Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Primeiro, coletar moscas no estágio desejado de desenvolvimento e colocá-las em um tubo estéril. Para contar apenas a microbiota interna, esterilize o exterior das moscas submergindo-as em 70% de etanol. Para medir tanto a microbiota interna quanto externa, pule esse passo de esterilização. Em seguida, moer as moscas em um pequeno volume de mídia de crescimento bacteriano usando contas cerâmicas e um homogeneizador de tecido, ou manualmente com um pilão.
Agora você deve ter uma mistura homogênea contendo bactérias que você pode cultivar. Traga o volume do homogeneado utilizando meio bacteriano líquido. Realize diluições seriais do homogeneado e emplaque um volume constante dessas diluições no meio de crescimento sólido adequado para suas bactérias. À medida que as bactérias crescem, as colônias se formarão na placa. Encontre a diluição que tem um alcance de 10 a 100 colônias para determinar as Unidades de Formação de Colônias, ou UFC, da amostra.
No protocolo de exemplo, vamos vacinar moscas estéreis com uma cultura bacteriana gnotobiótica ou definida e coletar e medir CFUs.
- Use dicas de filtro para transferir 100 microliters de crescimento noturno para um tubo de microfuça estéril. Em seguida, transfira 200 microliters de cada cultura para uma placa de 96 poços. Remova as amostras do armário de biossegurança e centrífugas para pelotar as bactérias. Depois de fazer diluições de uma, duas e quatro vezes, meça a densidade óptica ou OD600 em um espectrômetro de leitura de placas multi-bem.
Depois de obter o OD600, remova o supernascer com uma ponta de pipeta e use mMRS frescos para suspender novamente a pelota. Misture as cepas bacterianas diluídas em proporções iguais para criar um coquetel de várias espécies. Transfira 50 microlitros do coquetel para os tubos cônicos contendo a dieta estéril e ovos descorados.
Para medir as Unidades de Formação de Colônias ou CFUs, transfira cinco moscas para um tubo de microfuça de 1,7 mililitro contendo 125 microlitros de contas cerâmicas e 125 microlitros de caldo mMRS. Homogeneize as moscas usando um homogeneizador de tecido. Não deve haver pedaços inteiros que a mosca remanescente. Em seguida, diluir o homogeneizado com 875 microlitros de mMRS, vórtice o homogeneizador por cinco segundos, e pipeta 120 microlitros no primeiro poço de uma placa de microtiter.
Remova 10 microliters do primeiro poço e adicione-o ao segundo poço contendo 70 microliters de MRS. Misture o conteúdo do segundo bem completamente. Em seguida, transfira 10 microliters do segundo poço para o terceiro poço contendo 70 microliters de MRS, e misture bem. Transfira 10 microlitros de cada diluição para uma placa mMRS. Incline-se ligeiramente o prato para espalhar a diluição vários milímetros pela superfície do ágar e deixe o líquido secar antes de mover a placa. Remova as placas da incubadora uma vez que colônias individuais distintas sejam visíveis e conte-as de uma diluição com 10 a 100 colônias isoladas. Por fim, calcule a UFC por mosca.
