Génération de cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse : une méthode pour générer des cellules dendritiques à partir de moelle osseuse de souris

- Les cellules dendritiques ou DC sont des cellules présentatrices d’antigènes clés qui activent les lymphocytes T. Chez les patients leucémiques, ces cellules expriment mal l’antigène associé à la tumeur et ne parviennent pas à provoquer une réponse immunitaire spécifique à l’antigène. Les cellules dendritiques sont abondantes dans la moelle osseuse. Et par conséquent, la moelle osseuse est le site privilégié pour leur isolement afin d’aider à étudier leur rôle dans le cancer.

Pour obtenir des cellules dendritiques, extrayez la moelle osseuse du fémur ou du tibia d'une souris euthanasiée à l'aide d'une seringue remplie de média pour la rincer. Centrifuger et remettre en suspension la pastille dans un tampon d’ammonium-chlorure-potassium ou ACK pour lyser les érythrocytes. Ajoutez maintenant du milieu de culture pour arrêter la lyse et la centrifugeuse. Remettre la pastille en suspension dans le milieu de culture contenant un antibiotique. Ajoutez le facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages ou GM-CSF, et transférez la suspension cellulaire sur une plaque de Petri.

Incuber la plaque pendant la durée souhaitée. Le GM-CSF aide les cellules progénitrices à se différencier en cellules dendritiques. Enfin, activez les cellules avec des lipopolysaccharides ou LPS, qui se lient au récepteur de surface des cellules dendritiques, ce qui permet d’obtenir des cellules dendritiques de la moelle osseuse complètement matures et immunogènes. Dans ce protocole, nous démontrerons la génération de cellules dendritiques à partir de la moelle osseuse de souris.

- Pour générer des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse, isolez la moelle osseuse des fémurs de souris de type sauvage ou de souris knock-out de type sauvage ou de facteur B, comme démontré, et lysez les globules rouges dans 5 millilitres de tampon de lyse ACK, en arrêtant la réaction avec 10 millilitres de RPMI, complété par 1 % de FBS après cinq minutes.

Après avoir recueilli les cellules sanguines entières par centrifugation, remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de milieu de culture à une concentration de 2 fois 10 à 6 cellules par millilitre et ajoutez 20 nanogrammes par millilitre de GM-CSF aux cellules, avant d’ensemencer 10 millilitres de cellules dans des boîtes de Pétri individuelles de 100 par 15 millimètres à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant six jours. Le sixième jour, activez les cultures de cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse avec 25 microgrammes par millilitre de LPS par plaque.