Visualisation, quantification et cartographie des populations de cellules immunitaires dans le microenvironnement tumoral

L’organisation spatiale des cellules immunitaires dans le microenvironnement tumoral a une valeur clinique. Cette stratégie peut être facilement utilisée pour visualiser, quantifier et cartographier les cellules immunitaires dans les tissus tumoraux. L’immunothérapie a révolutionné le traitement du cancer.

Cependant, tous les patients ne répondent pas bien. Cette stratégie peut servir à définir les signatures tissu-immunisées qui peuvent prévoir une bonne réponse anti-tumeur. Avant de mener une expérience, testez les combinaisons d’anticorps et les techniques de décapage sur les tissus de contrôle et vérifiez que les AIP sont exacts dans leur détection des marqueurs d’intérêt.

Comme les descriptions écrites des méthodes d’analyse d’image utilisent un langage technique sophistiqué, la combinaison du texte avec de la vidéo facilite une meilleure compréhension et réplication de la méthodologie. Pour la récupération antigène des sections de tissu tumoral formalin-fixes et paraffin-incorporées, immerger l’échantillon de tissu déwaxed dans un pot de Coplin de la solution de récupération d’antigène et placer le pot dans un autocuiseur électrique contenant l’eau du robinet. Le niveau d’eau ne doit pas dépasser la moitié de la hauteur du bocal afin que l’eau ne se mélange pas avec la solution de récupération de l’antigène.

Fermez le couvercle et la soupape de pression sur la cuisinière et traitez les glissières à haute pression pendant 10 minutes. À la fin du traitement, débranchez la cuisinière, relâchez la pression et ouvrez le couvercle. Après que les glissières se sont refroidies dans la cuisinière pendant 30 minutes, lavez les échantillons deux fois pendant cinq minutes dans du PBS frais par lavage dans un nouveau bocal Coplin, puis utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner une barrière autour de chaque section tissulaire.

Ensuite, plongez les diapositives dans de la glycine 0,1 molaire dans PBS pendant 15 minutes à température ambiante avant de rincer les diapositives deux fois dans PBS comme démontré. Après le deuxième lavage, transférer les glissières dans une chambre d’humidité et couvrir chaque section de tissu avec une solution de blocage. Après 30 minutes à température ambiante, rincer les sections deux fois pendant cinq minutes dans du PBS-Tween frais par lavage, puis ajouter les anticorps primaires d’intérêt, dilués dans la solution de blocage, à chaque glissière, à l’abri de la lumière.

À la fin de l’incubation, rincer les glissières trois fois dans du PBS-Tween frais pendant cinq minutes par lavage, puis étiqueter les sections avec les anticorps secondaires appropriés pendant une heure à température ambiante. À la fin de l’incubation, rincer les glissières trois fois dans du PBS-Tween frais pendant cinq minutes par lavage. Suivre d’un seul rinçage à l’eau double distillée.

Retirez l’excès d’eau de chaque glissière et montez les tissus avec un milieu de montage complété par dapi et une glissière de couverture. Après avoir pressé le milieu de montage excédentaire, laissez sécher les glissières pendant 20 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière, avant d’acquérir des images pour tous les canaux à l’aide d’un scanner à glissière entière. Après numérisation, ouvrez les images du logiciel d’analyse d’images et cliquez sur l’onglet Tissuealign.

Pour importer les images à aligner dans le plateau de diapositives, sélectionnez la première image à être alignée à partir de la base de données. Lorsque toutes les images ont été chargées, cliquez ensuite dans les étapes workflow pour relier les images et faire glisser et laisser tomber toutes les images à aligner sur la première image. Lorsque toutes les images ont été reliées le cas échéant, utilisez un minimum de trois broches par image indiquant les caractéristiques des tissus homologues dans les images liées.

Utilisez une goupille pour tracer la première image pour vérifier la qualité de l’alignement qui en résulte. Si un alignement satisfaisant a été obtenu, cliquez sur Suivant pour afficher les couches d’image et enregistrer l’image composite dans la base de données. Pour effectuer une détection des tissus à l’aide du protocole défini par l’utilisateur APP 1, ouvrez l’onglet Analyse d’image et ouvrez l’image composite dans le module d’analyse d’image.

Cliquez sur l’icône Open APP et sélectionz l’APPLICATION appropriée. Pour confirmer que l’APP fonctionne, accédez à un emplacement de tissu sélectionné et cliquez sur Aperçu. Si les résultats sont satisfaisants, cliquez pour traiter l’image à l’aide de l’APP sélectionnée.

Pendant le traitement, l’APP déterminera si le pixel est associé ou non au tissu pour permettre la conversion de tous les pixels associés aux tissus en une région d’intérêt. La nouvelle région d’intérêt peut ensuite être transférée à l’une des images alignées. À la fin de l’analyse, cliquez sur Fichier et Enregistrer pour enregistrer l’image modifiée avec la nouvelle région d’intérêt.

Pour la segmentation du tissu en stroma et parenchyme, ouvrez l’onglet Analyse d’image et sélectionnez les fichiers d’intérêt de la base de données. Open APP 2, APP 2 utilise l’image teintée psr pour la segmentation des tissus. Prévisualisez APP 2 en traitant l’image dans un champ de vision sélectionné.

Si les résultats sont satisfaisants, cliquez sur Exécuter pour traiter APP 2 sur l’image complète. La région d’intérêt du tissu sera segmentée en stroma et parenchyme et leurs zones respectives déterminées. Les régions nouvellement créées d’intérêt pour le stroma et le parenchyme peuvent être transférées aux images alignées, puis exporter et enregistrer l’image modifiée comme démontré.

Pour identifier et quantifier les populations cellulaires d’intérêt, importez l’image segmentée d’intérêt dans le module d’analyse d’image. Après ajustement de la couleur, ouvrez APP 3. APP 3 détectera les populations cellulaires d’intérêt et les quantifiera dans le parenchyme et le stroma.

Si les résultats sont satisfaisants, exécutez APP 3 sur l’image complète. Toutes les cellules d’intérêt individuelles seront étiquetées, leurs coordonnées tissulaires stockées et les densités des cellules d’intérêt dans les régions stroma et parenchymales déterminées. L’image modifiée peut alors être sauvegardée comme démontré.

Pour effectuer le démapping tissulaire des objets étiquetés cellule d’intérêt, ouvrez le protocole approprié défini par l’utilisateur dans la fenêtre de sélection APP et cliquez sur Exécuter pour inciter l’APP à utiliser les coordonnées des objets étiquetés anticorps pour générer la carte thermique. Les points chauds, mis en évidence en rouge, contiennent la plus forte densité de la population cellulaire d’intérêt tandis que les zones bleu foncé ont le plus bas. La carte thermique d’une population cellulaire spécifique peut être superposée sur les images alignées pour fournir des informations supplémentaires sur la façon dont ces cellules sont organisées dans le microenvironnement tumoral.

Ensuite, exportez et enregistrez la carte thermique des tissus. Il est essentiel de vérifier la spécificité de l’étiquetage, l’exactitude des APU conçus et l’efficacité de décapage et de réprobation des différentes taches sur la même section. En intégrant l’imagerie en série, l’étiquetage séquentiel et l’alignement des tissus, plus de marqueurs peuvent être visualisés simultanément et plus d’informations peuvent être extraites de spécimens cliniques limités.

La coloration de H&E des sections réséquées de tissu de tumeur permet l’évaluation de l’architecture de tissu, de la morphologie cellulaire, et des paramètres médicalement pertinents tels que le type de malignité, le grade de tumeur, et l’infiltration immunisée globale. La coloration cd34 permet la détection de cellules endothéliales. La coloration de cytokératine 8/18 révèle la présence des cellules épithéliales, et la coloration anti-alpha lisse d’actine de muscle permet l’identification des cellules stellates fibrogenic, activées, hépatiques.

Reprobing avec des anticorps contre CD68 et Desmin permettent la détection des macrophages et des myofibroblastes respectivement. Pour mieux caractériser l’infiltration tumeur-immunisée, la coloration pour des marqueurs de T-cellule et le myeloperoxidase peut être exécutée. Picro Sirius Red coloration peut également être effectuée pour visualiser le collagène fibrillar et pour faciliter la segmentation du stroma et du parenchyme.

Les pixels associés aux tissus dans les sections tachées peuvent être identifiés pour permettre la segmentation de différents compartiments dans une région d’intérêt spécifique. Les populations cellulaires d’intérêt peuvent ensuite être identifiées dans chaque région, ce qui permet la production de cartes tissulaires pour lesquelles les régions à forte densité pour une population cellulaire donnée sont affichées comme des points chauds et les régions à densité relativement faible apparaissent comme des points froids. Cette méthodologie d’identification, de quantification et de cartographie des cellules immunitaires dans les échantillons de tissus peut être adaptée et validée pour une recherche spécifique et un marqueur d’intérêt.

Cette stratégie peut être appliquée aux micro-réseaux tissulaires pour l’analyse à haut débit. Il peut également être combiné avec l’hybridation in situ pour examiner simultanément l’expression in situ des protéines et des gènes. Nous avons utilisé cette stratégie pour identifier et cartographier les cellules productrices d’IL-17A in situ dans le tissu hépatique fibreux des patients.

Comme indiqué dans le protocole, plusieurs réadageurs sont dangereuses sur le plan chimique et les procédures pertinentes devraient être effectuées dans une hotte chimique à l’aide de l’équipement de protection individuelle approprié et des précautions.