Name: Génération de Immature, dâge mûr et tolérogène cellules dendritiques avec Metabolic Différentes phénotypes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Apprenez à générer des cellules dendritiques immatures, matures et tolérogènes à partir de monocytes avec des profils métaboliques distincts. Cette méthode permet d'étudier la différenciation et la présentation d'antigènes pour la recherche en immunologie.

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Le présent document décrit une méthode pour générer à partir de monocytes moDCs immatures, moDCs tolérogènes et moDCs matures. Les étapes importantes dans ce protocole sont discutés en détail dans les paragraphes suivants. Il est important de noter que le sang périphérique humain est utilisé comme matériau de départ dans ce protocole et les précautions universelles pour le traitement du sang humain doit être pratiquée. Bien qu&#39;il soit techniquement possible d&#39;obtenir des DC à partir de la moelle osseuse chez l&#39; homme 24, la différenciation DC in vitro à partir de cellules présentes dans le sang périphérique est préféré en raison de la disponibilité du sang périphérique par rapport à la moelle osseuse. Parmi les cellules présentes dans le sang périphérique, les cellules CD34 + et les monocytes souches hématopoïétiques sont couramment utilisés pour la production in vitro de DC. Hématopoïétique CD34 + des cellules souches sont cultivées avec du GM-CSF et du TNF-α pour obtenir des sous - ensembles et CD1a + CD14 + , qui sont ensuite différenciés en outre Langerhanscomme les cellules et les cellules dendritiques. A l&#39;inverse, les monocytes sont cultivés dans du GM-CSF et IL-4 pour générer moDCs immatures. Plusieurs protocoles sont utilisés pour l&#39;enrichissement de monocytes du sang périphérique; par exemple, par l&#39; adhésion à des plats en plastique, élutriation et kits d&#39;isolement 25, 26 Les avantages du protocole d&#39;adhésion sont un minimum de dommages aux cellules et relativement rentables cependant cellule de pureté peut être compromise. et une étape supplémentaire est nécessaire pour détacher les cellules pour les expériences ultérieures. Élutriation est une technique qui sépare les cellules en fonction de leur taille et de la densité. Les avantages de l&#39;élutriation sont la viabilité cellulaire et les monocytes peuvent être facilement utilisées pour d&#39;autres expériences; Cependant cette technique est limitée par la disponibilité d&#39;un élutriateur et l&#39;impossibilité de séparer les différentes populations de cellules (cellules T et les monocytes) avec des paramètres de sédimentation similaires. Commercialement kits d&#39;isolement disponibles utilisent microbilles magnétiques pour sélectionner soit positivement ousélectionner négativement la population monocytaire. Certains protocoles sont biaisés vers l&#39;isolement des monocytes en utilisant la sélection négative que les monocytes isolés restent «intactes» (non lié par des marqueurs ou des microbilles). Dans ce protocole, perles CD14 ont été utilisés pour sélectionner les monocytes humains positifs de CMSP. CD14 manque un domaine cytoplasmique et liaison de l&#39;anticorps à CD14 ne déclenche pas la transduction du signal. En outre, les microbilles se détacher de monocytes après la culture et, partant, ne gêne pas le processus de différenciation. En outre, le CD14 est fortement exprimé sur la plupart des monocytes et faiblement sur ​​les neutrophiles et certaines cellules dendritiques myéloïdes, par conséquent , cette méthode d&#39;isolement des résultats de pureté cellulaire plus élevée que les autres méthodes 17. monocytes sanguins peuvent être différenciés en DC ou les macrophages et le sort des monocytes dépend grandement de l&#39;environnement de cytokine. Dans cet article, moDCs sont générées en ajoutant des facteurs de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) Et l&#39;interleukine 4 (IL-4), les monocytes du sang périphérique humain. GM-CSF est nécessaire pour la survie des monocytes et IL-4 exerce une activité inhibitrice sur la différenciation des macrophages; et l&#39;addition de GM-combinatoire SCSF et l&#39; IL-4 , les monocytes produisent un pourcentage plus élevé de moDCs immatures par rapport à des cytokines individuelles 27. Il existe d&#39; autres protocoles qui génèrent moDCs en y ajoutant le facteur alpha de nécrose tumorale (TNF-α), l&#39; interféron alpha (IFN-α) et l&#39; interleukine 13 (IL-13) , les monocytes du sang périphérique 28, 29, 30. La combinaison de GM-CSF et de l&#39;IL-4 a été optimisé dans les années 1990 et maintenant un protocole accepté qui génère DC immatures en plastique différenciées en moDCs immunogènes ou tolérogènes et polarisés en Th1, Th2 ou Th17 promotion moDCs. moDCs immatures sont différenciées en moDCs tolérogènes par l&#39;addition de la vitamine D3 et la dexaméthasone. Il existe plusieurs protocoles pour générer des DC tolérogènes par exemple, par l&#39;intermédiairefacteur nucléaire kappa B (NF-kB) , l&#39; inhibition de l&#39;activation β-caténine, la vitamine D3, la dexaméthasone et la rapamycine 31, 32, 33, 34, 35, 9, 36, 37. Bien que la vitamine D3 et la dexaméthasone seule ont été rapportés pour induire un effet tolérogène sur les DC, la combinaison de la vitamine D3 et le résultat de la dexaméthasone dans une plus grande suppression de la alloproliferation que lorsque des médicaments individuels sont utilisés. Par conséquent, le protocole actuel pour la production de DCs tolérogène a été modifié pour une combinaison de vitamine D3 et la dexaméthasone. Cette méthode est actuellement acceptée comme un modèle pour les PED tolérogènes humaines avec une utilité thérapeutique. Il est également important de noter que la vitamine D3 reconstituée et la dexaméthasone ont une courte durée de conservation. Dans ce protocole, les lipopolysaccharides (LPS) a été ajouté sous la forme d&#39;une maturation de l&#39;inducteur à courant continu. moDCs Immature peuvent également être amenés à maturation en utilisant un cocktail pro-inflammatoire:(TNF-α), l&#39;interleukine 1 bêta (IL-1β), interleukine 6 (IL-6) et de la prostaglandine E2) ou des cytokines pro-inflammatoires (TNF-a et l&#39;interféron gamma (IFN-Γ)). Cocktail Pro-inflammatoire génère moDCs matures avec des fonctions de haute co-stimulateurs et migrateurs , mais ils produisent des niveaux relativement faibles de l&#39; IL-12 38. TNF-α ou IFN-Γ est seul pas capable d&#39;induire un phénotype dendritique stable 39. LPS stimule le récepteur Toll-like 4 (TLR4), médie l&#39;activation de NF-kB et mitogen activated protein kinases (MAPK) pour induire la maturation des DC. DC maturation induite par le LPS présente une régulation positive de courant continu des marqueurs de maturation (CD83, CD86, HLA-DR), et a également conduit à la production d&#39;IL-12p70. En outre, cette étape peut encore être modifié pour coupler LPS avec des agonistes de TLR3 pour produire les CD matures pour les vaccins cliniques sur le cancer. Dans cet article, les DC tolérogènes sont présentés pour être résistant à la maturation lors du traitement LPS. Ces semi-matures comme les PED ne sont pas immunogènes et ne le font pas releasoi cytokines pro-inflammatoires 40. Les limitations de ce protocole réside dans le processus de différenciation. Le processus prend 8 jours à partir du jour 0 au jour 7 qui pose une difficulté à être adapté en analyse à haut débit. Une modification dans le protocole est nécessaire de raccourcir le processus de différenciation encore produire un nombre élevé de pays en développement viables dans les différents Etats. Deuxièmement, les pays en développement sont générés par addition de cytokines dans ce protocole et ces cytokines ne soutiennent pas la population continue pendant une longue période de temps. De plus, les cytokines sont utilisés à des concentrations beaucoup plus élevées que in vivo et pourrait se traduire par le développement biaisée des voies qui ne sont pas physiologiquement identiques aux CD in vivo. Il a été démontré par exemple dans des cultures in vitro de précurseurs de DC pour répondre à GM-CSF, qui est une cytokine pas essentiel pour la différenciation in vivo normale DC 41. Cependant, la stimulation de cytokines peut être un procédé utile pour le gèneévaluer un grand nombre de DC in vitro pour l&#39; expérimentation. La capacité de soumettre ces cellules générées par ce protocole à d&#39;autres analyses telles que l&#39;immunofluorescence, par cytométrie de flux, allo études de réaction et d&#39;études métaboliques augmente l&#39;utilité de cette méthode. Ces DC in vitro servent comme un bon modèle pour améliorer la connaissance du développement continu, la maturation et la présentation de l&#39; antigène qui est déjà difficile à faire avec les numéros rares DC in vivo. La capacité des PED à réguler l&#39; immunité immunologique par rapport à la tolérance en fait des candidats intéressants en thérapeutique contre le cancer et les maladies auto - immunes 42, 43, 44, 45. DC immunogènes générés dans ce protocole peuvent être utilisés pour améliorer l&#39;efficacité de vaccination contre les maladies infectieuses et les tumeurs; tandis que les DC tolérogènes peuvent être utilisés pour contrôler les réponses des cellules T non désirées et de prévenir le rejet après transplantation. Le complexeéquilibre entre l&#39;immunité et la tolérance dépend énormément sur DC état de différenciation. différenciation DC est un programme cellulaire coordonné qui est régi par de multiples voies de signalisation et devenir métabolique. Différents états de différenciation des DC diffèrent des besoins bioénergétiques et la biosynthèse; par exemple, les DC activées nécessitent des adaptations métaboliques plus énergiques importantes pour la survie et la migration par rapport aux pays en développement à l&#39;état de repos. Il est important de noter que la vitamine D3, la dexaméthasone et la rapamycine sont connus pour leur capacité à induire des DC tolérogènes, ont été décrits pour influencer le métabolisme continu. Dans cet article, le métabolisme énergétique de moDCs de différents états de différenciation ont été caractérisés au moyen d&#39;analyseurs de flux extracellulaire et moDCs tolérogènes présentait la maturation la plus haute plasticité métabolique et induite par le LPS a diminué cette plasticité. Métabolisme Anabolic soutient les PED maturation tandis que les influences du métabolisme cataboliques tolérogène DC fonctionne 46. Les PEDproduite à partir de ce protocole peut être utilisé pour déterminer si la modification de l&#39;état métabolique des PED détiennent la clé de la modification de l&#39;immunité et de la tolérance en thérapeutique. En conclusion, nous avons présenté un protocole pour la génération d&#39;immature, tolérogène et moDCs matures crucial pour l&#39;étude des fonctions immunorégulatrices de PED.

DC a été décrite par Paul Langerhans (cellules de Langerhans) à la fin du XIXe siècle comme référencé par Jolles 1 et caractérisé par Ralph Steinman et Zanvil Cohn en 1973 qui les a reconnus comme des cellules présentatrices d&#39;antigène professionnelles 2. DCs sont présents dans le sang périphérique et dans la plupart des tissus du corps, particulièrement abondantes dans les tissus qui sont exposés à l&#39;environnement extérieur tels que la peau (présent sous forme de cellules de Langerhans) et dans les garnitures du nez, des poumons, de l&#39;estomac et les intestins qui permettent qu&#39;ils rencontrent des antigènes extrinsèques. Immature PED ont la capacité d&#39; endocytose mais relativement faible capacité à stimuler les cellules T 3. Immature DC expriment différents récepteurs de reconnaissance des formes (PRR) que les modèles de capture des pathogènes associés moléculaires (PAMP) ou des motifs moléculaires dommages-associés (Damps) 4. signaux de danger Activation voiture maturation vers les PED immunogènes alors auto-molécules entraînent T unresponsivene cellulairess et de l&#39; apoptose 5. DCs immunogènes sont caractérisés par la surexpression de molécules du CMH et des molécules de surface co-stimulatrices et leur capacité de premiers lymphocytes T naïfs 6,7. Immature PED peut également être mûri vers un état ​​Treg induisant ou tolérogène en réponse à la vitamine D3 métabolite 1a, 25 (O) 2 D 3 et certains agents immunosuppresseurs comme l&#39; interleukine-10 (IL-10), la dexaméthasone et la rapamycine 8-9. Les DC tolérogènes sont caractérisées par leur expression de motifs inhibiteurs à base de tyrosine d&#39;immunorécepteur (ITIM) contenant des récepteurs de surface et des ligands. Signal transduction de ITIM contenant des membres de la famille ILT, ILT3 et ILT4 dans les PED tolérogènes inhibent alloproliferation et conduire Foxp3 + Treg extension 10,11. Ces propriétés uniques des DCs tolérogènes conduisent à leur profonde activité in vivo, à savoir la capacité d&#39;induire une tolérance robuste aux greffes allogéniques transplantées et supprEss le développement de maladies auto-immunes. Tolérogène DCs peut être considérée par conséquent comme un sous-type de polarisation DC matures qui fonctionnent dans l&#39;inhibition de l&#39;activation immunitaire. À l&#39; heure actuelle, il existe deux sous - ensembles généraux de cellules dendritiques dans le sang périphérique humain: DC plasmacytoïdes et DC myéloïdes 12. DC circulantes sont constituant rare à moins de 2% de leucocytes dans le sang humain et cela pose une difficulté à l&#39;isolement d&#39;un nombre approprié de pays en développement pour étudier leurs fonctions immunorégulatrices. Pour surmonter ce problème, les monocytes différenciés DCs sont utilisées comme modèle in vitro pour l&#39;étude de la fonction des cellules dendritiques. Ces DC in vitro ont des récepteurs et des fonctions similaires par rapport aux CD in vivo. Comparaison détaillée des in vivo PED et dérivés de monocytes DC in vitro (généré de moDCs) sont étudiés par d&#39; autres laboratoires 13, 14, 15. Il est également rapporté que moDCs et CD1c + DC étaient équivalentes à l&#39; antigène présentant et en induisant la fonction des cellules T 15. Dans cet article, nous décrivons une méthode de génération de moDCs immatures de monocytes du sang périphérique, puis de les différencier en DC immunogènes et tolérogènes. Ces cellules dendritiques dérivées de monocytes (moDCs) sont caractérisées par leurs marqueurs de surface, le profil des cytokines immunorégulatrices, des fonctions et états métaboliques. les cellules dendritiques immunogènes et tolérogènes produisent différentes cytokines qui se traduisent par l&#39;expansion des cellules soit T allogéniques ou des cellules T régulatrices. Dans cet article, cytokine profilage est réalisée avec des systèmes utilisant la technologie multiplex. milieu de cellules de croissance sont incubés avec l&#39;anticorps immobilisé code couleur des perles et lire dans un analyseur compact. états métaboliques des PED sont analysés en utilisant des analyseurs de flux extracellulaires qui mesurent le taux d&#39;oxygène de la consommation, un indicateur de la respiration cellulaire, et le taux d&#39;acidification extracellulaire qui reflète la glycolysele flux dans les cellules dendritiques. La mesure de ces taux bioénergétiques fournit un moyen de suivre les changements dans le métabolisme cellulaire qui sont essentiels dans le développement des cellules dendritiques et de la fonction.

<table><tbody><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td> Seringue <td>d’isolement PBMC</td></tr><tr><td></td><td>Becton, Dickinson</td><td>302832</td><td>Isolation PBMC</td></tr><tr><td>Tube à centrifuger de 1,5 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>Isolation PBMC</td></tr><tr><td>de 15 ml Falcon</td><td></td><td>352096</td><td>d’isolement PBMC</td></tr><tr><td>Tube de 50 ml Falcon</td><td></td><td>352070</td><td>Isolation PBMC</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>PBMC</td></tr><tr><td>isolation 0.2 &micro ; m filter</td><td>Sartorius stedim biotech</td><td>17597</td><td>PBMC</td></tr><tr><td>isolation MACs kit</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-042-201</td><td>Enrichissement en monocytes</td></tr><tr><td>Séparateur MiniMACS</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-042-102</td><td>Enrichissement en monocytes</td></tr><tr><td>Eau de qualité culture cellulaire</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td></td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30070103</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15140</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Phosphate Saline tamponnée</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>10010-031</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>11140-040</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15575</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>11360-070</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-093-868</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-093-924</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Vitamine D3</td><td>Sigma</td><td>D1530</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Sigma</td><td>D2915</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma</td><td>l2755</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>trypan blue</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>PerCP-conjuguée HLADR&nbsp ;</td><td>BioLegend</td><td>307628</td><td>Cytométrie</td></tr><tr><td>CD80 conjuguée</td><td>PE BD Biosciences</td><td>557227</td><td>Cytométrie</td></tr><tr><td>CD83 conjuguée PE&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>556855</td><td>Cytométrie</td></tr><tr><td>CD86 conjuguée à PE&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>555665</td><td>Cytométrie</td></tr><tr><td>CD11c conjugué à l’APC</td><td>BD Biosciences</td><td>340544</td><td>Cytométrie</td></tr><tr><td>CD14 conjugué à la PE&nbsp ;</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-091-242</td><td>Cytométrie</td></tr><tr><td>conjuguée PE BDCA3&nbsp ;</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-090-514</td><td>Cytométrie</td></tr><tr><td>ILT3 conjuguée à l’APC&nbsp ;</td><td>eBioscience</td><td>12-5139-73</td><td></td></tr><tr><td>Cytométrie Isotype apparié PerCP- conjugué Mab</td><td>BioLegend</td><td>400250</td><td>Cytométrie</td></tr><tr><td>Isotype apparié PE- conjugué Mab</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-091-835</td><td>Cytométrie</td></tr><tr><td>Isotype apparié APC conjugué Mab</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-091-836</td><td>Cytométrie</td></tr><tr><td>BD LSR II Cytomètre en flux</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD LSR II&nbsp ;</td><td>Cytométrie</td></tr><tr><td>cytofix/cytoperm</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>Cytométrie</td></tr><tr><td>CD25 conjugué APC/CY7</td><td>BD pharmingen</td><td>557753</td><td>Cytométrie</td></tr><tr><td>CD4 conjugué PE/CY7</td><td>Biolegend</td><td>300512</td><td>Cytométrie</td></tr><tr><td>CD3 conjugué PerCP</td><td></td><td>300428</td><td>Cytométrie</td></tr><tr><td>EasySep Kit d’enrichissement des lymphocytes T CD4+ humains</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19052</td><td>Etude d’alloréaction</td></tr><tr><td>Aimant EasySep&nbsp ;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18000</td><td>Etude d’alloréaction</td></tr><tr><td>Trace cellulaire Kit de prolifération cellulaire CFSE</td><td>Sondes moléculaires</td><td>C34554</td><td>Etude d’alloréaction</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>14025092</td><td>Etude d’alloréaction</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Conjugué FoxP3</td><td>BD Biosciences</td><td>560889</td><td></td></tr><tr><td>Milliplex MAP Humain Cytokine/Chemokine panneau à billes magnétiques</td><td>Millipore</td><td>HCYTOMAG-60K</td><td>Analyse des cytokines</td></tr><tr><td>5 ml Tube en polystyrène</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td>Analyse des cytokines</td></tr><tr><td>Luminex Sheath Fluid&nbsp ;</td><td>Millipore</td><td>SHEATHFLUID</td><td>Analyse des cytokines</td></tr><tr><td>Système FLEXMAP 3D avec logiciel xPONENT</td><td>Luminex Corporation</td><td>FLEXMAP 3D</td><td>Analyse des cytokines</td></tr><tr><td>MitoTracker Red CMXRos</td><td>Cell Signalling</td><td>9082</td><td>Activité mitochondriale</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td>Activité mitochondriale</td></tr><tr><td>XF Assay Medium (OCR)</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102352-000</td><td>Adaptation métabolique</td></tr><tr><td>Glucose&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8769</td><td>Adaptation métabolique</td></tr><tr><td>XF Base Medium (ECAR)</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102353-100</td><td>Adaptation métabolique</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Adaptation métabolique</td></tr><tr><td>Calibrant</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100840-000&nbsp ;</td><td>Adaptation métabolique</td></tr><tr><td>XF Cell Mito Stress kit</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>103015-100</td><td>Adaptation métabolique</td></tr><tr><td>XF Glycolysis Stress kit</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>103020-100</td><td>Adaptation métabolique</td></tr><tr><td>Seahorse&nbsp ;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>XFe96</td><td>Adaptation métabolique</td></tr></tbody></table>

génération de immature, d&#39;âge mûr et tolérogène cellules dendritiques avec metabolic différentes phénotypes

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Résultats de la réponse immunitaire d&#39;une interaction complexe entre le système immunitaire inné antigène non spécifique et le système immunitaire adaptatif de l&#39;antigène spécifique. Le système immunitaire est un équilibre constant dans le maintien de la tolérance aux auto-molécules et de réagir rapidement aux agents pathogènes. Les cellules dendritiques (CD) sont puissantes cellules présentatrices d&#39;antigène professionnelles qui lient le système immunitaire inné pour le système immunitaire adaptatif et équilibrent la réponse adaptative entre le soi et le non-soi. En fonction des signaux de maturation, les cellules dendritiques immatures peuvent être stimulés sélectivement pour se différencier en DCs immunogènes ou tolérogènes. les cellules dendritiques immunogéniques fournissent des signaux de prolifération de cellules T spécifiques de l&#39;antigène pour l&#39;expansion clonale; tandis que les cellules dendritiques tolérogènes régulent la tolérance par la suppression des cellules T spécifiques de l&#39;antigène ou de l&#39;expansion clonale des cellules T régulatrices. En raison de cette propriété unique, les cellules dendritiques sont très recherchés en tant qu&#39;agents thérapeutiques pour le cancer et papille auto-immuneases. Les cellules dendritiques peuvent être chargées avec des antigènes spécifiques in vitro et injectés dans le corps humain pour produire une réponse immunitaire spécifique à la fois immunogène et tolérogène. Ce travail présente un moyen pour générer in vitro à partir de monocytes, les cellules dendritiques immatures monocytes dérivés (moDCs), tolérogène et moDCs matures qui diffèrent dans l&#39; expression des marqueurs de surface, la fonction et les phénotypes métaboliques.

Purification de monocytes et de cellules dendritiques Différenciation Les monocytes ont été purifiés à partir de PBMC par la densité centrifugation du sang périphérique (figure 1A), suivie CD14 + séparation de sélection positive magnétique (figure 1B) et mis en culture dans un milieu complet en présence de GM-CSF et IL-4 pour obtenir des cellules dendritiques immatures ( La figure 2A). L&#39; addition de la vitamine D3 et la déxaméthasone après le GM-CSF et IL-4 a donné lieu à la différenciation des moDCs immatures dans moDCs tolérogènes (figure 2B). LPS a été ajouté pour induire la maturation des moDCs immatures à mûrir moDCs (figure 2C) et moDCs tolérogènes ont été stimulées avec du LPS pour vérifier la résistance à la maturation (figure 2D). Les échantillons de sang utilisés dans ce travail ont été obtenus à partir de donneurs sains avec précédente informésconsentement. MODC Caractérisation Surface Marker Caractérisation par cytométrie de flux L&#39; analyse des marqueurs de surface DC a montré que moDCs matures ont exprimé les plus hauts niveaux de marqueurs de maturation HLA-DR, CD83 et CD86 par rapport à moDCs tolérogènes LPS-traités, moDCs tolérogènes et moDCs immatures (figure 3). Ces résultats démontrent que tolérogènes moDCs étaient résistants à la maturation par rapport à moDCs immatures après stimulation par le LPS. En outre, le LPS traité moDCs tolérogènes et moDCs tolérogènes affiché une expression accrue de CD14, BDCA3 (CD141) et la transcription Immunoglobulin-like (ILT) 3 par rapport à moDCs immatures et matures. Les moDCs tolérogènes que nous avons généré ici est compatible avec les rapports précédents 23. Caractérisation fonctionnelle de moDCs moDCs induites par la maturation deviennent immunogènes et libèrent des cytokines qui favorisent la prolifération des lymphocytes T CD4 +. Nous avons évalué l&#39;immunogénicité des sous-types différents MODC en mesurant la prolifération des lymphocytes T co-cultivées. MoDCs tolérogènes sont médiocrement immunogène par rapport à moDCs matures, comme le montre la faible alloproliferation des lymphocytes T CD4 + (figure 4A). MoDCs tolérogènes sont caractérisés par leur faible IFN-Γ faible d&#39; IL-12p40 et IL-10 à haute production de cytokines dans alloreaction co-cultures avec des lymphocytes T CD4 + (figure 4B). En outre, les cellules T allospécifiques augmentant le nombre de moDCs tolérogènes en co-cultures de moDCs matures induite CD4 + a augmenté la fréquence des cellules T CD25 haute Foxp3 + réglementaires (Figure 4C). <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Analyse de l&#39; activité mitochondriale Red CMXRos est utilisé pour refléter l&#39;activité mitochondriale pour analyser les niveaux de potentiel de membrane mitochondriale dans moDCs. MoDCs tolérogènes ont observé que l&#39; activité mitochondriale plus élevée par rapport aux autres sous - types MODC différenciés (figure 5A). Ensuite, le taux de consommation d&#39;oxygène des mitochondries (ROC) est évaluée pour les différents sous-types MODC en utilisant un bioanalyseur. mesures OCR permettent un aperçu haute résolution du profil métabolique, fournissant des informations, y compris mais sans s&#39;y limiter à la respiration basale, la capacité respiratoire de secours, fuite de protons et de la respiration non-mitochondrial. La mesure de l&#39;OCR fournit un moyen pour évaluer la capacité des cellules à répondre à un stress. Les cellules sont métaboliquement perturbés par l&#39;addition de trois composés différents en succession. La première injection est Oligomycin (ATP Coupler) qui inhibe complexe V de la chaîne de transport d&#39;électrons (ETC), l&#39;inhibition de la synthèse d&#39;ATP. Cette étape distingue le pourcentage d&#39;oxygène consommée pour la synthèse de l&#39;ATP et le pourcentage d&#39;oxygène consommée pour vaincre fuite de protons à travers la membrane mitochondriale interne. La deuxième injection est FCCP (ETC accélérateur) qui perturbe la synthèse d&#39;ATP en transportant les ions hydrogène à travers la membrane mitochondriale plutôt que par le canal de protons de V. Complex L&#39;effondrement du potentiel de la membrane mitochondriale conduit à une consommation rapide de l&#39;énergie et de l&#39;oxygène, sans la génération d&#39;ATP. traitement FCCP peut être utilisé pour calculer la capacité respiratoire de secours des cellules. Maintien de la capacité respiratoire de secours dans des conditions de stress est essentielle à la survie des cellules. Cette capacité est déterminée par plusieurs facteurs, y compris la disponibilité du substrat et de la capacité fonctionnelle des enzymes impliquées dans la ETC. La troisième injection est une combinaison de la roténone, une Complex I inhibiteur, et antimycine A, un inhibiteur du complexe III. Cette combinaison arrête la respiration mitochondriale et de l&#39; OCR est observée à diminuer en raison de la fonction mitochondriale altérée (figure 5C). MoDCs tolérogènes affichent des niveaux plus élevés que OCR basales moDCs matures (Figure 5D). En outre, tolérogène, LPS-tolérogène et moDCs immatures a montré une augmentation de la capacité respiratoire de secours par rapport aux moDCs matures (figure 5E). Caractérisation métabolique de moDCs Parce que l&#39; acide lactique et des protons sont libérés des cellules au cours de la glycolyse, nous avons analysé l&#39;activité glycolytique des moDCs en effectuant une analyse en temps réel du taux d&#39;acidification extracellulaire (ECAR) (figure 6B). En présence de glucose, le taux de glycolyse de tous moDCs augmenté par rapport à la phase de base, avecmoDCs matures présentant le taux glycolyse plus élevé que moDCs immatures (Figure 6D). Tolérogène et moDCs immatures présentent glycolyse maximale plus élevée (induite par oligomycine en présence de glucose) par rapport à moDCs LPS traitées (figure 6B). La capacité glycolytique de moDCs tolérogènes et immatures était plus élevé que moDCs matures (Figure 6E). Contrairement à leur taux élevé glycolyse, Réserve glycolyse était le plus bas en moDCs matures (Figure 6F). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig1.jpg" /> Figure 1:. Purification de monocytes du sang périphérique (A) 25 ml de sang est soigneusement étalé sur 15 ml de Ficoll par tube de 50 ml avant centrifugation. Les PBMC sont concentrées dans une couche au- dessous du plasma après centrifugation de densité (B) . Les PBMC sont incubées avec des microbilles qui sont conj<html> ugated à des anticorps monoclonaux CD14 humains (isotype: souris IgG2a). puis chargé sur une colonne qui est placée dans le champ magnétique d&#39;un séparateur pour isoler les monocytes CD14 + <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig2.jpg" /> Figure 2: Caractérisation morphologique de moDCs. (A) 200 ng / ml de GM-CSF et l&#39; IL-4 est ajouté à monocytes CD14 + purifiées au jour 0, 4 et 6 pour générer moDCs immatures; et (B) une étape supplémentaire de stimulation avec 100 nM de vitamine D3 et 10 nM de dexaméthasone au jour 5 génère moDCs tolérogènes. MoDCs Immature et moDCs tolérogènes sont stimulées avec 1 pg / ml de LPS sur Jour 6 pour générer (C) matures moDCs et moDCs (D) LPS-tolérogènes.TTPs: //www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig3.jpg" /> Figure 3:. Surface Marker Caractérisation par cytométrie de flux Les niveaux de marqueurs de surface HLA-DR, CD80, CD83, CD86, CD11, CD14, BDCA3 et LT3 en tolérogène Expression (vert), LPS-tolérogènes (noir), immature (rouge), mature (bleu) moDCs. contrôles isotypiques sont affichés en gris. histogramme individuel pour chaque type de cellule est tracée avec l&#39;axe Y le nombre de cellules en fonction du log de l&#39;axe X de l&#39;intensité du fluorophore et recouvert. Tous les histogrammes sont représentatifs de quatre expériences indépendantes. Ce chiffre a été modifié à partir de J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 Juin, 2015). Reproduit et republié avec la permission du droit d&#39;auteur. Droit d&#39; auteur 2015. L&#39;Association américaine desImmunologistes, Inc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig4.jpg" /> Figure 4: Caractérisation fonctionnelle des moDCs. (A) Quantification de la fréquence de alloproliferation des lymphocytes T CD4 + induites par co-culture avec un nombre croissant de tolérogène (TOL, vert), LPS-tolérogène (L-TOL, noir), immature (IMM, rouge) et matures (MAT ; bleu) moDCs. Les données ont été rassemblées à partir de quatre expériences indépendantes; moyenne + SEM différences statistiques entre tous moDCs contre moDCs matures ont été analysés par ANOVA à deux voies avec Dunnett comparaison multiple post-test. (B) Analyse de la cytokine IFN-Γ (panneau de gauche), IL-12p40 (panneau du milieu) et Il- 10 (volet droitl) dans les surnageants de alloreactions entre les lymphocytes T CD4 + co-cultivées avec un nombre croissant de soit tolérogène (vert), immature (rouge) ou bleu) moDCs (matures. Les données ont été regroupées à partir de six expériences indépendantes; moyenne ± SEM alloproliferation (C) CD4 + T-cellules et les cellules T de régulation d&#39; expansion induite par co-culture avec moDCs matures en présence de nombres de moDCs tolérogènes croissante. Gauche de l&#39; axe Y, la fréquence de cellules CD4 + prolifération des lymphocytes T. Y-axe droit, la fréquence des CD25 haute Foxp3 + cellules gated sur les lymphocytes T prolifératifs CD4 +. Les données ont été regroupées à partir de trois expériences indépendantes; moyenne ± SEM Les différences statistiques entre la présence par rapport à l&#39; absence de moDCs tolérogènes ont été analysés par ANOVA à une voie avec Dunnett comparaison multiple post-test. (D) alloproliferation CD4 + T-cell (gauche) et la fréquence des CD25highFoxP3 cellules + (droite) induite par co- culture avec moDCs tolérogènesen présence d&#39;un nombre croissant de moDCs matures. Les données ont été regroupées à partir de deux ou trois expériences indépendantes; moyenne ± SEM Les différences statistiques entre la présence par rapport à l&#39;absence de moDCs matures ont été analysées par ANOVA à deux voies avec Dunnett comparaison multiple post-test. Ce chiffre a été modifié à partir de J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 Juin, 2015). Reproduit et republié avec le droit d&#39; auteur la permission. Droit d&#39; auteur 2015. L&#39;Association américaine des immunologistes, Inc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig5.jpg" /> Figure 5: Analyse de l&#39; activité mitochondriale de moDCs. (A) Les niveaux de potentiel de la membrane mitochondriale (rouge CMXRos) dans moDCs ont été obtenus en ffaible analyse cytométrique. Les données de quatre expériences indépendantes ont été regroupées. Moyenne ± SEM (B) Représentation schématique d&#39;une respiration mitochondriale en temps réel. analyse ROC à partir de la respiration basale et après l&#39;addition de l&#39;oligomycine (inhibition complexe V), FCCP (respiration maximale induction) et la roténone / antimycine un mélange (chaîne de transport d&#39;électrons inhibition [etc.]). La SRC (basale maximale soustraite de la respiration maximale) mitochondrial est dérivé de la courbe ROC. (C) étude cinétique représentant des mitochondries OCR (pmol / min) dans tolérogène (TOL, vert), LPS-tolérogène (L-TOL, noir) , immature (IMM, rouge) et matures (MAT, bleu) moDCs en utilisant l&#39; addition séquentielle de oligomycine (Olig), FCCP, et roténone / antimycine A (Rot-AA). (D) OCR quantification de la respiration basale de moDCs et ( E) épargnez capacité respiratoire de moDCs. Les données ont été regroupées à partir de cinq expériences indépendantes. Moyenne ± SEM. Ce chiffre a été modifié à partir de J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 Juin, 2015). Reproduit et republié avec le droit d&#39; auteur la permission. Droit d&#39; auteur 2015. L&#39;Association américaine des immunologistes, Inc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig6.jpg" /> Figure 6: Caractérisation métabolique des moDCs. (A) Représentation schématique de la glycolyse en temps réel. Analyse ECAR commence à partir ECAR de base, dans laquelle les cellules ont été incubées dans un milieu exempt de glucose, suivie par l&#39;addition de glucose (glycolyse induction), oligomycine (qui induit la glycolyse cellulaire maximale et l&#39;inhibition complexe V), et enfin 2-désoxy-D- glucose(Inhibition de la glycolyse). Taux glycolytique (glycolyse d&#39;induction soustraite pour ECAR basale), la capacité de la glycolyse (glycolyse maximale soustraite pour basale ECAR), et réserve glycolyse (glycolyse maximal soustrait pour glycolyse induction) sont dérivées de la courbe de ECAR. (B) étude cinétique représentant de la glycolyse dépendante ECAR (mpH / min) dans tolérogène (TOL, vert), LPS-tolérogène (L-TOL, noir), immature (IMM, rouge), et mature (MAT, bleu) moDCs en utilisant l&#39;addition séquentielle de glucose (Gluc), oligomycine (Olig), et 2-DG. (C) les barres indiquent les niveaux de ECAR basales (D) taux glycolyse (E) de la capacité de la glycolyse, et (F) réserve glycolytique de moDCs. Les données ont été regroupées à partir de trois expériences indépendantes; dire 6 SEM. Les différences statistiques ont été analysées par ANOVA à une voie avec un post-test de comparaison multiple de Tukey. Ce chiffre a été modifié à partir de J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 Juin, 2015). Reproduit et republié avec le droit d&#39; auteur la permission. Droit d&#39; auteur 2015. L&#39;Association américaine des immunologistes, Inc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig6large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Les cellules dendritiques immatures peuvent être différenciées sélectivement en cellules dendritiques tolérogènes ou matures pour réguler l’équilibre entre l’immunité et la tolérance. Ce travail présente un moyen de générer à partir de cellules dendritiques (moDC) dérivées de monocytes immatures, des moDC tolérogènes in vitro et matures qui diffèrent par leurs phénotypes métaboliques.

Génération de Immature, d&#39;âge mûr et tolérogène cellules dendritiques avec Metabolic Différentes phénotypes

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

L’objectif global de ce protocole est de générer des cellules dendritiques tolérogènes et matures à partir de monocytes à des fins d’expérimentation ou de développement de vaccins. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie en fournissant un modèle pour étudier le développement, la maturation et la présentation de l’antigène des cellules dendritiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de générer un grand nombre de cellules dendritiques in vitro pour l’expérimentation.Commencez l’enrichissement en monocytes en mélangeant 20 microlitres de cellules mononucléales de sang périphérique préalablement préparées, ou une suspension de cellules PBMC avec 20 microlitres de bleu de tripan, pour compter le nombre de cellules vivantes à l’aide d’un cytomètre. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire. Aspirez complètement le surnageant et mettez à nouveau en suspension la pastille cellulaire à une concentration de 80 microlitres de tampon de coloration pour 10 à sept cellules.Ajoutez 20 microlitres de microbilles CD-4 pour 10 aux septièmes cellules. Mélangez bien et incubez les cellules pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Lavez les cellules avec un millilitre de tampon de coloration pour 10 à la septième cellule, puis centrifugez les cellules.Aspirez complètement le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire. Obtenez une colonne moyenne pour un maximum de deux fois 10 puissance huit cellules totales, et placez la colonne dans le champ magnétique du séparateur. Ensuite, rincez la colonne avec 500 microlitres de tampon de coloration.Pipetez la suspension cellulaire sur la colonne et collectez les cellules non marquées qui traversent la colonne dans un tube de 15 millilitres. Remplacez un nouveau tube de 15 millilitres sous la colonne et lavez la colonne trois fois avec 500 microlitres de tampon de coloration. Assurez-vous que le réservoir de la colonne est vide avant d’ajouter un nouveau tampon de coloration entre les lavages.Retirez la colonne du séparateur et placez-la sur un tube frais de 15 millilitres. Pipetez un millilitre de tampon de coloration sur la colonne et rincez immédiatement les cellules marquées magnétiquement en poussant fermement le piston dans la colonne. Ensuite, répétez les étapes de séparation magnétique en utilisant la fraction illudée dans une nouvelle colonne pour augmenter la pureté des cellules CD14 plus.Semez quatre séries de monocytes CD14 plus à une concentration de zéro virgule trois à zéro point cinq fois 10 à six par millilitre de milieu de culture cellulaire d’IL-4 dans six plaques à puits. Incuber les cellules dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de CO2. Le quatrième jour, retirez 850 microlitres de milieu de la culture et centrifugez.Aspirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de milieu de culture cellulaire. Remettez le mélange cellulaire dans la culture. Le cinquième jour, ajoutez un microlitre de vitamine D3 et un microlitre de dexaméthazone par litre de milieu à deux des ensembles, pour générer des moDC tolérogènes.Le sixième jour, ajoutez 200 nanogrammes par millilitre de GMCSF et 200 nanogrammes par millilitre d’IL-4 à tous les ensembles. Ajoutez un microgramme par millilitre de LPS à l’un des ensembles traités uniquement avec du GMCSF et de l’IL-4 pour générer des moDC matures. Ajoutez un microgramme par millilitre de LPS à un ensemble de moDC tolérogènes pour générer des moDC tolérogènes LPS.Enfin, le septième jour, récoltez les différents types de moDC en rinçant la boîte de culture avec PVS EDTA. Les moDC immatures ont été générés en ajoutant du GMCSF et de l’IL-4 à du CD-14 purifié et des monocytes aux jours zéro, quatre et six. L’ajout de vitamine D3 et de dexaméthazone après l’administration de GMCF et d’IL-4 a entraîné la différenciation des moDC immatures en moDC tolérogènes.Le LPS a été ajouté pour induire la maturation des moDC immatures en moDC matures. Et les moDC tolérogènes ont été stimulés avec du LPS pour vérifier la résistance à la maturation. Une analyse des marqueurs de surface DC a révélé que les moDC matures expriment les niveaux les plus élevés de marqueurs de maturation HLA-DR, CD80, CD83 et CD86.À l’inverse, les moDC tolérogènes ont montré une expression accrue de CD14, BDCA3 et de transcrits de type immunoglobuline par rapport aux moDC immatures et matures. En utilisant des CMXRos rouges pour refléter l’activité mytocondriale, on a observé que les moDC tolérogènes avaient une activité mytocondriale plus élevée par rapport aux autres sous-types de moDC différenciés. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunologie pour explorer les caractéristiques métaboliques des cellules dendritiques pour le développement de vaccins et d’immunothérapie.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

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