Encyclopedia of Experiments: Biology
Un abonnement à JoVE est nécessaire pour afficher ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Samla först flugor i önskat utvecklingsstadium och placera dem i ett sterilt rör. För att bara räkna den inre mikrobiotan, sterilisera flugornas utsida genom att dränka dem i 70% etanol. För att mäta både den inre och externa mikrobiotan, hoppa över detta steriliseringssteg.
Du bör nu ha en homogen blandning som innehåller bakterier som du kan odla. Ta upp homogenatets volym med flytande bakteriemedium. Utför seriella utspädningar av homogenatet och plätera en konstant volym av dessa utspädningar på lämpligt fast tillväxtmedium för dina bakterier.
I exempelprotokollet kommer vi att inokulera sterila flugor med en gnotobiotisk eller definierad bakteriekultur och samla in och mäta CFUs.
- Använd filterspetsar för att överföra 100 mikroliter över natten till ett sterilt mikrofugerör. Därefter överför du 200 mikroliter av varje kultur till en 96-brunnsplatta.
Efter att ha erhållit OD600, ta bort supernaten med en pipettspets och använd färsk mMRS för att suspendera pelleten igen. Blanda de utspädda bakteriestammarna i lika stora förhållanden för att skapa en cocktail av flera arter.
För att mäta Koloniformningsenheter eller CFUs, överför fem flugor till ett 1,7 milliliter mikrofugerör som innehåller 125 mikroliter keramiska pärlor och 125 mikroliter mMRS-buljong. Homogenisera flugorna med hjälp av en vävnadshom homogenisator.
Ta bort 10 mikroliter från den första brunnen och tillsätt den till den andra brunnen som innehåller 70 mikroliter MRS. Blanda innehållet i den andra brunnen noggrant. Överför sedan 10 mikroliter från den andra brunnen till den tredje brunnen som innehåller 70 mikroliter MRS, och blanda noggrant. Överför 10 mikroliter av varje utspädning till en mMRS-platta. Luta skålen något för att sprida utspädningen flera millimeter ner i agarens yta och låt vätskan torka innan du flyttar plattan. Ta bort plattorna från inkubatorn när distinkta enskilda kolonier är synliga och räkna dem från en utspädning med 10 till 100 isolerade kolonier. Slutligen beräkna CFU per fluga.
