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Recherche sur le cancer
0 vues • 3:45 min • April 30th, 2023
- Les facteurs de transcription sont des protéines contenant des domaines de liaison à l’ADN. Ils se lient à des séquences d’ADN spécifiques et aident à réguler l’expression des gènes dans les cellules. Pour détecter l’expression du facteur de transcription dans les mélanocytes associés aux écailles, il faut d’abord prélever des écailles dorsales pigmentées foncées sur un poisson-zèbre anesthésié. Fixez les écailles et traitez-les avec une solution de perméabilisation pour rendre les mélanocytes individuels perméables.
Traitez avec une solution d’eau de Javel pour éliminer les granules de pigment de mélanine foncée des cellules. Ce processus de blanchiment élimine les risques de signaux de fond associés aux pigments lors des étapes de coloration ultérieures. Incuber avec une solution bloquante contenant des protéines pour bloquer les sites de liaison aux protéines non spécifiques à la surface de la cellule.
Maintenant, traitez l’échantillon avec les anticorps primaires souhaités. Ces anticorps se lient à leurs facteurs de transcription cibles dans les cellules. Ensuite, étiquetez l’échantillon avec des anticorps secondaires fluorescents spécifiques aux anticorps primaires. De plus, traitez l’échantillon avec un colorant fluorescent de liaison à l’ADN approprié pour colorer les noyaux cellulaires. Utilisez un microscope à fluorescence pour détecter les émissions fluorescentes brillantes des complexes facteur de transcription-anticorps et des noyaux cellulaires.
Dans le protocole suivant, nous montrerons l’immunocoloration des mélanocytes associés aux écailles dorsales exprimant le facteur de transcription A, ou mitfa, chez un poisson-zèbre transgénique.
- Pour effectuer une immunomarquage, anesthésez le poisson à raison de 0,17 milligramme par millilitre de tricaïne. Avec la lumière incidente sous un microscope à dissection, utilisez une pince à pointe fine et pointue pour épiler les écailles dorsales, en prenant soin de ne pas endommager la moitié de l’écaille contenant des mélanocytes. Placez les écailles directement de la pince dans 1 millilitre de fixateur et incubez à température ambiante, en les retournant, pendant plus de 2 heures ou moins. Transférez les poissons dans l’eau des poissons et surveillez-les pour confirmer que le rétablissement a réussi.
Pour blanchir les mélanocytes pigmentés, lavez d’abord les écailles fixes dans du PBST deux fois pendant 5 minutes à température ambiante. Ensuite, ajoutez 1 millilitre de solution d’eau de Javel fraîchement préparée et couvrez avec un parafilm ou des verrous de capuchon pour empêcher le gaz d’ouvrir les tubes. Continuez à blanchir jusqu’à ce que le pigment disparaisse. Ensuite, laver au PBST quatre fois pendant 5 minutes à température ambiante.
Incuber pendant au moins 30 minutes dans une solution en blocs. Ensuite, incubez avec environ 400 microlitres d’anticorps primaires dans une solution en bloc pendant la nuit à température ambiante. Le lendemain, lavez la balance trois fois pendant 30 minutes dans du PBST à température ambiante. Incuber avec l’anticorps secondaire pendant 2 heures à toute la nuit à température ambiante.
Après la coloration avec DAPI, appliquez une goutte de vectashield sur une lame de verre et montez les écailles de manière à ce que le côté concave des écailles soit orienté vers le bas contre la lame. Placez une lamelle en verre sur les échantillons. Utilisez du vernis à ongles transparent pour sceller les bords et observez les lames au microscope à fluorescence.