은 생물학적 조건(우물)에 해당하고 각 열은 결정된 표현형 특징에 해당합니다.
참고: 사용법을 설명하기 위해 데이터 분석 파이프라인과 함께 예제 출력 파일을 제공합니다( 자료 표 참조). 또한 그림 3 은 표현형 프로파일의 조성을 보여줍니다.
8. 표현형 프로파일 생성 및 시각화 (8일차)
- 컴퓨터에 Python 및 Jupyter가 설치되어 있지 않은 경우 Anaconda 배포판을 설치하고 Jupyter 소프트웨어를 엽니다. 제공된 Jupyter Notebook 및 기타 제공된 모든 파일을 다운로드하여 동일한 디렉터리에 저장합니다( 자료 표 참조). Jupyter 소프트웨어를 사용하여 Jupyter Notebook 파일을 엽니다.
참고: Anaconda는 Python과 같은 프로그래밍 언어를 위한 무료 오픈 소스 플랫폼입니다. 이 플랫폼에는 제공된 Jupyter 노트북을 실행하여 표현형 프로파일(https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling)을 생성하고 분석할 수 있는 Python 인터프리터 Jupyter가 함께 제공됩니다. - Jupyter 소프트웨어를 사용하여 Jupyter Notebook 셀을 셀별로 실행합니다. 제공된 샘플 데이터 .fth 및 요구 사항 .txt 파일은 Jupyter Notebook과 동일한 디렉터리에 있어야 합니다. 각 Jupyter Notebook 셀에는 해당 기능을 설명하기 위해 주석이 추가됩니다.
참고: Jupyter Notebook을 데이터 로드 및 크기 조정부터 시작하여 올바른 순서로 사용하고 셀별로 끝까지 진행하는 것이 중요합니다. 모든 데이터 및 그래픽 출력은 Jupyter Notebook 원본 디렉터리에서 새로 만든 폴더에 저장됩니다. 그림 4 는 워크플로와 워크플로 출력을 보여 줍니다.
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Representative Results
mDA 뉴런의 표현형 프로파일링은 세포 생물학의 여러 측면과 실험 조절 중 변화를 정량화하는 효율적인 방법입니다. 이 방법론을 예시하기 위해 이 연구에서는 냉동 보존된 LRRK2 G2019S와 건강한 기증자 mDA 뉴런을 사용했습니다. 이 뉴런은 약 37일 동안 분화되었고, 유사분열 후 발현 뉴런 마커(TUBB3 및 MAP2)와 FOXA2와 결합된 티로신 하이드록실라제(TH)를 포함한 도파민성 뉴런 마커인 반면, 신경교세포 마커인 신경교세포섬유산성 단백질(GFAP)은 결여되어있다 14. 설명된 프로토콜에 따라, 두 세포주를 6일 동안 배양하고 LRRK2 키나아제 억제제인 0.1μM PFE-360으로 처리했습니다. 뉴런은 핵 염색 Hoechst와 α-synuclein, TH 및 MAP2에 대한 항체를 사용하여 염색되었습니다(그림 2).
다음으로, 이미지를 분할하고 표현형 특징을 추출했습니다. 웰 기반 표현형 프로파일로 집계할 수 있는 126개의 정량적 특징을 확인했습니다(그림 3A,B). 각 기능과 실험 조건에 따른 값에 액세스할 수 있습니다. 일부 특징은 복합 처리시 변화를 보였다. 예를 들어, TH 양성 세포의 α-synuclein 형광 강도는 PFE-360 처리 시 감소했습니다(그림 3C, 왼쪽 패널). 다른 특징은 테스트된 세포주 간의 차이만 나타냈지만 복합 처리에서는 그렇지 않았습니다. 예를 들어, MAP2 신경돌기 네트워크 길이 또는 TH 양성 뉴런의 비율에 대한 경우입니다(그림 3C, 중간 및 오른쪽 패널). 덜 선택적이고 포괄적인 방식으로 다른 세포주 또는 화합물 처리의 표현형 변이를 분석하기 위해 완전한 표현형 프로파일을 고려하는 것이 중요합니다.
이미지 분석 단계에서는 126개의 모든 피처가 항상 계산됩니다. 마찬가지로 데이터 분석 중에 모든 특징이 고려되지만 기계 학습 알고리즘은 개별 특징에 가중치를 할당하여 생물학적 클래스를 구분합니다. 데이터 분석 워크플로는 데이터 로딩 및 기능 크기 조정(그림 4A). 크기 조정은 데이터를 정규화하는 데 도움이 되고 각 기능이 유사한 규모에 있도록 하기 때문에 기계 학습에 중요합니다. 이렇게 하면 기계 학습 알고리즘이 입력 기능의 규모에 덜 민감하게 반응하도록 하여 성능을 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 크기 조정은 다양한 기능의 상대적 중요도를 더 쉽게 비교할 수 있도록 하여 기계 학습 모델의 해석 가능성을 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다. 다음 단계에서는 클러스터링 분석(그림 4B). 클러스터링은 고차원 데이터 세트의 구조를 탐색하고 개별 기능을 살펴보면 즉시 명확하지 않을 수 있는 데이터의 패턴을 식별하는 데 유용할 수 있습니다. 잘 기반한 표현형 프로파일 사이의 코사인 거리를 기반으로 한 계층적 클러스터링은 세포주 간에 강한 차이를 보였지만 약물 처리의 경우 차이가 적었습니다. PFE-360 처리된 웰의 데이터는 DMSO 처리된 대조군 내에 군집되어 있으며, 이 비교 지표를 사용하여 큰 차이가 없음을 나타냅니다. 클러스터링 다음으로 차원 축소 접근 방식은 다차원 표현형 프로파일링 데이터의 유사점과 차이점을 시각화하는 데 유용한 도구입니다. 여기서는 PaCMAP(Pairwise Controlled Manifold Approximation)를 사용했습니다15 (그림 4C). 이전의 코사인 거리 기반 접근법과 유사하게, PaCMAP은 주로 두 세포주 간의 차이를 보여주었으며, PFE-360 또는 DMSO 대조군 처리된 웰 간에는 차이가 덜했습니다. 코사인 거리 클러스터링과 PaCMAP은 모두 비지도 방법이며, 예를 들어 화합물이 몇 가지 표현형만 변경하기 때문에(즉, 신경돌기 관련 특징만) 선택된 표현형 특징에만 존재하는 작은 차이를 포착할 가능성이 낮습니다. 표현형 프로파일 분석의 이러한 한계를 해결하기 위해 기계 학습 기반 지도 분류를 수행했습니다. 구체적으로는 Light gradient-boosting machine(LightGBM)(그림 4D). LightGBM은 의사 결정 트리 알고리즘을 사용하여 순위 또는 분류에 사용할 수 있는 모델을 만드는 지도 기계 학습 알고리즘입니다16. LightGBM은 랜덤 포레스트 알고리즘과 같은 기존의 트리 기반 알고리즘보다 빠르고 효율적으로 설계되었습니다. 알고리즘은 한 플레이트의 표현형 프로파일 데이터로 훈련되었으며 두 번째 독립 플레이트의 데이터에서 훈련된 모델을 테스트했습니다. LightGBM 모델은 85%의 전체 정확도를 보였으며 대부분의 웰의 실험 범주(세포주 또는 화합물)를 정확하게 예측했습니다. 세포주 예측의 정확도는 화합물 예측보다 높았을 뿐만 아니라 화합물 처리된 웰의 60%가 정확하게 예측되어 기존의 비지도 방법보다 우수했습니다. LightGBM은 4가지 클래스(그림 4D). 세포주와 약물 처리를 구별하는 중요한 표현형 특징은 예를 들어 세포 표면적 또는 MAP2 및 TH 염색의 세포 강도와 관련이 있습니다. TH와 α-synuclein 이중 양성 세포질의 표면은 세포주와 복합 처리를 구별하는 가장 중요한 특징이었고 죽은 세포의 비율이 그 뒤를 이었습니다. 여기에 설명된 데이터 플로팅과 모든 비지도 및 지도 분석 방법을 수행하는 Jupyter Notebook을 제공합니다( 재료 표). 얻어진 결과는 인간 mDA 뉴런에서 세포주와 화합물 처리 효과를 구별하기 위한 표현형 프로파일링의 잠재력을 보여줍니다.
그림 2: 인간 iPSC 유래 mDA 뉴런의 면역염색. 획득한 모든 형광 채널의 대표 이미지가 표시됩니다. 건강한 기증자 또는 LRRK2 G2019S 돌연변이 운반 mDA 뉴런은 DMSO 또는 LRRK2 키나아제 억제제 PFE-360의 0.1μM으로 처리되었습니다. 치료는 3일째에 수행하였고 세포는 프로토콜에 기술된 대로 6일째에 고정하였다. 스케일 바: 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 개별 표현형 특징에서 표현형 프로파일 생성. (A) 개별 형광 채널에서 추출할 수 있는 선택된 표현형 특징이 표시됩니다. (B) 표현형 특징은 표현형 프로파일로 집계될 수 있습니다. 384웰 플레이트에 존재하는 다양한 실험 조건에서 여러 표현형 프로파일을 생성할 수 있습니다. (C) 표현형 특징의 예와 실험 조건에 따른 해당 값. 각 데이터 점은 한 웰의 측정값에 해당합니다. Welch의 부등분산 t-검정이 유의성 검정에 사용되었습니다. 통계적 유의성은 * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001, **** = p < 0.0001로 표시되며 유의하지 않습니다(ns = p > 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: mDA 뉴런 표현형 프로파일은 정량적 정보를 포함하며 표현형을 분류하는 데 사용할 수 있습니다 . (A) 데이터 분석 워크플로우의 개략적인 개요. (B) 대조군 및 약물 처리된 mDA 뉴런의 응집된 표현형 프로파일. (C) 표현형 프로파일 데이터의 PaCMAP(Pairwise Controlled Manifold Approximation) 비지도 차원 축소. (D) 표현형 프로파일 데이터의 LightGBM(Light gradient-boosting machine) 감독 분류. 분류 알고리즘은 한 플레이트의 표현형 프로파일 데이터에 대해 훈련되었으며 두 번째 플레이트에서 실험 클래스를 예측하는 데 적용되었습니다. 왼쪽 패널: 혼동 행렬은 4개의 실제 데이터 클래스와 모델에 의해 예측된 4개의 클래스 간의 관계를 보여줍니다. 전반적으로 모델은 85%의 경우 데이터 클래스를 올바르게 예측합니다. 오른쪽 패널: LightGBM 분류기의 가장 중요한 10가지 표현형 특징. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시약 | 100 mL용 |
| iCell 베이스 배지 1 | 100mL |
| iCell 신경 보충제 B | 2mL |
| iCell 신경계 보충제 | 1mL |
표 1: 전체 유지 관리 미디어의 구성.
| 시약 | 2x 솔루션 | 최종 농도 | 100 mL용 |
| PBS 1배 | 1 | 1 | 78 mL |
| 트리톤 10% | 0.20% | 0.10% | 2mL |
| FBS 스톡 솔루션 | 20% | 10% | 20 mL |
표 2: 2x 차단 용액의 구성.
| 시약 | 2배 농도 | 최종 농도 | 100 mL용 |
| PBS 1배 | 1 | 1 | 87.36 밀리리터 |
| 트리톤 10% | 0.20% | 0.10% | 2mL |
| FBS 스톡 솔루션 | 10% | 5% | 10mL |
| 안티 TH | 1/500 | 1/1000 | 0.2 mL |
| 항α-시누클레인 | 1/250 | 1/500 | 0.4 mL |
| 안티 MAP2 | 1/2500 | 1/5000 | 0.04 mL |
표 3: 1차 염색 완충액의 조성.
| 시약 | 2배 농도 | 최종 농도 | 100 mL용 |
| PBS 1배 | 1 | 1 | 86.7mL |
| 트리톤 10% | 0.20% | 0.10% | 2mL |
| FBS 스톡 솔루션 | 10% | 5% | 10mL |
| 안티 마우스 A488 | 1/500 | 1/1000 | 0.2 mL |
| 안티 토끼 A555 | 1/500 | 1/1000 | 0.2 mL |
| 안티 치킨 A647 | 1/125 | 1/250 | 0.8 mL |
| 회흐스트(Hoechst) | 1/1000 | 1/2000 | 0.1 mL |
표 4: 2x 2차 염색 완충액의 조성.
보충 표 1: 추출된 모든 표현형 특징의 개요. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
표현형 프로파일링(Phenotypic profiling)은 형광 염색, 현미경 검사, 이미지 분석 등을 적용하여 세포에서 많은 수의 표현형을 측정하는 기술이다3. 표현형 프로파일을 얻고 세포주 또는 기타 실험 조건에서 비교하여 단일 판독값을 사용할 때 눈에 띄지 않을 수 있는 세포 생물학의 복잡한 변화를 이해할 수 있습니다. 여기서는 PD 세포 생물학17,18,19을 모델링하는 데 자주 사용되는 세포 유형인 인간 iPSC 유래 mDA 뉴런에 대한 표현형 프로파일링의 적용에 대해 설명합니다. mDA 뉴런에서의 표현형 프로파일링은 일반적인 형광 염색(generic fluorescent staining)4, 비뉴런 세포 유형(non-neuronal cell type)5,6 또는 확장 가능하지 않은(7,8) 이전에 사용된 프로파일링 접근법에 비해 몇 가지 장점이 있다. 여기에 제시된 방법은 생리학적으로 관련된 유사분열 후 mDA 뉴런에서 표현형 프로파일링을 가능하게 합니다. 둘째, iPSC 유래 동결 보존된 mDA 뉴런을 사용하면 배치 간 분화 변동성이 크게 감소합니다. 셋째, 잘 정의된 실험 설계, 자동화된 액체 처리 및 자동화된 현미경을 사용함으로써 기술적 변동성을 더욱 줄일 수 있고 프로토콜의 확장성을 높일 수 있으며 표현형 스크리닝 캠페인에 mDA 뉴런을 사용할 수 있는 가능성을 열어줍니다. 마지막으로, 지도 분류는 사용자에게 표현형 프로파일의 주요 특징을 그룹화하고 이해할 수 있는 가능성을 제공하므로 새로운 생물학을 발견하는 데 도움이 될 수 있습니다.
표현형 프로파일링을 통해 개별 특징을 탐색하여 후속 가설을 개발하여 후속 기계론적 연구로 이어질 수 있습니다. 예를 들어, LRRK2 G2019S mDA 뉴런은 α-시누클레인 함량, MAP2 신경돌기 길이 및 TH 양성 세포의 비율에 따라 대조군 mDA 뉴런과 다르다는 것을 보여주었습니다(그림 3C). 그러나 LRRK2 키나아제 억제제 PFE-360을 사용한 복합 처리는 α-시누클레인 함량만 변경하고 MAP2 신경돌기 길이 또는 TH 양성 세포의 비율에 영향을 미치지 않습니다. 바람직한 화합물은 표현형의 앙상블을 구출해야 합니다. 표현형 프로파일에는 필요한 정보가 포함되어 있으며 클러스터링 또는 차원 축소 기술을 사용하여 탐색할 수 있으며, 이는 2차원 플롯에서 복잡한 특징 상호 작용을 시각화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 코사인 거리 기반 클러스터링을 통해 두 세포주를 정확하게 분리할 수 있습니다(그림 4B). PaCMAP을 사용한 차원 축소는 두 세포주가 어떻게 별개의 클러스터를 형성하는지, 그리고 PFE-360 처리가 α-시누클레인 함량과 같은 몇 가지 측정된 특징에만 영향을 미치기 때문에 구별 가능하지만 여전히 유사한 전체 표현형을 유도한다는 것을 추가로 보여줍니다(그림 4C). 반면, 감독된 기계 학습은 기능을 기반으로 관심 있는 프로필을 예측하는 데 도움이 될 수 있습니다. 데이터로 훈련된 LightGBM 모델은 테스트 데이터에서 건강한 기증자와 LRRK2 돌연변이 mDA 뉴런을 정확하게 예측했습니다. PFE-360 처리된 뉴런의 식별은 정확도가 떨어졌는데, 이는 표현형에 대한 화합물 효과가 유전적 영향보다 약하기 때문일 수 있습니다(그림 4C). TH와 α-synuclein 이중 양성 세포질의 표면은 세포주와 복합 처리를 구별하는 가장 중요한 특징이었고 죽은 세포의 비율이 뒤따랐습니다. 몇 가지 다른 주요 특징은 세포 표면적과 관련이 있습니다. 따라서 세포 크기는 건강한 대조군과 LRRK2 돌연변이 mDA 뉴런 사이의 전반적인 구별 특징인 것으로 보입니다(그림 4D). 따라서 이 접근 방식은 기계 학습이 복잡한 데이터 세트에서 가장 정의적인 표현형 특징을 식별할 수 있는 방법을 보여주며, 이를 사용하여 새로운 가설을 개발하고 2차 분석에서 해당 가설을 테스트할 수 있습니다.
CellPainting은 표현형 프로파일을 생성하는 데 널리 사용되는 접근 방식이 되었으며 표준화된 형광 프로브 세트와 정의된 프로토콜 3,4,20,21,22,23을 사용합니다. 여기서는 Hoechst 핵 염색과 α-synuclein, TH 및 MAP2에 대한 항체로 구성된 보다 mDA 뉴런 특이적 염색 패널을 사용하기로 결정했습니다. 리소좀 관련 LAMP1 항체 또는 미토콘드리아 표적 염료인 TMRM 또는 MitoTracker를 사용한 다른 형광 염색은 과거에 적용되었으며 PD 세포 생물학의 보다 구체적인 측면에 중점을 둡니다9. 표준 광학 현미경은 4개의 형광 파장만 분해할 수 있다는 점에서 제한적입니다. 따라서 리소좀 또는 미토콘드리아 염색을 현재 염색 패널에 추가하는 것은 쉽지 않습니다. 생물학적 질문에 따라 염색을 교환할 수 있습니다. 대안적으로, 두 개의 생물학적 구조는 형태가 구별 가능하고 서로 다른 세포 구획에 국한되어 있다는 조건 하에서 동일한 파장을 사용하여 염색할 수 있습니다.
프로토콜의 스크리닝 호환성을 높이기 위해 최소한의 피펫팅 단계와 짧은 배양 시간이 필요하도록 설계되었습니다. 이 방법에서 중요한 것은 코팅에 영향을 미치거나 뉴런의 분리를 초래할 수 있기 때문에 모든 액체 처리 단계입니다. 프로토콜에 표시된 대로 잔류량의 매체는 항상 우물에 남아 있는 것이 좋습니다. mDA 뉴런은 매우 취약한 세포 유형이기 때문에 주의해서 다루는 것도 중요합니다. 세포막의 삼투압 파열로 인한 과도한 세포 사멸을 방지하기 위해 표시된 대로 정확하게 해동하십시오. 파종 밀도는 웰당 충분한 데이터를 생성하면서 이미지의 신경돌기 또는 핵과 같은 과도한 중첩 구조를 방지하도록 최적화되었습니다. 표현형 프로파일은 플레이트 2,4,23의 위치 효과에 매우 민감합니다. 프로토콜에 표시된 대로 에지 웰을 사용하지 마십시오. 또한 실험을 계획할 때 실험 조건당 최소 5회의 기술 반복실험을 사용하는 것이 좋습니다. 이상적으로는 반복실험을 플레이트에 랜덤하게 분포시키는 것이 좋습니다.
다른 방법과 마찬가지로 신경 세포 표현형 프로파일링에는 한계가 있습니다. 표현형 프로파일링 데이터 세트는 특히 단일 셀에 대해 계산할 때 매우 클 수 있습니다. 이전에 알려지지 않은 메커니즘을 밝히거나 분석 시스템 안정성을 보장하는 것과 같이 더 많은 표현형 특징을 갖는 것이 유리할 수 있지만, 원치 않는 노이즈가 발생할 수 있으며 신중하게 선택한 개별 특징보다 해석하기가 더 어려울 수도 있습니다. 예를 들어, 모델 과적합 또는 가짜 상관관계는 대규모 데이터 세트에서 더 자주 발생하는 문제입니다 4,24. 따라서 표현형 프로파일링은 가설 기반 실험 설계를 대체하기 위한 것이 아니라 테스트할 수 있는 새로운 가설의 출발점 역할을 합니다. 파킨슨병은 신경퇴행성 질환이며 종종 노년기에만 나타납니다. 따라서 iPSC 유래 뉴런에서 PD 관련 질병 생물학을 연구하는 것은 특히 α-시누클레인 응집 17,25,26과 같은 PD의 고전적인 후기 단계 특징에 초점을 맞출 때 한계가 될 수 있습니다. 오히려 파킨슨병은 비교적 늦게 발병하기 때문에 증상 발현 전 단계가 길어질 것으로 추정된다. 따라서 iPSC mDA 신경 세포 모델에서는 이미 세포 단위로 중요한 병리를 검출할 수 있는 반면, 전신 수준에서 뇌는 수년 동안 신경 세포 및 기능적 손실을 보상할 수 있습니다27,28.
향후 이 프로토콜은 mDA 뉴런 관련 염색을 시냅스 생물학 또는 세포 내 응집체에 초점을 맞춘 염색으로 대체하여 피질 또는 운동 뉴런과 같은 다른 iPSC 유래 뉴런 유형에 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 대뇌피질 뉴런은 β-튜불린 III와 시냅신 전후 단백질(예: Synapsin1 및 Homer)에 대한 범신경돌기 염색을 사용하여 특성화할 수 있으며, 이에 대해 고품질 항체가 기술되어 있다29. 운동 뉴런은 콜린 아세틸 전이 효소 (ChAT), TAR DNA 결합 단백질 43 (TDP-43) 및 RNA 과립 마커30에 대한 항체를 사용하여 표현형을 분석할 수 있습니다. 요약하면, 뉴런 표현형 프로파일을 생성하기 위해 제시된 프로토콜은 연구 커뮤니티가 광범위한 뉴런 표현형에 대한 화학적 또는 유전적 섭동의 영향을 탐구하는 데 유용할 것으로 예상됩니다.
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Disclosures
모든 저자는 Ksilink에 고용되어 있습니다.
Acknowledgments
저자는 제시된 프로토콜의 설계로 이어지는 귀중한 도움과 토론에 대해 Ksilink의 모든 동료에게 감사의 뜻을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti- chicken – Alexa 647 | Jackson ImmunoRearch | 703-605-155 | Immunofluorescence |
| Anaconda | https://www.anaconda.com/download | ||
| Anti-Map2 | Novus | NB300-213 | Immunofluorescence |
| Anti-mouse - Alexa 488 | Thermo Fisher | A11001 | Immunofluorescence |
| Anti-rabbit - Alexa 555 | Thermo Fisher | A21429 | Immunofluorescence |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase | Merck | T2928 | Immunofluorescence |
| Anti-α-synuclein | Abcam | 138501 | Immunofluorescence |
| Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head | Agilent | If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. | |
| Confocal microscope | Yokogawa | CV7000 | The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency. |
| Countess Automated cell counter | Invitrogen | Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber. | |
| DPBS +/+ | Gibco | 14040-133 | Buffer for washing |
| EL406 Washer Dispenser | BioTek (Agilent) | If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. | |
| Formaldehyde Solution (PFA 16 %) | Euromedex | EM-15710-S | Fixation before staining |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining |
| iCell Base Medium 1 | Fujifilm | M1010 | Base medium for neurons |
| iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M | Fujifilm | C1087 | Apparently healthy donor |
| iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139 | Fujifilm | C1149 | Donor carrying LRRK2 G2019S mutation |
| iCell Nervous System Supplement | Fujifilm | M1031 | Supplement for base medium |
| iCell Neural Supplement B | Fujifilm | M1029 | Supplement for base medium |
| Jupyter Python Notebook | In-house development | https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling | Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data. |
| Laminin | Biolamina | LN521 | Plate coating |
| PFE-360 | MedChemExpress | HY-120085 | LRRK2 kinase inhibitor |
| PhenoLink | In-house development | https://github.com/Ksilink/PhenoLink | Software for image analysis |
| PhenoPlate 384w, PDL coated | Perkin Elmer | 6057500 | Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope. |
| Storage plates Abgene 120 µL | Thermo Scientific | AB-0781 | Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. |
| Triton | Sigma | T9284 | Permeabilization before lysis |
| Trypan Blue | Sigma | T8154-20ML | Determination of living cells |
| Vprep Pipetting System | Agilent | Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used. |
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