Isolement de cellules souches de mélanome : une méthode pour obtenir des cellules de mélanome CD133 positives et négatives à l’aide du tri cellulaire activé par magnétisme

- Le mélanome abrite une petite sous-population de cellules souches cancéreuses possédant à la fois des capacités d’auto-renouvellement et d’initiation tumorale. CD133 ou Prominin-1, une glycoprotéine transmembranaire pentaspan, est l’un des marqueurs clés exprimés par les cellules souches cancéreuses du mélanome métastatique. Pour isoler les cellules CD133 positives, commencez par une suspension de cellules de mélanome primaire dans un tampon approprié.

Incuber avec un réactif bloquant contenant des protéines qui bloquent les sites de liaison non spécifiques à la surface de la cellule. Traitez les cellules avec des anticorps primaires CD133 biotinylés. Ces anticorps se lient aux antigènes CD133 exprimés sur les cellules CD133 positives. Maintenant, ajoutez des microbilles magnétiques anti-biotine à la suspension. Incuber pour que les microbilles se lient aux cellules marquées à la biotine.

Enfin, passez la suspension incubée à travers une colonne placée dans un champ magnétique. Grâce à l’influence magnétique, toutes les cellules CD133-positives marquées avec les microbilles collent à la colonne, tandis que les cellules non marquées passent à travers. Collectez ces cellules CD133-négatives non marquées. Retirez la colonne du champ magnétique. Rincer le contenu à l’aide d’un tampon approprié pour éluer et collecter les cellules CD133 positives.

Dans le protocole suivant, nous montrerons l’isolement de cellules souches cancéreuses CD133-positives et négatives à partir d’une culture de mélanome primaire obtenue à partir de tissu tumoral. Lavez 80 % des cellules confluentes avec du PBS préchauffé. Ajouter une quantité appropriée d’Accutase et incuber jusqu’à ce que les cellules se détachent de la surface de la culture. Récoltez les cellules dans un milieu Quantum 263 et transférez-les dans un tube de 50 millilitres.

Énumérez les cellules. Ensuite, centrifugez le nombre requis de cellules pendant 5 minutes à 300 x g et 4 à 8 degrés Celsius. Aspirez complètement le surnageant et remettez en suspension jusqu’à 1 fois 10 à la huitième cellules dans un tampon MACS de 350 microlitres. Ajouter 100 microlitres de réactif bloquant FcR et 50 microlitres de CD133/1-Biotine. Bien mélanger et incuber à 4 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Laver les cellules avec un tampon MACS de 10 millilitres, suivi d’une centrifugation pendant 5 minutes à 300 x g et 4 à 8 degrés Celsius. Aspirez complètement le surnageant. Après un deuxième lavage, remettre en suspension la pastille cellulaire dans 400 microlitres de tampon MACS. Ajouter 100 microlitres de microbilles anti-biotine et bien mélanger. Incuber à 4 à 8 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Pendant ce temps, pour préparer le séparateur MACS pour la séparation magnétique, fixez le QuadroMACS au séparateur MACS Multi Stand. Insérez le nombre requis de colonnes LS avec les ailes de colonne vers l’avant dans le champ magnétique du QuadroMACS. Placez un filtre de pré-séparation dans chaque colonne LS et un tube de collecte approprié sous chaque colonne.

Rincez le filtre et la colonne avec un tampon MACS de 3 millilitres et jetez le flux. Après avoir lavé les cellules dans le tampon MACS comme décrit précédemment, remettez les cellules en suspension dans un tampon MACS de 500 microlitres et appliquez la suspension cellulaire sur la colonne LS préparée. Laver trois fois avec un tampon MACS de 3 millilitres par colonne. Prélever l’effluent total de la fraction cellulaire CD133-négative non marquée.

Ensuite, jetez le filtre de pré-séparation, retirez la colonne du séparateur et placez-la sur un tube de collecte approprié. Appliquez un tampon MACS de 5 millilitres. Rincez immédiatement les cellules CD133-positives marquées en poussant fermement le piston dans la colonne. Pour augmenter la pureté de la fraction négative, appliquez la suspension cellulaire sur une nouvelle colonne LS équilibrée et collectez la fraction négative CD133 de l’effluent

• Melanoma - A type of skin cancer with self-renewing tumor initiation capabilities.
• CD133 - A marker in metastatic melanoma stem cells that enables their isolation.
• MACS Separator - A device used for magnetic cell sorting isolation.
• Quantum 263 medium - A culture medium used for melanoma cell cultivation.
• Anti-Biotin Microbeads - Tiny magnetic particles used to label cells for isolation.

• Understanding Melanoma - It's a skin cancer with self-renewable tumor cells (e.g., MACS separator).
• Principles of Magnetic Cell Sorting - The process of sorting cells based on their magnetic properties (e.g., CD133).
• Role of Microbeads - They assist in segregating cells during magnetic isolation (e.g., Anti-Biotin Microbeads).
• Isolation of CD133 - The melanoma stem cells are differentiated using MACS separator.

• [Question 1] What is melanoma and how is it connected to CD133 stem cells?
• [Question 2] What role does a MACS separator play in cell isolation?
• [Question 3] How are Anti-Biotin Microbeads used in the magnetic cell isolation process?

• Cell Isolation Techniques - Understanding melanoma therapy (e.g., MACS Separator).
• Medical Industry Impact - Improved cancer treatment methodologies (e.g., CD133).
• Scientific Progression - Better understanding of stem cells can lead to medical advancements.
• Research Developments - Isolation techniques pave way for newer studies.