Summary
Detta protokoll beskriver cellodling av humana dopaminerga neuroner i mellanhjärnan, följt av immunologisk färgning och generering av neuronala fenotypiska profiler från förvärvade mikroskopiska bilder med högt innehåll som möjliggör identifiering av fenotypiska variationer på grund av genetiska eller kemiska modulationer.
Abstract
Parkinsons sjukdom (PD) är kopplad till en rad cellbiologiska processer som orsakar förlust av neuroner i mellanhjärnan (mDA). Många nuvarande in vitro PD-cellulära modeller saknar komplexitet och tar inte hänsyn till flera fenotyper. Fenotypisk profilering i humant inducerade pluripotenta stamceller (iPSC)-härledda mDA-neuroner kan åtgärda dessa brister genom att samtidigt mäta en rad neuronala fenotyper i en PD-relevant celltyp parallellt. Här beskriver vi ett protokoll för att erhålla och analysera fenotypiska profiler från kommersiellt tillgängliga humana mDA-neuroner. En neuronspecifik fluorescerande färgningspanel används för att visualisera de nukleära, α-synuklein, tyrosinhydroxylas (TH) och mikrotubuliassocierat protein 2 (MAP2) relaterade fenotyperna. Det beskrivna fenotypiska profileringsprotokollet är skalbart eftersom det använder 384-brunnars plattor, automatisk vätskehantering och mikroskopi med hög genomströmning. Nyttan av protokollet exemplifieras med hjälp av friska mDA-neuroner från donatorer och mDA-neuroner som bär på den PD-länkade G2019S-mutationen i genen Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2). Båda cellinjerna behandlades med LRRK2-kinashämmaren PFE-360 och fenotypiska förändringar mättes. Dessutom visar vi hur flerdimensionella fenotypiska profiler kan analyseras med hjälp av klustring eller maskininlärningsdrivna övervakade klassificeringsmetoder. Det beskrivna protokollet kommer särskilt att intressera forskare som arbetar med modellering av neuronala sjukdomar eller studerar kemiska sammansatta effekter i mänskliga neuroner.
Introduction
En mängd olika cellbiologiska processer störs vid Parkinsons sjukdom (PD). Till exempel har mitokondriell dysfunktion, oxidativ stress, proteinnedbrytningsdefekter, störning av vesikulär trafik och endolysosomal funktion associerats med förlust av neuroner i mellanhjärnan (mDA), som vanligtvis observeras vid PD1. Därför verkar PD involvera flera sjukdomsmekanismer som kan interagera med och förvärra varandra. Ett användbart sätt att undersöka detta mekanistiska samspel är att skapa ett omfattande fenotypiskt fingeravtryck eller profil av mitthjärnans dopaminerga (mDA) neuroner.
Fenotypisk profilering är ett tillvägagångssätt som innebär att man skapar en profil av ett prov baserat på en samling mätbara egenskaper, och för det andra innebär det att man gör förutsägelser om ett prov baserat på denna profil 2,3. Målet med profilering är att fånga ett brett spektrum av egenskaper, av vilka några kanske inte tidigare har förknippats med en sjukdom eller behandling3. Som ett resultat kan profilering avslöja oväntade biologiska processer. Fenotypisk profilering förlitar sig vanligtvis på fluorescerande färgade celler, och standardiserade analyser, såsom cellmålning, har utvecklats för att skapa fenotypiska profiler4. På senare tid har fenotypisk profilering till exempel tillämpats för karakterisering av små molekyler eller noggrann förutsägelse av PD-subtyper enbart baserat på fibroblaster från patienter 5,6. Trots dessa framsteg har fenotypisk profilering sällan tillämpats på postmitotiska differentierade celler, såsom humant inducerade pluripotenta stamceller (iPSC)-härledda mDA-neuroner som uttrycker PD-kopplade mutationer såsom LRRK2 G2019S. Betydande utmaningar med iPSC-härledda modeller inkluderar förekomsten av subtila eller variabla patologiska egenskaper över differentieringssatser eller genotyper, och det faktum att isolerade PD-fenotyper inte fångar sjukdomens fulla komplexitet. Dessutom, även om iPSC-neuronala modeller är fysiologiskt relevanta, används de sällan i PD-läkemedelsupptäcktsprocesser på grund av oro för teknisk komplexitet 7,8.
Vi har tidigare utvecklat en robust metodik för att mäta flera PD-relaterade patofysiologiska fenotyper i humana mDA-neuroner som både är känsliga för genetiska och kemiska föreningsinducerade fenotypiska förändringar9. Den här artikeln beskriver i detalj en ytterligare optimerad version av denna metod för att skapa fenotypiska profiler från mDA-neuroner (figur 1). Detta protokoll har flera fördelar jämfört med de tidigare beskrivna fenotypiska profileringsmetoderna, såsom användningen av högkvalitativa mDA-neuroner och teknisk reproducerbarhet. För första gången möjliggör detta protokoll fenotypisk profilering i fysiologiskt relevanta postmitotiska mDA-neuroner efter kemiska störningar på ett mycket skalbart sätt. Fullt differentierade och kryokonserverade mDA-neuroner är kommersiellt tillgängliga, vilket avsevärt minskar differentieringsvariabiliteten mellan batcher. För det andra kan den tekniska variabiliteten minskas ytterligare genom att använda en väldefinierad experimentell design (dvs. odlingstid eller undvikande av kantbrunnar), automatiserad vätskehantering och automatiserad mikroskopi. Dessutom beskrivs de inledande stegen i fenotypisk profilanalys med hjälp av oövervakad klustring eller övervakade klassificeringsmetoder här, vilket indikerar hur fenotypiska profileringsdata kan analyseras. Detta protokoll kommer att vara användbart för forskare som är intresserade av fenotypiska förändringar av mDA-neuroner inducerade av genetiska eller kemiska störningar, särskilt när en mycket skalbar studieuppställning krävs, till exempel under screeningkampanjer eller när effekterna av ett mindre antal föreningar ska studeras, till exempel för att bestämma toxiska effekter. Sammanfattningsvis förväntas tillämpningen av fenotypisk profilering av humana nervceller vara en värdefull teknik för att studera komplexa sjukdomsrelaterade fenotyper och karakterisera de cellulära effekterna av läkemedelskandidater.
Figur 1: Schematisk skildring av det experimentella protokollet för att generera bildbaserade fenotypiska profiler från humana iPSC-härledda mDA-neuroner. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av medium och plattor för neuronsådd (dag 1)
- För att förbereda plattorna för neuronsådd på dag-1, värm Laminin till rumstemperatur (RT) strax före användning. Bered lamininlösningen genom att späda stamlösningen laminin (0,1 mg/ml) 1/10 i kallt PBS+/+ (med Ca 2+ och Mg2+).
OBS: Alla reagenser är listade i materialtabellen. Sammansättningen av lösningar och buffertar beskrivs i tabellerna 1-4. - Tillsätt sedan 25 μl lamininlösning till varje brunn i en förbehandlad 384-hålsplatta med poly-D-lysin (PDL) och inkubera över natten vid 4 °C. De belagda plattorna kan förvaras vid 4 °C i upp till en vecka.
OBS: Protokollet kan pausas här i upp till en vecka. Försegla plattorna med plastfilm. - Förbered komplett underhållsmedia och förvara vid 4 °C i upp till en månad (tabell 1).
2. Upptining av neuroner (dag 0)
- För att tina neuronerna på dag 0, förvärm ett vattenbad till 37 °C och jämvikt det kompletta underhållsmediet till RT, skyddat från ljus.
- Ta ut injektionsflaskan med de kommersiellt framställda frysta nervcellerna (se materialförteckning) ur behållaren för flytande kväve och placera den på torris. Placera sedan injektionsflaskan i vattenbadet i 2 minuter. När vätskan är helt tinad, desinficera injektionsflaskan med 70 % etanol.
- Aspirera de tinade nervcellerna med en P1000-pipett (cirka 370 μL) och överför dem i ett 50 ml centrifugrör utan upp-och-ner-pipettering. Skölj sedan injektionsflaskan med 630 μl Complete Maintenance Medium och fördela droppe för droppe (45° vinkel) i 50 ml tuben. Rör långsamt medan du dispenserar.
OBS: Det är viktigt att dosera mediet långsamt, droppe för droppe, för att undvika osmotisk bristning av cellerna. En vinkel på 45° och lätt omrörning minimerar högt lokalt osmotiskt tryck under pipettering. - På samma sätt tillsätter du 1 ml Complete Maintenance Medium i 50 ml centrifugröret med en P1000-pipett. Tillsätt sedan långsamt 2 ml Complete Maintenance Medium. Rör om försiktigt medan du dispenserar.
- Räkna cellerna. Bered ett mikrorör med 10 μL Trypan Blue och 10 μL cellsuspension och tillsätt till ett räknekammarglas (10 μL). Utför räkning med hjälp av en automatiserad cellräknare (se Materialförteckning) eller manuellt.
- Efter räkningen, centrifugera 50 ml-röret som innehåller neuronerna vid 400 x g i 5 minuter vid RT och ta bort supernatanten. Återsuspendera försiktigt pelleten med en P1000-pipett och 1 ml Complete Maintenance Medium. Tillsätt sedan den volym som krävs för att nå önskad koncentration (300 000 celler/ml, se även nästa steg).
3. Sådd av neuroner på förberedda plattor (dag 0)
- För att plantera neuroner på de förberedda plattorna på dag 0, ta ut de belagda plattorna ur kylskåpet, placera dem under cellodlingskåpan och låt dem komma i jämvikt med RT i cirka 30 minuter.
- Strax före sådd, aspirera 15 μL beläggningslösning med en automatiserad vätskehanterare eller en 16-kanals pipett. Lämna cirka 10 μL per brunn för att förhindra skador på beläggningen.
- Dispensera sedan 50 μL av celllösningen som innehåller 300 000 celler/ml (beredd i steg 2.6) per brunn med en 16-kanals pipett, vilket resulterar i 15 000 seedade neuroner per brunn och en slutlig volym per brunn på 60 μL.
- I en 384-hålsplatta, undvik att använda kolumnerna 1, 2, 23, 24 och raderna A, B, O och P för att minimera eventuella kanteffekter som kan påverka de fenotypiska profilerna. Fyll de oanvända tomma brunnarna med 80 μL PBS. Inkubera plattorna vid 37 °C och 5 % CO2 .
4. Medelstor förändring eller sammansatt behandling (dag 3)
- Beroende på antalet brunnar, förvärm en lämplig volym Complete Maintenance Medium vid RT. Skydda mot ljus.
- Om en mediumändring krävs, fortsätt till steg 4.4. Om sammansatt behandling önskas, kontrollera koncentrationen av det sammansatta materialet och det använda lösningsmedlet (vatten, DMSO, metanol, etc.).
- Bered en 1,5 x koncentrerad föreningslösning för alla önskade koncentrationer som ska testas. Bered de sammansatta spädningarna med hjälp av Complete Maintenance Medium.
OBS: Som en neutral kontroll, använd respektive lösningsmedel i samma koncentration som den testade föreningen. Om flera eller okända föreningar i olika koncentrationer används är det lämpligt att utföra ett separat dos-responsexperiment för att mäta lösningsmedlets effekter på den fenotypiska profilen. - Om ett automatiskt pipetteringssystem används, tillsätt 60 μL av 1,5-faldiga sammansatta lösningen till en lagringsplatta med 384 brunnar. Alternativt kan du använda en 16-kanals pipett. Om ett mediebyte krävs, tillsätt 60 μL Complete Maintenance Medium istället.
- Använd det automatiska pipetteringssystemet, aspirera och kassera 40 μL medium per brunn från den neuroninnehållande plattan för att behålla 20 μL/brunn. Tillsätt sedan 40 μL/brunn 1,5 x sammansatt lösning från lagringsplattan med 384 brunnar till varje brunn för att erhålla önskad slutlig koncentration.
OBS: Det är viktigt att inte utföra fulla mediebyten utan att alltid lämna kvarvarande medium i brunnen för att förhindra skador på neuronalmattan eller beläggningen. - Om neuronal odling utförs i mer än de 6 dagar som beskrivs i detta protokoll, byt medium var 2-3:e dag.
5. Neuronfixering och färgning (dag 6 till 7)
- För att fixera och färga neuronerna på dag 6 och 7, använd en automatiserad vätskehanterare för alla dispenserings- och tvättsteg. Alternativt kan du använda en 16-kanals pipett.
- Bered en 10 % Triton X-100-lösning genom att späda Triton X-100 i 1x PBS. Virvla tills lösningen är homogen. Förvaras vid 4 °C.
- För att fixera neuronerna, dispensera 20 μL/brunn av 16 % PFA vilket resulterar i en slutlig koncentration på 4 %. Inkubera plattan i 30 minuter vid RT och tvätta den tre gånger med 1x PBS. Lämna 20 μL/brunn PBS efter den sista tvätten.
VARNING: PFA är erkänt som ett farligt ämne som är känt för att orsaka oral, dermal och respiratorisk toxicitet. Det utgör också ett hot mot ögonen och kan leda till genetiska mutationer och cancer. Korrekt hantering av PFA kräver användning av lämplig personlig skyddsutrustning, såsom ögon- och ansiktsskydd, förutom att säkerställa korrekt ventilation. Det är viktigt att förhindra utsläpp av PFA i miljön. - För permeabilisering och blockering, förbered en 2x blockerande lösning (tabell 2).
- Tillsätt 20 μl/brunn 2x blockerande lösning (1x slutlig koncentration), inkubera i 1 timme vid RT och tvätta en gång med PBS. Behåll 20 μL/brunn PBS efter tvätt.
- För primär antikroppsfärgning (se materialtabell), förbered en 2x primär färgningsbuffert (tabell 3).
- Tillsätt 20 μl/brunn 2x primär färgningsbuffert (1x slutkoncentration) och inkubera över natten vid 4 °C. Nästa morgon på dag 7, tvätta tre gånger med PBS. Lämna 20 μL/brunn PBS efter tvätt.
- För sekundär antikroppsfärgning (se materialtabell), förbered en 2x sekundär färgningsbuffert (tabell 4).
- Tillsätt 20 μL/brunn av 2x sekundär färgningsbuffert (1x slutkoncentration), inkubera i 2 timmar vid RT borta från ljus och tvätta tre gånger med PBS. Lämna 100 μL PBS/brunn efter den sista tvätten.
- Lägg till aluminiumtätning på plattan för att minimera avdunstning. Alternativt kan du täcka plattan med plastfilm och aluminiumfolie. Fortsätt med bildtagningen eller förvara plattan vid 4 °C.
OBS: Protokollet kan pausas här i upp till en vecka. Om bakgrundsfluorescens observeras, överväg att öka blockeringstiden. Om färgningen är otillräcklig, försök att öka den primära antikroppskoncentrationen eller inkubationstiden.
- Lägg till aluminiumtätning på plattan för att minimera avdunstning. Alternativt kan du täcka plattan med plastfilm och aluminiumfolie. Fortsätt med bildtagningen eller förvara plattan vid 4 °C.
6. Avbildning av fluorescerande färgade neuroner (dag 7)
- Skaffa bilder av de pläterade, odlade och färgade neuronerna på dag 7. Använd helst ett automatiserat konfokalfluorescensmikroskop (se materialförteckning). Alternativt kan du hämta bilder manuellt.
- Samla in Hoechst-, TH-, α-synuklein- och MAP2-kanalerna med 405 nm, 488 nm, 561 nm respektive 647 nm lasrar (figur 2).
OBS: För att generera tillräcklig mängd detaljerad data för fenotypisk profilering, använd ett 40x-objektiv och erhåll 16 fält/brunnar med Z-stackar bestående av 3 Z-skivor separerade med 2 μm. Om det finns pipetteringsrelaterade skador i neuromattan, försök att undvika att avbilda dessa områden. - Beroende på mikroskop och kamera, justera exponeringstiderna och excitationsintensiteterna för var och en av de fyra fluorescerande kanalerna separat för att få ett optimalt dynamiskt omfång för de fluorescerande intensiteterna.
OBS: Bildbehandlingsprogram tillhandahåller ofta ett histogram för att bestämma den idealiska exponeringstiden. Om histogrammet förskjuts för mycket åt vänster i det låga signalområdet, är exponeringstiden för kort eller excitationsintensiteten för låg. Om det finns en skarp klippa vid den maximala signalnivån till höger, är signalvärdet mättat. Minska i så fall excitationsintensiteten eller förkorta exponeringstiden. - Lagra bilder i ett förlustfritt och öppet format som .tif.
7. Bildbehandling (dag 8)
- Bildsegmentering och fenotypisk egenskapsextraktion krävs för att skapa kvantitativa fenotypiska profiler. Använd programvaran PhenoLink för bildsegmentering och extrahering av egenskaper (Table of Materials). Instruktioner för att installera PhenoLink finns i GitHub-arkivet (https://github.com/Ksilink/PhenoLink).
OBS: Bildsegmentering används för att identifiera och separera olika objekt eller regioner i en bild, medan fenotypisk egenskapsextraktion används för att analysera och extrahera relevant information från dessa regioner. Flera alternativa mjukvarulösningar, såsom CellProfiler 10, ImageJ/FIJI 11, Napari12 eller Knime Analytics Platform13 är tillgängliga för att extrahera kvantitativ information från flerkanaliga fluorescensbilder. - Utför bildsegmentering på ljuskorrigerade foton med Raw-format. Bestäm respektive fluorescerande kanalintensitetströsklar empiriskt per platta så att bakgrundssignalen är minimal och den önskade segmenterade signalen motsvarar signalen i den råa bilden. Plåtar som bearbetas och färgas samma dag kräver vanligtvis jämförbara tröskelvärden för kanalintensitet för segmentering.
- Definiera kärnans storlek och intensitet för att skilja levande från döda celler. När du använder 40x-bilder, behåll alla andra standardparametrar och kör programvaran. Etthundratjugosex kvantitativa bildegenskaper kommer att beräknas per brunn (tilläggstabell 1).
- Använda den resulterande kvantitativa tabelldatan för att konstruera fenotypiska profiler och jämföra fenotypiska profiler från olika cellinjer eller behandlingsförhållanden. Varje rad motsvarar ett biologiskt tillstånd (brunn) och varje kolumn motsvarar en bestämd fenotypisk egenskap.
OBS: Vi tillhandahåller ett exempel på en utdatafil tillsammans med dataanalyspipelinen för att illustrera dess användning (se Materialförteckning). Dessutom visar figur 3 sammansättningen av en fenotypisk profil.
8. Generering och visualisering av fenotypiska profiler (dag 8)
- Om du inte har Python och Jupyter installerat på datorn installerar du Anaconda-distributionen och öppnar Jupyter-programvaran. Ladda ned den angivna Jupyter Notebook och alla andra angivna filer och spara dem i samma katalog (se Materialförteckning). Öppna Jupyter Notebook-filen med hjälp av Jupyter-programvaran.
Anaconda är en gratis plattform med öppen källkod för programmeringsspråk som Python. Den här plattformen levereras med Python-tolken Jupyter som kan köra den angivna Jupyter Notebook för att skapa och analysera fenotypiska profiler (https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling). - Kör Jupyter Notebook cell för cell med hjälp av Jupyter-programvaran. De angivna .fth exempelfilerna och requirements .txt måste finnas i samma katalog som Jupyter Notebook. Varje Jupyter Notebook-cell kommenteras för att förklara dess funktioner.
Det är viktigt att använda Jupyter Notebook i rätt ordning från och med datainläsning och skalning och att fortsätta cell för cell till slutet. Alla data- och grafikutdata lagras i en nyligen skapad mapp i Jupyter Notebook källkatalogen. Bild 4 visar arbetsflödet och arbetsflödets utdata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fenotypisk profilering i mDA-neuroner är ett effektivt sätt att kvantifiera flera aspekter av cellbiologi och deras förändringar under den experimentella moduleringen. För att exemplifiera denna metodik använde denna studie kryokonserverade LRRK2 G2019S och friska mDA-neuroner från donatorer. Dessa nervceller har differentierats i cirka 37 dagar, är postmitotiska och uttrycker neuronala markörer (TUBB3 och MAP2) och dopaminerga neuronmarkörer, inklusive tyrosinhydroxylas (TH) i kombination med FOXA2, medan gliamarkören Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) saknas14. Enligt det beskrivna protokollet odlades båda cellinjerna i 6 dagar och behandlades med 0,1 μM PFE-360, en LRRK2-kinashämmare. Nervcellerna färgades med hjälp av kärnfärgningen Hoechst och antikroppar mot α-synuklein, TH och MAP2 (Figur 2).
Därefter segmenterades bilderna och fenotypiska egenskaper extraherades. Vi fastställde 126 kvantitativa egenskaper som kan aggregeras till välbaserade fenotypiska profiler (figur 3A,B). Varje funktion och dess värde per experimentellt villkor kan nås. Vissa egenskaper visade förändringar vid sammansatt behandling. Till exempel minskade fluorescensintensiteten för α-synuklein i TH-positiva celler vid PFE-360-behandling (figur 3C, vänster panel). Andra egenskaper uppvisade endast skillnader mellan de testade cellinjerna, men inte vid sammansatt behandling. Detta var till exempel fallet för MAP2-neuritnätverkets längd eller förhållandet mellan TH-positiva neuroner (figur 3C, mitten och höger panel). Det är viktigt att ta hänsyn till hela fenotypprofilen för att analysera de fenotypiska variationerna i olika cellinjer eller sammansatta behandlingar på ett mindre selektivt och omfattande sätt.
Under bildanalyssteget beräknas alltid alla 126 objekt. På samma sätt beaktas alla funktioner under dataanalysen, men maskininlärningsalgoritmen tilldelar vikter till enskilda funktioner för att separera de biologiska klasserna. Arbetsflödet för dataanalys börjar med datainläsning och funktionsskalning (Figur 4A). Skalning är viktigt för maskininlärning eftersom det hjälper till att normalisera data och säkerställer att varje funktion är i liknande skala. Detta kan bidra till att förbättra prestandan för maskininlärningsalgoritmer genom att göra dem mindre känsliga för indatafunktionernas skala. Dessutom kan skalning bidra till att förbättra tolkningen av maskininlärningsmodeller genom att göra det enklare att jämföra den relativa betydelsen av olika funktioner. I nästa steg utförs klustringsanalys (Figur 4B). Klustring kan vara användbart för att utforska strukturen för högdimensionella datamängder och identifiera mönster i data som kanske inte är omedelbart uppenbara när man tittar på enskilda funktioner. Hierarkisk klustring baserad på cosinusavståndet mellan välbaserade fenotypiska profiler visade starka skillnader mellan cellinjer, men mindre för läkemedelsbehandling. Data från PFE-360-behandlade brunnar grupperade inom den DMSO-behandlade kontrollen, vilket indikerar inga starka skillnader med detta jämförelsemått. Vid sidan av klustring är metoder för dimensionsreduktion också användbara verktyg för att visualisera likheter och skillnader mellan flerdimensionella fenotypiska profileringsdata. Här använde vi oss av Pairwise Controlled Manifold Approximation (PaCMAP)15 (Figur 4C). I likhet med den tidigare Cosinus-avståndsbaserade metoden visade PaCMAP huvudsakligen skillnader mellan de två cellinjerna och i mindre utsträckning mellan PFE-360- eller DMSO-kontrollbehandlade brunnar. Både cosinusavståndsklustring och PaCMAP är oövervakade metoder och det är osannolikt att de kommer att upptäcka små skillnader som bara finns i utvalda fenotypiska egenskaper, till exempel eftersom en förening bara ändrar ett fåtal fenotyper (dvs. endast neuritrelaterade egenskaper). För att ta itu med denna begränsning av fenotypisk profilanalys utförde vi maskininlärningsdriven övervakad klassificering. Specifikt använde vi Light gradient-boosting-maskinen (LightGBM) (Figur 4D). LightGBM är en övervakad maskininlärningsalgoritm som använder beslutsträdsalgoritmer för att skapa en modell som kan användas för rangordning eller klassificering16. LightGBM har utformats för att vara snabbare och effektivare än traditionella trädbaserade algoritmer som algoritmen Random forest. Algoritmen tränades med fenotypiska profildata från en platta och testade den tränade modellen på data från en andra oberoende platta. LightGBM-modellen hade en total noggrannhet på 85 % och förutspådde korrekt den experimentella kategorin (cellinje eller förening) för de flesta brunnar. Noggrannheten för prediktion av cellinjer var högre än för prediktion av substanser, men även 60 % av de substansbehandlade brunnarna förutspåddes korrekt, vilket är överlägset klassiska oövervakade metoder. LightGBM ger tillgång till betydelsen av de respektive fenotypiska egenskaperna för klassificeringen av de fyra klasserna (Figur 4D). Viktiga fenotypiska egenskaper som särskiljer cellinjerna och läkemedelsbehandlingarna är till exempel relaterade till den cellulära ytan eller de cellulära intensiteterna hos MAP2- och TH-färgningarna. Ytan på TH och α-synuklein dubbelpositiv cytoplasma var den viktigaste egenskapen som särskiljde cellinjer och sammansatta behandlingar, följt av förhållandet mellan döda celler. Vi tillhandahåller en Jupyter Notebook som utför dataplottning och alla oövervakade och övervakade analysmetoder som beskrivs här (se Tabell över material). De erhållna resultaten illustrerar potentialen hos fenotypisk profilering för att särskilja cellinjer och sammansatta behandlingseffekter i humana mDA-neuroner.
Figur 2: Immunfärgning av humana iPSC-härledda mDA-neuroner. Representativa bilder av alla förvärvade fluorescerande kanaler visas. Friska donatorer eller LRRK2 G2019S-mutationsbärande mDA-neuroner behandlades antingen med DMSO eller med 0,1 μM av LRRK2-kinashämmaren PFE-360. Behandlingen utfördes på dag 3 och cellerna fixerades på dag 6 enligt beskrivningen i protokollet. Skalstreck: 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Skapande av en fenotypisk profil utifrån enskilda fenotypiska egenskaper. (A) Utvalda fenotypiska egenskaper som kan extraheras från de enskilda fluorescenskanalerna visas. B) Fenotypiska egenskaper kan aggregeras till en fenotypisk profil. Flera fenotypiska profiler kan genereras under olika experimentella förhållanden på 384-hålsplattan. C) Exempel på fenotypiska egenskaper och deras motsvarande värden per försöksbetingelse. Varje datapunkt motsvarar en mätning från en brunn. Welchs t-test med ojämna varians användes för signifikanstestning. Statistisk signifikans presenteras som * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001, **** = p < 0,0001 och inte signifikant (ns = p > 0,05). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: mDA-neuronfenotypiska profiler innehåller kvantitativ information och kan användas för att klassificera fenotyper . (A) Schematisk översikt över arbetsflödet för dataanalys. (B) Aggregerade fenotypiska profiler för kontroll- och läkemedelsbehandlade mDA-neuroner. (C) Parvis kontrollerad grenrörsapproximation (PaCMAP) oövervakad dimensionsreduktion av fenotypiska profildata. (D) Lätt gradientförstärkande maskin (LightGBM) övervakad klassificering av fenotypiska profildata. Klassificeringsalgoritmen tränades på fenotypiska profildata från en platta och användes för att förutsäga experimentella klasser i en andra platta. Vänster panel: Förvirringsmatrisen visar förhållandet mellan de fyra sanna dataklasserna och de fyra förutsagda klasserna av modellen. Sammantaget förutsäger modellen dataklassen korrekt i 85 % av fallen. Höger panel: De 10 viktigaste fenotypiska egenskaperna för LightGBM-klassificeraren. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Reagenser | För 100 ml |
| iCell Bas Medium 1 | 100 ml |
| iCell Neural Tillägg B | 2 ml |
| Tillägg för iCell nervsystemet | 1 ml |
Tabell 1: Sammansättning av kompletta underhållsmedier.
| Reagens | 2x lösning | Slutlig koncentration | För 100 ml |
| PBS 1x | 1 | 1 | 78 ml |
| Triton 10% | 0.20% | 0.10% | 2 ml |
| FBS lagerlösning | 20% | 10% | 20 ml |
Tabell 2: Sammansättning av 2x blockerande lösning.
| Reagens | 2x koncentration | Slutlig koncentration | För 100 ml |
| PBS 1x | 1 | 1 | 87,36 ml |
| Triton 10% | 0.20% | 0.10% | 2 ml |
| FBS lagerlösning | 10% | 5% | 10 ml |
| Anti-TH | 1/500 | 1/1000 | 0,2 ml |
| Anti-α-synuklein | 1/250 | 1/500 | 0,4 ml |
| Anti-MAP2 | 1/2500 | 1/5000 | 0,04 ml |
Tabell 3: Sammansättning av primär färgningsbuffert.
| Reagens | 2x koncentration | Slutlig koncentration | För 100 ml |
| PBS 1x | 1 | 1 | 86,7 ml |
| Triton 10% | 0.20% | 0.10% | 2 ml |
| FBS lagerlösning | 10% | 5% | 10 ml |
| Anti-mus A488 | 1/500 | 1/1000 | 0,2 ml |
| Anti-kanin A555 | 1/500 | 1/1000 | 0,2 ml |
| Anti-kyckling A647 | 1/125 | 1/250 | 0,8 ml |
| Hoechst | 1/1000 | 1/2000 | 0,1 ml |
Tabell 4: Sammansättning av 2x sekundär färgningsbuffert.
Tilläggstabell 1: Översikt över alla extraherade fenotypiska egenskaper. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fenotypisk profilering är en teknik för att mäta ett stort antal fenotyper i celler genom att tillämpa fluorescerande färgningar, mikroskopi och bildanalys3. Fenotypiska profiler kan erhållas och jämföras över cellinjer eller andra experimentella förhållanden för att förstå komplexa förändringar i cellbiologi som kan gå obemärkt förbi när man använder en enda avläsning. Här beskriver vi tillämpningen av fenotypisk profilering på humana iPSC-härledda mDA-neuroner, en celltyp som ofta används för att modellera PD-cellbiologi17,18,19. Fenotypisk profilering i mDA-neuroner har flera fördelar jämfört med tidigare använda profileringsmetoder som använder generiska fluorescerande färgningar4, icke-neuronala celltyper5,6 eller inte är skalbara 7,8. Metoden som presenteras här möjliggör fenotypisk profilering i fysiologiskt relevanta post-mitotiska mDA-neuroner. För det andra minskar användningen av iPSC-härledda kryokonserverade mDA-neuroner avsevärt differentieringsvariabiliteten från batch till batch. För det tredje, genom att använda en väldefinierad experimentell design, automatiserad vätskehantering och automatiserad mikroskopi, kan den tekniska variationen minskas ytterligare och gör protokollet mycket skalbart och öppnar möjligheten att använda mDA-neuroner för fenotypiska screeningkampanjer. Slutligen ger övervakad klassificering användarna möjlighet att gruppera och förstå de viktigaste egenskaperna hos fenotypiska profiler och kan därför bidra till att avslöja ny biologi.
Fenotypisk profilering gör det möjligt att utforska enskilda egenskaper för att utveckla uppföljningshypoteser som leder till uppföljande mekanistiska studier. Till exempel visade vi att LRRK2 G2019S mDA-neuroner skiljer sig från kontroll-mDA-neuroner baserat på deras α-synukleininnehåll, MAP2-neuritlängd och förhållandet mellan TH-positiva celler (Figur 3C). Sammansatt behandling med LRRK2-kinashämmaren PFE-360 förändrar dock endast α-synukleininnehållet och har ingen effekt på MAP2-neuritlängden eller förhållandet mellan TH-positiva celler. En önskvärd kemisk förening bör rädda en ensemble av fenotyper. En fenotypisk profil innehåller den information som krävs och kan utforskas med hjälp av klustring eller dimensionalitetsreduktionstekniker, vilket kan hjälpa till att visualisera komplexa egenskapsinteraktioner i 2-dimensionella diagram. Cosinusavståndsbaserad klustring möjliggör noggrann separation av båda cellinjerna (figur 4B). Dimensionsreduktion med PaCMAP illustrerar ytterligare hur båda cellinjerna bildar distinkta kluster, och att PFE-360-behandling leder till urskiljbara, men fortfarande likartade övergripande fenotyper, sannolikt på grund av påverkan på endast ett fåtal uppmätta egenskaper såsom α-synukleininnehåll (Figur 4C). Övervakad maskininlärning kan däremot hjälpa till att förutsäga intressanta profiler baserat på deras egenskaper. LightGBM-modellen som tränats på data förutspådde korrekt den friska donatorn och LRRK2-muterade mDA-neuronerna i testdata. Identifieringen av PFE-360-behandlade nervceller var mindre exakt, förmodligen på grund av att kemiska föreningars effekter på fenotyper är svagare än genetiska effekter (Figur 4C). Ytan av TH och α-synuklein dubbelpositiv cytoplasma var den viktigaste egenskapen som särskiljde cellinjer och sammansatta behandlingar, följt av förhållandet mellan döda celler. Flera andra toppfunktioner var relaterade till den cellulära ytan. Därför verkar cellstorlek vara en övergripande särskiljande egenskap mellan friska kontroll- och LRRK2-muterade mDA-neuroner (Figur 4D). Detta tillvägagångssätt visar därför hur maskininlärning kan identifiera de mest definierande fenotypiska egenskaperna i en komplex datamängd, som sedan kan användas för att utveckla nya hypoteser och testa dessa hypoteser i sekundära analyser.
CellPainting har blivit ett populärt tillvägagångssätt för att skapa fenotypiska profiler och använder en standardiserad uppsättning fluorescerande sonder och ett definierat protokoll 3,4,20,21,22,23. Här bestämdes att använda en mer mDA-neuronspecifik färgningspanel bestående av Hoechst-kärnfärgningen och antikroppar mot α-synuklein, TH och MAP2. Andra fluorescerande färgningar som använder en lysosomassocierad LAMP1-antikropp eller mitokondrieriktade färgämnen TMRM eller MitoTracker har applicerats av oss tidigare och fokuserar på mer specifika aspekter av PD-cellbiologi9. Standardljusmikroskopi är begränsad i den meningen att endast fyra fluorescerande våglängder kan upplösas. Att lägga till lysosomala eller mitokondriella färgningar till den nuvarande färgningspanelen är därför inte lätt möjligt. Beroende på den biologiska frågan kan färgningar bytas ut. Alternativt kan två biologiska strukturer färgas med samma våglängd under förutsättning att deras morfologi är urskiljbar och att de är lokaliserade i olika cellfack.
För att öka screeningkompatibiliteten för protokollet utformades det för att kräva ett minimalt antal pipetteringssteg och en kort odlingstid. Kritiskt för metoden är alla vätskehanteringssteg eftersom de kan påverka beläggningen eller resultera i att neuroner lossnar. Som anges i protokollet rekommenderas att en restmängd medium alltid finns kvar i brunnen. Det är också viktigt att hantera mDA-neuronerna med försiktighet eftersom de är en mycket ömtålig celltyp. Utför upptining exakt enligt anvisningarna för att förhindra överdriven celldöd på grund av osmotisk ruptur av cellmembranet. Sådddensiteten optimerades för att generera tillräckligt med data per brunn samtidigt som man förhindrade överlappande strukturer, såsom neuriter eller kärnor i bilderna. Fenotypiska profiler är mycket känsliga för positionseffekter i plattan 2,4,23. Som anges i protokollet, använd inte kantbrunnar. Dessutom rekommenderas att man använder minst fem tekniska replikat per experimentbetingelse när man planerar ett experiment. Fördela helst replikaten slumpmässigt över plattan.
Som med alla metoder har neuronal fenotypisk profilering begränsningar. Fenotypiska profileringsdatauppsättningar kan vara mycket stora, särskilt när de beräknas för enskilda celler. Även om det kan vara fördelaktigt att ha fler fenotypiska egenskaper, som att avslöja en tidigare okänd mekanism eller säkerställa analyssystemets stabilitet, kan det också introducera oönskat brus och vara mer utmanande att tolka än noggrant utvalda enskilda egenskaper. Till exempel är modellöveranpassning eller falska korrelationer utmaningar som förekommer oftare i stora datamängder 4,24. Fenotypisk profilering är därför inte tänkt att ersätta hypotesdriven experimentell design, utan snarare att fungera som en utgångspunkt för nya hypoteser som sedan kan testas. Parkinsons sjukdom är en neurodegenerativ sjukdom som ofta visar sig först sent i livet. Att studera PD-kopplad sjukdomsbiologi i iPSC-härledda neuroner kan därför vara en begränsning, särskilt när fokus ligger på klassiska sena kännetecken för Parkinsons sjukdom, såsom α-synukleinaggregation 17,25,26. Tvärtom, på grund av den relativt sena insjuknandet i Parkinsons sjukdom beräknas den presymtomatiska fasen vara lång. Signifikanta patologier kan därför redan vara detekterbara på cellulär basis i iPSC mDA-neuronala modeller, medan hjärnan på systemisk nivå kan kompensera för neuronal och funktionell förlust under många år27,28.
I framtiden kan detta protokoll anpassas till andra iPSC-härledda neurontyper, såsom kortikala eller motoriska neuroner, genom att ersätta mDA-neuronrelevanta färgningar med färgningar med fokus på till exempel synaptisk biologi eller intracellulära aggregat. Kortikala nervceller kan till exempel karakteriseras med hjälp av pan-neuritfärgning mot β-tubulin III och pre- och postsynaptiska proteiner som Synapsin1 och Homer, för vilka högkvalitativa antikroppar har beskrivits29. Motorneuroner kan fenotypas med hjälp av antikroppar mot kolinacetyltransferas (ChAT), TJÄR-DNA-bindande protein 43 (TDP-43) och RNA-granulmarkörer30. Sammanfattningsvis förväntas det presenterade protokollet för att skapa neuronala fenotypiska profiler att vara användbart för forskarsamhället för att utforska effekterna av kemiska eller genetiska störningar på ett brett spektrum av neuronala fenotyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare är anställda av Ksilink.
Acknowledgments
Författarna vill tacka alla kollegor på Ksilink för deras värdefulla hjälp och diskussioner som ledde fram till utformningen av det presenterade protokollet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti- chicken – Alexa 647 | Jackson ImmunoRearch | 703-605-155 | Immunofluorescence |
| Anaconda | https://www.anaconda.com/download | ||
| Anti-Map2 | Novus | NB300-213 | Immunofluorescence |
| Anti-mouse - Alexa 488 | Thermo Fisher | A11001 | Immunofluorescence |
| Anti-rabbit - Alexa 555 | Thermo Fisher | A21429 | Immunofluorescence |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase | Merck | T2928 | Immunofluorescence |
| Anti-α-synuclein | Abcam | 138501 | Immunofluorescence |
| Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head | Agilent | If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. | |
| Confocal microscope | Yokogawa | CV7000 | The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency. |
| Countess Automated cell counter | Invitrogen | Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber. | |
| DPBS +/+ | Gibco | 14040-133 | Buffer for washing |
| EL406 Washer Dispenser | BioTek (Agilent) | If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. | |
| Formaldehyde Solution (PFA 16 %) | Euromedex | EM-15710-S | Fixation before staining |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining |
| iCell Base Medium 1 | Fujifilm | M1010 | Base medium for neurons |
| iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M | Fujifilm | C1087 | Apparently healthy donor |
| iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139 | Fujifilm | C1149 | Donor carrying LRRK2 G2019S mutation |
| iCell Nervous System Supplement | Fujifilm | M1031 | Supplement for base medium |
| iCell Neural Supplement B | Fujifilm | M1029 | Supplement for base medium |
| Jupyter Python Notebook | In-house development | https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling | Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data. |
| Laminin | Biolamina | LN521 | Plate coating |
| PFE-360 | MedChemExpress | HY-120085 | LRRK2 kinase inhibitor |
| PhenoLink | In-house development | https://github.com/Ksilink/PhenoLink | Software for image analysis |
| PhenoPlate 384w, PDL coated | Perkin Elmer | 6057500 | Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope. |
| Storage plates Abgene 120 µL | Thermo Scientific | AB-0781 | Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. |
| Triton | Sigma | T9284 | Permeabilization before lysis |
| Trypan Blue | Sigma | T8154-20ML | Determination of living cells |
| Vprep Pipetting System | Agilent | Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used. |
References
- Panicker, N., Ge, P., Dawson, V. L., Dawson, T. M. The cell biology of Parkinson's disease. The Journal of Cell Biology. 220 (4), 202012095 (2021).
- Caicedo, J. C., et al. Data-analysis strategies for image-based cell profiling. Nature Methods. 14 (9), 849-863 (2017).
- Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).
- Bray, M. -A., et al. Cell Painting, a high-content image-based assay for morphological profiling using multiplexed fluorescent dyes. Nature Protocols. 11 (9), 1757-1774 (2016).
- Schiff, L., et al. Integrating deep learning and unbiased automated high-content screening to identify complex disease signatures in human fibroblasts. Nature Communications. 13 (1), 1590 (2022).
- Ziegler, S., Sievers, S., Waldmann, H.
- Cobb, M. M., Ravisankar, A., Skibinski, G., Finkbeiner, S. iPS cells in the study of PD molecular pathogenesis. Cell and Tissue Research. 373 (1), 61-77 (2018).
- Elitt, M. S., Barbar, L., Tesar, P. J. Drug screening for human genetic diseases using iPSC models. Human Molecular Genetics. 27 (R2), 89-98 (2018).
- Vuidel, A., et al. High-content phenotyping of Parkinson's disease patient stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons using machine learning classification. Stem Cell Reports. 17 (10), 2349-2364 (2022).
- Stirling, D. R., Swain-Bowden, M. J., Lucas, A. M., Carpenter, A. E., Cimini, B. A., Goodman, A. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sofroniew, N., et al. napari: a multi-dimensional image viewer for Python. , (2022).
- Berthold, M. R., et al. KNIME: The Konstanz Information Miner. Data Analysis, Machine Learning and Applications. , 319-326 (2008).
- Fathi, A., et al. Diverging Parkinson's Disease Pathology between patient-derived GBAN370S, LRRK2G2019S and engineered SNCAA53T iPSC-derived Dopaminergic Neurons. bioRxiv. , (2023).
- Wang, Y., Huang, H., Rudin, C., Shaposhnik, Y. Understanding How Dimension Reduction Tools Work: An Empirical Approach to Deciphering t-SNE, UMAP, TriMap, and PaCMAP for Data Visualization. Journal of Machine Learning Research. 22 (201), 1-73 (2021).
- Ke, G., et al. LightGBM: A highly efficient gradient boosting decision tree. Advances in Neural Information Processing Systems. 30, https://papers.nips.cc/paper/2017/hash/6449f44a102fde848669bdd9eb6b76fa-Abstract.html (2017).
- Avazzadeh, S., Baena, J. M., Keighron, C., Feller-Sanchez, Y., Quinlan, L. R. Modelling Parkinson's Disease: iPSCs towards Better Understanding of Human Pathology. Brain Sciences. 11 (3), 373 (2021).
- Sánchez-Danés, A., et al. Disease-specific phenotypes in dopamine neurons from human iPS-based models of genetic and sporadic Parkinson's disease. EMBO Molecular Medicine. 4 (5), 380-395 (2012).
- Oosterveen, T., et al. Pluripotent stem cell derived dopaminergic subpopulations model the selective neuron degeneration in Parkinson's disease. Stem Cell Reports. 16 (11), 2718-2735 (2021).
- Hughes, R. E., et al. Multiparametric high-content cell painting identifies copper ionophores as selective modulators of esophageal cancer phenotypes. ACS Chemical Biology. 17 (7), 1876-1889 (2022).
- Akbarzadeh, M., et al. Morphological profiling by means of the Cell Painting assay enables identification of tubulin-targeting compounds. Cell Chemical Biology. 29 (6), 1053-1064 (2022).
- Schiff, L., et al. Integrating deep learning and unbiased automated high-content screening to identify complex disease signatures in human fibroblasts. Nature Communications. 13 (1), 1590 (2022).
- Way, G. P., et al. Morphology and gene expression profiling provide complementary information for mapping cell state. Cell Systems. 13 (11), 911-923 (2022).
- Feng, Y., Mitchison, T. J., Bender, A., Young, D. W., Tallarico, J. A. Multi-parameter phenotypic profiling: using cellular effects to characterize small-molecule compounds. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (7), 567-578 (2009).
- Antonov, S. A., Novosadova, E. V. Current state-of-the-art and unresolved problems in using human induced pluripotent stem cell-derived dopamine neurons for parkinson's disease drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3381 (2021).
- Miller, J. D., et al. Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell Stem Cell. 13 (6), 691-705 (2013).
- Bezard, E., Gross, C. E., Brotchie, J. M. Presymptomatic compensation in Parkinson's disease is not dopamine-mediated. Trends in Neurosciences. 26 (4), 215-221 (2003).
- Wu, Y., Le, W., Jankovic, J.
- Verstraelen, P., et al. Systematic quantification of synapses in primary neuronal culture. iScience. 23 (9), 101542 (2020).
- Liu-Yesucevitz, L., et al. ALS-Linked mutations enlarge TDP-43-enriched neuronal RNA granules in the dendritic arbor. The Journal of Neuroscience. 34 (12), 4167-4174 (2014).
