Protocole d’isolement de cellules dendritiques macrophages dérivés de monocytes de souris et leur Activation ultérieure In Vitro avec tumeur Complexes immuns

Cette méthode est conçue pour aider les scientifiques à isoler les CD dérivés des monocytes dans le sang et les tumeurs de souris porteuses de tumeurs afin d’étudier leurs propriétés immunostimulantes. Je pense que le principal avantage de cette procédure par rapport à d’autres méthodes est que les DC dérivées des monocytes obtenues reflètent mieux leur état d’activation dans la tumeur et le sang. Le plus difficile est probablement de s’assurer que tous vos réactifs et outils sont stériles et que vous n’introduirez pas de contamination pendant cette procédure.

J’isole des cellules myéloïdes et des cellules dendritiques de tumeurs depuis plus de 15 ans maintenant, et j’ai eu l’idée de cette méthode lorsque j’ai remarqué que différents protocoles d’isolement entraînaient différents modèles d’activation cellulaire. Mme Santana-Magal, qui est étudiante aux cycles supérieurs dans mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Après avoir euthanasié les souris à l’aide de dioxyde de carbone à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire, extrayez les tumeurs et placez-les dans un milieu RPMI sans sérum fœtal bovin. Ensuite, utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper la tumeur en petits morceaux. Transférez tous les morceaux tumoraux d’une seule souris dans un tube à fond plat de 30 millilitres contenant un tampon HBSS complété par de la collagénase IV et de la DNase I ainsi que les barres d’agitation magnétiques.

Incuber le tube avec les morceaux de tumeur sur un agitateur à 37 degrés Celsius avec un agitateur magnétique à l’intérieur à 200 à 400 tours par minute pendant 20 à 30 minutes. Ensuite, filtrez les cellules à travers une crépine de 70 micromètres. Ensuite, centrifugez les cellules à 400 fois g pendant cinq à 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Après la centrifugation, ajoutez 1,5 millilitre de solution mère de milieu à gradient de densité à 8,5 millilitres de HBSS. Ensuite, mélangez vigoureusement le milieu à gradient de densité. Ensuite, pipetez le mélange sur la pastille.

Centrifugez la suspension cellulaire à 400 fois g pendant 20 minutes à température ambiante. Décanter le surnageant une fois la centrifugation terminée. Après avoir lavé les cellules granulées deux fois, mettez-les en suspension dans un millilitre de tampon d’isolement.

Ajoutez la suspension cellulaire à 30 microlitres de billes magnétiques conjuguées CD11b. Ensuite, incubez le mélange à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Après la centrifugation, retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans un millilitre de tampon d’isolement.

Appliquez la suspension cellulaire sur une colonne magnétique prélavée. Ensuite, utilisez trois millilitres de tampon d’isolement pour laver la colonne deux fois. Ensuite, retirez la colonne de l’aimant.

Ensuite, ajoutez six millilitres de tampon d’isolement dans la colonne. Poussez avec un piston pour rincer les cellules marquées magnétiquement dans un tube de collecte stérile. Encore une fois, centrifugez les cellules à 400 fois g pendant cinq à 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Après avoir remis en suspension et coloré les cellules, triez les cellules en bloquant les petites cellules, en utilisant une petite dispersion latérale et une petite dispersion vers l’avant. Après avoir euthanasié la souris, vaporisez 70 % d’éthanol dessus. Ensuite, utilisez des ciseaux chirurgicaux pour retirer la peau recouvrant le cœur sous le capuchon laminaire.

Ensuite, nettoyez les ciseaux avec de l’éthanol. Lavez la cavité avec de l’EDTA HBSS de 20 millimolaires et utilisez les ciseaux pour couper l’oreillette droite du cœur. Ensuite, utilisez une seringue de 10 millilitres avec une aiguille de calibre 25 pour rincer lentement le ventricule droit du cœur avec de l’EDTA HBSS de 20 millimolaires.

Ensuite, utilisez une seringue stérile pour prélever du sang de la cavité pleurale. Transférez le sang dans un tube contenant du sulfate d’héparane et de l’EDTA. Ensuite, pipetez le sang sur le milieu à gradient de densité.

Centrifuger les cellules sanguines à 400 fois g pendant 15 minutes à température ambiante avec un frein faible. Après la centrifugation, collectez les cellules mononucléées dans un tube. Dissoudre les cellules dans 10 millilitres de tampon d’isolement pour laver les cellules.

Encore une fois, centrifugez les cellules à 400 fois g pendant cinq à 10 minutes à quatre degrés Celsius. Pour sélectionner les cellules CD11b, remettez la pastille de cellule en suspension dans un millilitre de tampon d’isolement. Incuber pendant 15 minutes avec 50 microlitres de billes magnétiques conjuguées CD11b à quatre degrés Celsius.

Recentrifuger à 400 fois g pendant cinq à 10 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, retirez le surnageant. Remettez la pastille en suspension dans un millilitre de tampon d’isolement.

Ensuite, appliquez la suspension cellulaire sur une colonne magnétique prélavée. Lavez la colonne avec un tampon d’isolement deux fois. Retirez la colonne de l’aimant et ajoutez six millilitres de tampon d’isolement sur la colonne.

Ensuite, rincez les cellules marquées magnétiquement dans un tube de collecte stérile en poussant le piston. Centrifugez les cellules à 400 fois g pendant cinq à 10 minutes à quatre degrés Celsius. Remettez les cellules en suspension dans un tampon d’isolement et colorez-les avec des anticorps conjugués aux fluorophores.

Triez les cellules en bloquant les petites cellules à l’aide d’une petite dispersion latérale et d’une petite dispersion vers l’avant. Tout d’abord, fixez les cellules dans du paraformaldéhyde tamponné à 1,8 % pendant 10 minutes à température ambiante. Ensemencez la suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque en forme de U à 96 puits.

Ensuite, ajoutez des dilutions variables d’anticorps de liaison tumorale dans chaque puits. Par la suite, incubez les cellules sur de la glace pendant 15 à 20 minutes. Après l’incubation, lavez les cellules avec 150 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate.

Ensuite, centrifugez à 400 fois g pendant cinq à 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, expulsez le surnageant et lavez les cellules deux fois. Dissoudre les cellules dans 100 microlitres de tampon FACS contenant des anticorps secondaires conjugués aux fluorophores.

Ensuite, incubez l’assiette sur de la glace pendant 15 à 20 minutes. Après 15 à 20 minutes, ajoutez 200 microlitres de tampon FACS pour laver les cellules. Centrifugez la plaque à 400 fois g pendant cinq à 10 minutes.

Décanter le surnageant. Effectuez une cytométrie en flux pour analyser la liaison tumorale et déterminer la concentration minimale d’immunoglobuline G nécessaire pour enrober les cellules. Une fois que les cellules sont enrobées d’une concentration minimale d’immunoglobuline G, ajoutez le complexe immunitaire tumoral marqué CFSE aux cellules dendritiques dérivées des monocytes dans un rapport de un à cinq.

Ensuite, incubez le mélange pendant 12 à 16 heures toute la nuit dans un milieu complet. Effectuer une analyse FACS de l’activation des cellules dendritiques dérivées de monocytes. L’intensité moyenne de fluorescence est calculée à la suite d’une analyse cytométrique en flux pour étudier la présence d’anticorps IgG et M qui se lient aux cellules tumorales LMP ex vivo.

Les résultats montrent que les anticorps IgG des souris allogéniques C57-Black/6 se lient aux cellules tumorales beaucoup plus fortement que les anticorps des souris syngéniques 129S1. Ensuite, l’intensité moyenne de fluorescence de la capacité de liaison des cellules tumorales B16F10 avec les IgG est calculée. Les IgG obtenues à partir de souris allogéniques 129S1 présentent une intensité de coloration 10 fois plus élevée avec la tumeur B16F10 par rapport aux IgG syngéniques des souris C57-Black/6.

Ensuite, des images microscopiques DIC sont capturées pour montrer les cellules dendritiques dérivées des monocytes associées à la tumeur des tumeurs B16F10. Ici, des images DIC sont capturées pour montrer les cellules dendritiques dérivées de monocytes inflammatoires et patrouillantes isolées du sang de souris porteuses de tumeurs B16F10. Une analyse cytométrique en flux est également effectuée pour comparer les modèles d’activation des cellules dendritiques dérivées de monocytes de la rate et de la moelle osseuse avec ceux de la tumeur et du sang lors de l’incubation avec le complexe immunitaire.

Le résultat montre une augmentation de l’expression de CD86 et du CMH II par la moelle osseuse et les cellules dendritiques spléniques avec les complexes immuns. Ensuite, une immunohistochimie confocale est effectuée, qui montre l’absorption tumorale et l’expression du CMH II lorsque les cellules dendritiques sont incubées avec le complexe immunitaire tumoral marqué au CFSE. Une fois maîtrisée, cette procédure peut être effectuée en quelques heures en fonction du nombre de souris que vous utilisez.

Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier de garder tous vos réactifs et outils stériles à tout moment. La fourrure de souris est une source majeure de contamination. Assurez-vous qu’aucun des poils ne touche vos tissus.

Nous espérons qu’après avoir regardé cette vidéo, vous aurez une bonne compréhension de la façon d’isoler les CD dérivés des monocytes du sang et des tumeurs de souris et de les activer par la suite avec des cellules immunitaires complexes tout en évitant leur activation prématurée.