Génération de Immature, d'âge mûr et tolérogène cellules dendritiques avec Metabolic Différentes phénotypes

L’objectif global de ce protocole est de générer des cellules dendritiques tolérogènes et matures à partir de monocytes à des fins d’expérimentation ou de développement de vaccins. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie en fournissant un modèle pour étudier le développement, la maturation et la présentation de l’antigène des cellules dendritiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de générer un grand nombre de cellules dendritiques in vitro pour l’expérimentation.

Commencez l’enrichissement en monocytes en mélangeant 20 microlitres de cellules mononucléales de sang périphérique préalablement préparées, ou une suspension de cellules PBMC avec 20 microlitres de bleu de tripan, pour compter le nombre de cellules vivantes à l’aide d’un cytomètre. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire. Aspirez complètement le surnageant et mettez à nouveau en suspension la pastille cellulaire à une concentration de 80 microlitres de tampon de coloration pour 10 à sept cellules.

Ajoutez 20 microlitres de microbilles CD-4 pour 10 aux septièmes cellules. Mélangez bien et incubez les cellules pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Lavez les cellules avec un millilitre de tampon de coloration pour 10 à la septième cellule, puis centrifugez les cellules.

Aspirez complètement le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire. Obtenez une colonne moyenne pour un maximum de deux fois 10 puissance huit cellules totales, et placez la colonne dans le champ magnétique du séparateur. Ensuite, rincez la colonne avec 500 microlitres de tampon de coloration.

Pipetez la suspension cellulaire sur la colonne et collectez les cellules non marquées qui traversent la colonne dans un tube de 15 millilitres. Remplacez un nouveau tube de 15 millilitres sous la colonne et lavez la colonne trois fois avec 500 microlitres de tampon de coloration. Assurez-vous que le réservoir de la colonne est vide avant d’ajouter un nouveau tampon de coloration entre les lavages.

Retirez la colonne du séparateur et placez-la sur un tube frais de 15 millilitres. Pipetez un millilitre de tampon de coloration sur la colonne et rincez immédiatement les cellules marquées magnétiquement en poussant fermement le piston dans la colonne. Ensuite, répétez les étapes de séparation magnétique en utilisant la fraction illudée dans une nouvelle colonne pour augmenter la pureté des cellules CD14 plus.

Semez quatre séries de monocytes CD14 plus à une concentration de zéro virgule trois à zéro point cinq fois 10 à six par millilitre de milieu de culture cellulaire d’IL-4 dans six plaques à puits. Incuber les cellules dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de CO2. Le quatrième jour, retirez 850 microlitres de milieu de la culture et centrifugez.

Aspirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de milieu de culture cellulaire. Remettez le mélange cellulaire dans la culture. Le cinquième jour, ajoutez un microlitre de vitamine D3 et un microlitre de dexaméthazone par litre de milieu à deux des ensembles, pour générer des moDC tolérogènes.

Le sixième jour, ajoutez 200 nanogrammes par millilitre de GMCSF et 200 nanogrammes par millilitre d’IL-4 à tous les ensembles. Ajoutez un microgramme par millilitre de LPS à l’un des ensembles traités uniquement avec du GMCSF et de l’IL-4 pour générer des moDC matures. Ajoutez un microgramme par millilitre de LPS à un ensemble de moDC tolérogènes pour générer des moDC tolérogènes LPS.

Enfin, le septième jour, récoltez les différents types de moDC en rinçant la boîte de culture avec PVS EDTA. Les moDC immatures ont été générés en ajoutant du GMCSF et de l’IL-4 à du CD-14 purifié et des monocytes aux jours zéro, quatre et six. L’ajout de vitamine D3 et de dexaméthazone après l’administration de GMCF et d’IL-4 a entraîné la différenciation des moDC immatures en moDC tolérogènes.

Le LPS a été ajouté pour induire la maturation des moDC immatures en moDC matures. Et les moDC tolérogènes ont été stimulés avec du LPS pour vérifier la résistance à la maturation. Une analyse des marqueurs de surface DC a révélé que les moDC matures expriment les niveaux les plus élevés de marqueurs de maturation HLA-DR, CD80, CD83 et CD86.

À l’inverse, les moDC tolérogènes ont montré une expression accrue de CD14, BDCA3 et de transcrits de type immunoglobuline par rapport aux moDC immatures et matures. En utilisant des CMXRos rouges pour refléter l’activité mytocondriale, on a observé que les moDC tolérogènes avaient une activité mytocondriale plus élevée par rapport aux autres sous-types de moDC différenciés. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunologie pour explorer les caractéristiques métaboliques des cellules dendritiques pour le développement de vaccins et d’immunothérapie.