Cryotomography électrons des cellules bactériennes

Dans cette vidéo, des images 3D de cellules bactériennes dans des états proches de leur origine à résolution moléculaire sont générées par cryotomographie électronique. Ceci est accompli en congelant d’abord les cellules intactes, ou en congelant et en cryosectionnant les pastilles cellulaires à haute pression. Une série d’images de projection M est acquise et utilisée pour générer une reconstruction 3D, ou Tom Graham, qui est segmentée et analysée par ordinateur.

Bonjour, je suis Grant Jensen de la Division de biologie de Caltech, et c’est Sonya Chen qui a organisé notre présentation. Aujourd’hui, nous allons vous montrer comment faire de la cryotomographie électronique de cellules bactériennes. En règle générale, une seule personne s’occupe de l’ensemble de la procédure, mais comme nos protocoles ont été élaborés grâce à une expérience partagée, nous inclurons tous ceux qui travaillent actuellement dans le laboratoire.

En plus de Sonya et moi sur la vidéo, vous verrez Megan Dobro, Ariana, Bri, Miguel, Alistair McDowell, Mark Rodinsky et Jen. D’autres membres du laboratoire ont produit les captures d’écran d’ordinateur et ont aidé à préparer le protocole écrit qui l’accompagne, notamment Morgan Bebe, Martin Piller, Jane Ding, Joe Lee, Lou GaN, Aliza Tova et Dylan Morris. Ariana va commencer par vous montrer comment nous plongeons et congelons les cellules bactériennes.

Pour les cellules bactériennes minces, une suspension de cellules intactes est plongée congelée sur une grille EM. Ici, le processus est démontré à l’aide d’un congélateur plongeant automatique commercial : commencez par examiner les cultures bactériennes pour vous assurer qu’elles sont exemptes de contaminants et, à une confluence ou à une concentration appropriée, déchargez la grille EM recouverte de carbone pendant deux à quatre minutes. Ensuite, mélangez 100 microlitres de solution d’or colloïdal avec 25 microlitres d’une solution BSA à 5 %.

Centrifuger le mélange à 18 000 G pendant 15 minutes. Après la centrifugation, retirer le surnageant et remettre la pastille d’or en suspension. Dans 20 microlitres de solution cellulaire, placez la grille EM dans le robot Vitra à 100 % d’humidité.

Appliquez ensuite quatre microlitres du mélange de cellules sur la grille EM déchargée par lueur. La grille est automatiquement éponger des deux côtés avec du papier filtre pour éliminer l’excès de liquide, puis plongée rapidement dans un mélange liquide d’éthane et de propane, qui est refroidi par de l’azote liquide. Retirez soigneusement la grille du mélange d’éthane et de propane et transférez-la rapidement dans une boîte de stockage de grille conservée sous de l’azote liquide. Pour les cellules plus épaisses, la congélation à haute pression empêche la cristallisation de la glace.

La cryosection ultérieure rend les échantillons suffisamment minces pour eux. L’imagerie commence par la centrifugation de 15 millilitres de cellules à 1000 tr/min pendant trois minutes. Après la centrifugation, retirer le surnageant mélanger 0,5 millilitre de la pastille de culture restante avec 0,5 millilitre de cryoprotecteur à 20 % de dextrine.

Puis centrifuger à nouveau à 13 000 tr/min pendant 15 secondes. Une fois que les cellules ont été granulées, retirez la pipette surnageante de 0,1 millilitre de la pâte de super granulés dans une pointe de micro-pipette thermoscellée, qui contient déjà 0,2 millilitre de centrifugeuse cryoprotectrice à 20 % de dextrine. Le mélange dans la pointe de la micro-pipette à 13 000 RBM pendant 30 secondes.

Après l’essorage, retirez le surnageant. Une pastille étanche de cinq à 10 microlitres est visible à l’extrémité scellée. Transférez la pâte dans un demi-dôme d’un planchet bombé en laiton recouvert de téflon déjà monté dans le bras du support de congélateur haute pression, puis scellez-le avec son chapeau plat en laiton.

Ensuite, insérez rapidement l’ensemble de bras dans le congélateur haute pression amorcé. À une pression de 2100 bars, l’unité combinée de planche en laiton contenant les cellules est rapidement refroidie par un jet d’azote liquide à haute pression. Une fois les cellules refroidies, retirez rapidement l’ensemble du bras et plongez-le rapidement dans un bain d’azote liquide pour éviter que la planchette ne se réchauffe.

Ensuite, transférez la planchette dans un mandrin en forme d’étau de cryomicrotome pré-refroidi monté solidement dans la chambre du cryomicrotome pour exposer le dôme bien congelé des cellules pour la section. Les deux planches en laiton sont soigneusement séparées sous azote liquide. Un dôme de cellules parfaitement gelé sera d’apparence vitreuse et exempt de fissures et de fissures de nucléation de glace.

À l’aide du cryo-microtome, façonnez la région du dôme extérieur à moins de 0,2 millimètre carré à l’aide de l’outil de coupe diamanté avec une vitesse de coupe rapide et une profondeur d’environ 200 micromètres avec un spray antistatique dirigé vers le couteau à faible angle et les grilles de support en cuivre. À proximité, avancez soigneusement le couteau diamanté vers la face du bloc poli en utilisant une vitesse de coupe d’environ 0,4 millimètre par seconde et une fenêtre de coupe étroite. Commencez à sectionner des tranches de 50 à 350 nanomètres d’épaisseur.

Manœuvrez un applicateur de cils fins pour accrocher les premières sections, en glissant sur le bord du couteau en diamants à faible angle et pour soutenir et guider les rubans de sections sur le support de la grille de cuivre. Une fois la grille chargée, utilisez une sonde en argent poli refroidi pour appuyer fermement sur les rubans. Conservez les grilles dans les boîtes de grille dans un récipient sec refroidi à l’azote liquide jusqu’à ce que le microscope soit prêt.

Les cellules bactériennes sur la grille peuvent être imagées à l’aide d’un cryomicroscope optique. Ici, un microscope inversé Nikon personnalisé, TIB avec platine cryo FEI modifiée, sera utilisé. Chargez les grilles dans des cartouches sur la station cryogénique et fixez-les à l’aide des anneaux de clip en cuivre, puis placez la cartouche dans un tube d’azote liquide pour le transfert.

Chargez jusqu’à deux cartouches dans l’étage de cryo de pré-refroidissement et déplacez la grille dans la fenêtre de visualisation. Abaissez ensuite la lentille du condenseur et faites la mise au point de la lentille de l’objectif sur la grille. Trouvez les cellules et prenez des images.

Pour une étude LM et EM corrélée. La grille est balayée autour de la zone des cellules pour localiser les cellules plus tard dans em. Après avoir numérisé la grille, remettez la cartouche dans le tube et maintenez le tube dans l’azote liquide jusqu’à ce qu’il soit prêt à être imagé en EM pour obtenir une TOM 3D de la cellule bactérienne.

Une série d’images de projection est prise pendant que l’échantillon est incliné progressivement le long d’un ou deux E dans le cryo TEM ici, la procédure est démontrée à l’aide de legon avec une charge polaire cryo T-E-M-F-E-I-T-F 30 jusqu’à six cartouches dans un support à sélection multiple sur la station cryogénique. Connectez-le ensuite à la cartouche TF 30 Polar Select one et insérez-le dans la colonne EM. Démarrer la légende sur le logiciel client sur l’ordinateur EM.

Entrez les conditions d’image pour la légende de la session. Sélectionnez des cibles sur les images à partir du grossissement le plus faible et envoyez-les à l’étape suivante avec un grossissement plus élevé. Ensuite, mettez en file d’attente toutes les cibles pour la collection de la série Tilt et soumettez-les toutes à l’étape finale de la tomographie.

Acquérez une série d’images. L’échantillon sera incliné progressivement le long d’un ou deux axes dans le cryo TEM. Une fois l’expérience terminée, téléchargez la série d’inclinaisons terminée sur un poste de travail local pour la reconstruction.

Les Tomo Grahams des cellules bactériennes sont calculés à l’aide d’un logiciel spécialisé. Le programme Raptor est utilisé pour reconstruire les Toms automatiquement et e tomo peut être utilisé pour le faire de manière semi-automatique. Inspectez la série d’inclinaison à l’aide de la visionneuse de mods 3D d’Im MOD et jetez celles qui, en raison d’erreurs de suivi ou d’autres erreurs, sont peu susceptibles de produire.

Un bon tommo raptor est exécuté et distribué sur les machines Linux dans le laboratoire en utilisant les paramètres de base. Il faut compter de 20 minutes à deux heures selon la taille du fichier pour générer le tomographe. Lorsque Raptor échoue ou qu’un enquêteur souhaite s’assurer que la reconstruction est optimale, EMO peut être utilisé pour aligner soigneusement les images à la main.

Suivez les étapes de chaque onglet de l’interface graphique e tomo pour reconstruire le Tom Graham de la série Tilt. Nous utilisons une base de données interne basée sur le Web pour organiser, magasiner, rechercher et distribuer les données tomographiques. La page de navigation principale présente une image miniature et un film YouTube en vedette.

Pour chaque tomo Graham. Une fois les Tommo, Grahams obtenus, les caractéristiques individuelles peuvent être segmentées pour aider à visualiser leurs formes. Dans la segmentation 3D, il s’agit d’attribuer chaque vle de l’image 3D à une région ou à un matériau particulier.

Ici, un logiciel de miroir est utilisé pour générer un modèle de surface dans lequel chaque région est représentée avec une couleur différente et visualisée dans des films et des animations 3D du tomo. Grahams peut être amené à résumer des projets et à illustrer les résultats dans des graphiques 3D. Représentation. Des logiciels tels que Amira ou Kymera peuvent être utilisés pour rendre les images fixes individuelles du film et de la publicité.

Les logiciels de montage vidéo tels qu’Adobe Premier peuvent être utilisés pour éditer le logiciel commercial de film. Maya est utilisé pour générer l’animation. Il peut prendre les surfaces d’Amira, construire des images clés et les rendre dans un film.

Ici, une série représentative d’inclinaison de données de cellules entières est montrée pour le Spiro Treponema Promesa, suivie d’une vue tranche par tranche de l’Agram Tom reconstruit. La segmentation de la cellule T Promesa distingue sa membrane externe, sa membrane interne et ses structures de surface, y compris les bols de surface et l’arcade à crochet de surface. La bactérie est flagelle et motrice ulaire, cône périplasmique et pillai.

Ce modèle mécanique montre comment le spirochète tréponema Promesa nage et comment le cylindre ou le noyau interne est entouré d’une gaine externe. Les flagelles se déplacent comme des rouleaux de peinture entre le cylindre intérieur et la gaine extérieure. Lorsque les flagelles tournent, le compteur du cylindre intérieur tourne à l’intérieur de la gaine extérieure.

Dans un environnement non visqueux, la cellule tourne inutilement, mais dans des environnements visqueux comme ceux dans lesquels T Promesa se trouve dans la nature, les fibres externes ou d’autres objets résistent à la rotation de la gaine extérieure, accélérant la rotation du cylindre intérieur et fournissant des matériaux contre lesquels la cellule peut pousser lorsqu’elle se perce vers l’avant. On voit ici de vraies cellules T proméeus, observées au microscope optique. Nous venons de vous montrer comment faire de la cryotomographie électronique de cellules bactériennes.

Bien sûr, nous sommes conscients que ce type de travail nécessite des investissements majeurs. Les cryomicroscopes électroniques et les microscopes à fluorescence sont sophistiqués et coûteux, et ils doivent également être correctement cités. Par exemple, la fondation de cette pièce est une dalle de béton isolée mécaniquement, de plusieurs pieds d’épaisseur, reposant sur un sol spécialement compacté.

Le système de climatisation est également conçu sur mesure avec de grands conduits et des courbes douces pour maintenir une température constante sans courants d’air ni turbulences. Les rideaux que vous voyez sont placés de manière à réduire le bruit acoustique. Et enfin, nous vérifions que cette pièce est exempte de champs électromagnétiques interférents.

Bien que les opérations que nous vous avons montrées au microscope soient aujourd’hui largement automatisées, des problèmes surviennent encore fréquemment et nécessitent un diagnostic expert. Néanmoins, nous espérons que le visionnage de ce film vous a permis d’apprécier les procédures et l’instrumentation impliquées dans ce type de travail. Je vous remercie de votre attention.