Name: Cryotomography électrons des cellules bactériennes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Découvrez la cryotomographie électronique pour visualiser l'ultrastructure des cellules bactériennes à résolution macromoléculaire. Cette méthode combine congélation par immersion et reconstruction 3D computationnelle.

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Ce travail a été soutenu en partie par les Instituts nationaux de Santé des subventions R01 AI067548, R01 GM081520, R01 GM086200, R01 AI049194, et P01 GM066521 d&#39;GJJ ainsi que le Howard Hughes Medical Institute, l&#39;Institut Beckman à Caltech, et des dons à partir du Caltech Gordon et Betty Moore Foundation et l&#39;Institut Agouron. MSL est soutenu par NIH-2R37 A1041239-06A1 à Pamela S. Björkman. Leica Microsystems Inc aimablement fourni des contenus vidéo de la collecte cryosection. Les résultats représentatifs de Treponema primitia ont été collectées et traitées par Gavin E. Murphy, et publiée dans Molecular Microbiology avec le titre &quot;ultrastructures roman de Treponema primitia et leurs implications pour la motilité». (Murphy, G. et al., Mol. Microbiol. 67, 1184-1195, 2008).

<ol><li>Jensen, G. J., Briegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+electron+cryotomography+is+opening+a+new+window+onto+prokaryotic+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).</li>
<li>Li, Z., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography%3A+a+new+view+into+microbial+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography: a new view into microbial ultrastructure.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 333-340 (2009).</li>
<li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+biological+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of biological complexity.</a> J. Struct. Biol. 138, 85-91 (2002).</li>
<li>Iancu, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+sample+preparation+using+the+Vitrobot%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot.</a> Nat. Protocols. 1, 2813-2819 (2007).</li>
<li>Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+cryofixation+by+high-pressure+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">A new approach for cryofixation by high-pressure freezing.</a> J. Microsc. 203, 285-294 (2001).</li>
<li>Ladinsky, M. S., Pierson, J., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitreous+cryosectioning+of+cells%2C+facilitated+by+a+micromanipulator%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Vitreous cryosectioning of cells, facilitated by a micromanipulator.</a> J. Microsc. 224, 129-134 (2006).</li>
<li>Pierson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+technique+of+vitreous+cryo-sectioning+for+cryo-electron+tomography%3A+Electrostatic+charging+for+section+attachment+and+implementation+of+an+anti-contamination+glove+box%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving the technique of vitreous cryo-sectioning for cryo-electron tomography: Electrostatic charging for section attachment and implementation of an anti-contamination glove box.</a> J. Struct. Biol. 169, (2009).</li>
<li>Suloway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated%2C+sequential+tilt-series+acquisition+with+Leginon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon.</a> J. Struct. Biol. 167, 11-18 (2009).</li>
<li>Fernando, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markov+random+field+based+automatic+image+alignment+for+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Markov random field based automatic image alignment for electron tomography.</a> J. Struct. Biol. 161, 260-275 (2008).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-axis+tomography%3A+an+approach+with+alignment+methods+that+preserve+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-axis tomography: an approach with alignment methods that preserve resolution.</a> J. Struct. Biol. 120, 343-352 (1997).</li>
</ol>

Nous montrons dans cet article la vidéo comment faire ECT des cellules bactériennes. Limité par l&#39;espace et le temps, nous ne montrons le protocole général. Plus de détails peuvent être trouvés dans les journaux, les informations en ligne ou autres fournis par la fabrique de l&#39;équipement et les développeurs de logiciels, et de groupes de recherche du TCE. Selon les différentes espèces bactériennes étudiées, le matériel utilisé et l&#39;intérêt structurel dans les cellules, le protocole et les paramètres expérimentaux doivent être testés et optimisés.

<table><tbody><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>solution à 0,1 %</td></tr><tr><td>MKIII Vitrobot</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution colloïdale d'or</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1527-25ml</td><td>10 nm</td></tr><tr><td>Albumine de sérum bovin</td><td>Invitrogen</td><td>P2489</td><td>10 %</td></tr><tr><td>Papier filtre n° 1</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1001 055</td><td></td></tr><tr><td>Dextrane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31389</td><td>15-25 %, MM 39000</td></tr><tr><td>Plaquette en laiton bombée</td><td>Swiss Precision Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Concuteur à haute pression Bal-Tec HPm 010</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome cryogénique Cryo-ultra UC6/FC6</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tranchage cryogénique en diamant 45</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ioniseur statique II</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transporteur cryogénique CX100</td><td>Taylor-Wharton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Station de chargement MSH</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé Ti E/B</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Personnalisé</td></tr><tr><td>Stade cryo LM</td><td>FEI</td><td></td><td>Personnalisé</td></tr><tr><td>TF30-polara</td><td>FEI</td><td></td><td>Avec UltraCam de Gatan</td></tr><tr><td>Amira</td><td>Visage Imaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cryotomography électrons des cellules bactériennes

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

Bien qu&#39;une grande partie est déjà connu sur le métabolisme de base des cellules bactériennes, de nombreuses questions fondamentales restent étonnamment sans réponse, y compris par exemple la façon dont ils générer et maintenir des formes de cellules spécifiques, d&#39;établir la polarité, la ségrégation de leurs génomes, et de diviser. Afin de comprendre ces phénomènes, les technologies d&#39;imagerie sont nécessaires pour combler le fossé entre la résolution de microscopie par fluorescence et de lumière à haute résolution des méthodes telles que cristallographie aux rayons X et la spectroscopie RMN. Electron cryotomography (ECT) est une technologie émergente qui fait juste cela, en permettant l&#39;ultrastructure des cellules pour être visualisées dans un état ​​quasi-natives, en trois dimensions (3D), avec &quot;macromoléculaires&quot; résolution (~ 4 nm). 1, 2 dans ECT, les cellules sont imagés dans un corps vitré, «congelé-hydraté&quot; état dans un microscope électronique à transmission cryo (cryoTEM) à basse température (&lt;-180 ° C). Pour minces cellules (jusqu&#39;à ~ 500 nm d&#39;épaisseur 3), les cellules intactes sont plongeante congelé dans les médias à travers des grilles dans cryogènes EM tels que l&#39;éthane ou d&#39;éthane / propane mélanges. Plus épais cellules et des biofilms peuvent également être visualisés dans un état vitreux d&#39;abord &quot;haute pression de congélation&quot; et puis, «cryo-coupes» eux. Une série d&#39;images de projection à deux dimensions sont ensuite collectés à travers l&#39;échantillon car il est progressivement inclinée le long d&#39;un ou deux axes. Une reconstitution en trois dimensions, ou «tomographie» peut alors être calculée à partir des images. Alors que l&#39;ECT ​​nécessite une instrumentation coûteuse, ces dernières années, il a été utilisé dans quelques laboratoires de révéler les structures de divers appendices externes, les structures d&#39;enveloppes cellulaires différentes, les positions et les structures de filaments du cytosquelette, et les endroits et les architectures des grands macromoléculaires ensembles tels que les moteurs flagellaires, compartiments internes et les tableaux des chémorécepteurs. 1, 2 Dans cet article, la vidéo, nous illustrons comment les cellules d&#39;image avec l&#39;ECT, y compris le processus de préparation des échantillons, la collecte des données, la reconstruction tomogramme, et l&#39;interprétation des résultats grâce à la segmentation et dans certains cas de corrélation avec la microscopie optique.

Nous illustrons ici comment utiliser électrons cryotomography (ECT) pour étudier l&#39;ultrastructure des cellules bactériennes en quasi-natif états, à «macromoléculaires&quot; (~ 4 nm) de résolution.

Cryotomography électrons des cellules bactériennes

Bien que l'on en sache déjà beaucoup sur le métabolisme de base des cellules bactériennes, de nombreuses questions fondamentales restent étonnamment sans réponse, y compris pour...

Dans cette vidéo, des images 3D de cellules bactériennes dans des états proches de l'état natif à une résolution moléculaire sont obtenues par tomographie électronique cryogénique. Cette technique consiste à congeler rapidement des cellules intactes par trempe, ou alternativement à utiliser une congélation sous haute pression suivie d'une cryoséctionnement des culots cellulaires. Une série de M images de projection sont acquises et utilisées pour générer une reconstruction 3D, ou Tom Graham, qui est segmentée et analysée ultérieurement par voie computationnelle.Bonjour, je suis Grant Jensen de la Division de biologie du Caltech, et voici Sonya Chen, qui a organisé notre présentation. Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment réaliser une tomographie électronique cryogénique de cellules bactériennes. Habituellement, une seule personne effectue l'ensemble de la procédure, mais comme nos protocoles ont été élaborés grâce à une expérience partagée, nous inclurons toutes les personnes actuellement en poste dans le laboratoire.En plus de Sonya et moi à l’image, vous verrez Megan Dobro, Ariana, Bri, Miguel, Alistair McDowell, Mark Rodinsky et Jen. Les autres membres du laboratoire ont produit les captures d’écran informatiques et ont aidé à préparer le protocole écrit accompagnant, notamment Morgan Bebe, Martin Piller, Jane Ding, Joe Lee, Lou GaN, Aliza Tova et Dylan Morris. Ariana commencera par vous montrer comment nous réalisons la congélation par trempe de cellules bactériennes.Pour les cellules bactériennes minces, une suspension de cellules intactes est plongée dans un bain d'éthane liquide sur une grille de microscopie électronique (ME). Ici, le processus est illustré à l'aide d'un congélateur automatique commercial : commencez par examiner les cultures bactériennes afin de vous assurer qu'elles sont exemptes de contaminants et qu'elles présentent une confluence ou une concentration appropriée. Soumettez la grille de ME recouverte de carbone à une décharge électrique pendant deux à quatre minutes. Ensuite, mélangez 100 microlitres de solution d'or colloïdal avec 25 microlitres d'une solution de BSA à 5 %.Centrifuger le mélange à 18 000 G pendant 15 minutes. Après la centrifugation, éliminer le surnageant et resuspendre le culot d'or. Dans 20 microlitres de solution cellulaire, placer la grille de ME dans le Vitra bot à une humidité de 100 %.Appliquez ensuite quatre microlitres du mélange cellulaire sur une grille de microscopie électronique activée par un traitement au plasma. La grille est automatiquement épongée des deux côtés à l’aide de papier filtre pour éliminer l’excès de liquide, puis plongée rapidement dans un mélange liquide d’éthane et de propane refroidi par de l’azote liquide. Retirez soigneusement la grille du mélange d’éthane et de propane et transférez-la rapidement dans une boîte de stockage pour grilles maintenue sous azote liquide. Pour les cellules plus épaisses, le congélation à haute pression empêche la cristallisation de la glace.La coupe ultérieure en cryomicrotomie rend les échantillons suffisamment minces pour la microscopie électronique. L'imagerie commence par une centrifugation de 15 millilitres de cellules à 1000 tr/min pendant trois minutes. Après la centrifugation, retirez le surnageant et mélangez 0,5 millilitre du culot cellulaire restant avec 0,5 millilitre de cryoprotecteur contenant 20 % de dextrine.Ensuite, centrifuger à nouveau à 13 000 tr/min pendant 15 secondes. Une fois les cellules formées en culot, retirer le surnageant et prélever au micropipette 0,1 millilitre de la pâte de culot dans une pointe de micropipette scellée à chaud, contenant déjà 0,2 millilitre de cryoprotectant à 20 % de dextrine. Centrifuger le mélange dans la pointe de micropipette à 13 000 tr/min pendant 30 secondes.Après la centrifugation, retirez le surnageant. Un culot compact de cinq à dix microlitres est visible à l'extrémité scellée. Transférez la pâte dans une demi-coupole d'une cupule bombée en laiton revêtue de téflon déjà montée sur le bras du porte-échantillon du congélateur à haute pression, puis scellez-la avec son couvercle plat en laiton apparié.Insérez ensuite rapidement l'ensemble du bras dans le congélateur à haute pression amorcé. À une pression de 2100 bar, l'unité combinée en laiton contenant les cellules est refroidie rapidement par un jet d'azote liquide sous haute pression. Une fois les cellules refroidies, retirez rapidement l'ensemble du bras et plongez-le immédiatement dans un bain d'azote liquide afin d'empêcher la plaquette de se réchauffer.Ensuite, transférez la plaquette vers un mandrin en forme de pince préalablement refroidi, fixé solidement dans la chambre du microtome cryogénique, afin d'exposer la calotte parfaitement congelée de cellules pour la sectionnement. Les deux plaquettes en laiton sont soigneusement séparées sous azote liquide. Une calotte de cellules parfaitement congelée présentera un aspect vitreux, sans fissures ni signes de nucléation de glace.À l’aide du microtome cryogénique, façonner la région externe du dôme en une surface inférieure à 0,2 millimètre carré à l’aide de l’outil de taille en diamant, en conservant une profondeur d’environ 200 micromètres et en utilisant une vitesse de sectionnement rapide, tout en dirigeant un aérosol antistatique vers le couteau à faible angle et vers les grilles de support en cuivre. Puis, avancer soigneusement le couteau en diamant jusqu’à la face polie du bloc à une vitesse de coupe d’environ 0,4 millimètre par seconde et avec une fenêtre de coupe étroite. Commencer à réaliser des sections de 50 à 350 nanomètres d’épaisseur.Manœuvrer un applicateur fin en cils pour accrocher les premières sections, en les faisant glisser hors du tranchant du couteau en diamant à faible angle, afin de soutenir et guider les rubans de sections à travers le support en grille de cuivre. Une fois la grille chargée, utiliser une sonde en argent poli refroidie pour appuyer fermement sur les rubans. Conserver les grilles dans les boîtes à grilles placées dans un transporteur sec refroidi à l'azote liquide jusqu'à ce que le microscope soit prêt.Les cellules bactériennes présentes sur la grille peuvent être observées à l’aide d’un microscope optique cryogénique. Ici, un microscope inversé Nikon personnalisé, TIB, équipé d’un porte-objet cryogénique FEI modifié sera utilisé. Chargez les grilles dans des cartouches sur la station cryogénique et fixez-les à l’aide des anneaux de serrage en cuivre, puis placez la cartouche dans un tube contenant de l’azote liquide pour le transfert.Chargez jusqu'à deux cartouches dans le porte-objet cryogénique prérefroidi et déplacez la grille dans la fenêtre de visualisation. Abaissez ensuite l'objectif condenseur et focalisez l'objectif sur la grille. Repérez les cellules et prenez des images.Pour une étude corrélée en microscopie optique (LM) et en microscopie électronique (EM). La grille est balayée autour de la zone des cellules afin de localiser celles-ci ultérieurement en ME. Après avoir obtenu l'image de la grille, remettez la cartouche dans le tube et conservez le tube dans l'azote liquide jusqu'au moment de l'acquisition en microscopie électronique pour obtenir une tomographie en 3D (TOM) de la cellule bactérienne.Une série d'images de projection est acquise tandis que l'échantillon est incliné progressivement selon un ou deux axes dans le MET cryogénique ; ici, la procédure est démontrée à l'aide de Legon avec un TF 30 Polar cryogénique. Chargez jusqu'à six cartouches dans un porte-échantillons multisélection sur la station cryogénique. Ensuite, connectez-le au TF 30 Polar. Sélectionnez une cartouche et insérez-la dans la colonne du microscope électronique. Lancez Legon via le logiciel client sur l'ordinateur du microscope électronique.Saisissez les conditions d'image pour la légende de la session. Sélectionnez les cibles sur les images en partant du grossissement le plus faible et envoyez-les à l'étape suivante avec un grossissement plus élevé. Ensuite, mettez toutes les cibles en file d'attente pour la collecte des séries de basculement et soumettez-les toutes à l'étape finale de tomographie.Acquérir une série d'images. L'échantillon sera incliné progressivement selon un ou deux axes dans le MET cryogénique. Une fois l'expérience terminée, télécharger la série d'inclinaisons complète sur une station de travail locale pour la reconstruction.Les tomogrammes des cellules bactériennes sont calculés à l'aide d'un logiciel spécialisé. Le programme Raptor est utilisé pour reconstruire automatiquement les tomogrammes et eTomo peut être utilisé pour le faire de manière semi-automatique. Examiner la série de basculement à l'aide du visualiseur 3D mod d'IMOD et éliminer celles qui, en raison d'erreurs de suivi ou d'autres problèmes, sont peu susceptibles de produire des résultats satisfaisants.Un bon tommo raptor est exécuté de manière distribuée sur les machines Linux du laboratoire en utilisant les paramètres de base. La génération du tomogramme prend de 20 minutes à deux heures, selon la taille du fichier. Lorsque Raptor échoue ou qu'un chercheur souhaite s'assurer que la reconstruction est optimale, EMO peut être utilisé pour aligner soigneusement les images manuellement.Suivez les étapes de chaque onglet de l'interface graphique e tomo pour reconstruire le Tom Graham à partir de la série d'inclinaisons. Nous utilisons une base de données interne basée sur le web pour organiser, stocker, rechercher et distribuer les données tomographiques. La page principale d'exploration présente une image miniature et un film présenté de manière similaire à YouTube.Pour chaque tomo Graham. Après l'obtention des Tommo, Grahams, les caractéristiques individuelles peuvent être segmentées afin de faciliter la visualisation de leurs formes. En 3D, la segmentation est le processus qui consiste à attribuer chaque voxel de l'image 3D à une région ou à un matériau particulier.Ici, un logiciel de type « mirror » est utilisé pour générer un modèle de surface dans lequel chaque région est représentée avec une couleur différente et visualisée sous forme de films et d'animations 3D de la tomographie. Des graphiques peuvent être réalisés pour résumer des projets et illustrer les résultats à l'aide de graphiques 3D. Des logiciels tels qu'Amira ou Kymera peuvent être utilisés pour rendre les images fixes individuelles du film et de la publicité.Un logiciel de montage vidéo tel qu'Adobe Premiere peut être utilisé pour éditer le film réalisé avec un logiciel commercial. Maya est utilisé pour générer l'animation. Il peut importer les surfaces depuis Amira, créer des images clés et rendre le film.Ici, une série inclinée représentative de données de cellules entières est présentée pour le Spirochète Treponema Promesa, suivie d'une vue tranchée par tranchée du tomogramme reconstruit. La segmentation de la cellule de T. Promesa distingue sa membrane externe, sa membrane interne et ses structures de surface, incluant les cupules superficielles et l'arcade en crochet de surface. La bactérie possède des flagelles et un moteur axial, un cône périplasmique et des pilis.Ce modèle mécanique montre comment le spirochète Treponema Promesa nage, avec un cylindre interne ou noyau entouré par une gaine externe. Les flagelles se déplacent comme des rouleaux à peinture entre le cylindre interne et la gaine externe. Lorsque les flagelles tournent, le cylindre interne effectue une rotation inverse à l'intérieur de la gaine externe.Dans un environnement non visqueux, la cellule tourne inutilement, mais dans des environnements visqueux comme ceux où l'on trouve naturellement T Promesa, des fibres extérieures ou d'autres objets résistent à la rotation de la gaine externe, accélérant ainsi la rotation du cylindre interne et fournissant des matériaux contre lesquels la cellule peut pousser lorsqu'elle s'enfonce en vrillant. On observe ici des cellules réelles de T promeus telles qu'elles apparaissent au microscope optique. Nous venons de vous montrer comment réaliser une tomographie cryo-électronique de cellules bactériennes.Bien sûr, nous sommes conscients que ce type de travail nécessite des investissements importants. Les microscopes électroniques cryogéniques et les microscopes à fluorescence sont des instruments sophistiqués et coûteux, qui doivent également être correctement cités. Par exemple, la fondation de cette salle est une dalle de béton isolée mécaniquement, épaisse de plusieurs pieds, reposant sur un sol spécialement compacté.Le système de climatisation est également conçu sur mesure avec de larges conduits et des courbes douces afin de maintenir une température constante sans courants d'air ni turbulence. Les rideaux que vous voyez sont placés pour réduire le bruit acoustique. Enfin, nous vérifions que cette pièce est exempte de champs électromagnétiques perturbateurs.Bien que les opérations que nous vous avons montrées sur le microscope soient désormais largement automatisées, des problèmes surviennent encore fréquemment et nécessitent un diagnostic expert. Néanmoins, nous espérons que la vision de ce film vous a aidé à mieux comprendre les procédures et les instruments utilisés dans ce type de travail. Merci de votre attention.

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Source : Chetrit, D., et al. Application de l’imagerie de cellules vivantes et de la cryo-tomographie électronique pour résoudre les caractéristiques spatio-temporelles du système de sécrétion Dot/Icm de Legionella pneumophila . J. Vis. Exp. (2020)La vidéo décrit comment préparer des échantillons de Legionella pneumophila pour la cryotomographie électronique en combinant la culture bactérienne, le marquage de nanoparticules d’or et les techniques de vitrification. Le processus préserve les...

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