L'évaluation de la fonction cardiaque et Energétique dans les coeurs isolés de souris à l'aide ³¹ P NMR Spectroscopy

L’objectif général de l’expérience suivante est d’observer la fonction cardiaque et l’énergie dans un cœur de souris isolé et perfusé. Ceci est réalisé en perfusant le cœur d’une souris en mode LOR. Dans un deuxième temps, un ballonnet rempli d’eau est inséré dans le ventricule gauche, ce qui permet une surveillance constante de la fonction cardiaque pendant l’expérience.

Ensuite, le cœur est placé dans un tube RMN de 10 millimètres et inséré dans l’aimant afin d’évaluer l’énergie cardiaque en observant les résonances des phosphates de phospho-créatine d’un TP et les résultats de phosphate inorganique ont été obtenus qui montrent la fonction cardiaque et l’énergie basées sur les ondes de pression VG et P 31 et une spectroscopie de masse p. Bonjour, Je m’appelle Steve Kitz et je travaille au MIT Cadre Metabolism Center du Département d’anesthésiologie de l’Université de Washington. Aujourd’hui, je vais vous montrer une procédure de perfusion cardiaque isolée combinée à la spectroscopie 31 PNMR.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour évaluer la fonction cardiaque et l’énergie dans nos modèles de souris bio-ingénierie. Alors commençons. Pour commencer ce protocole, préparez un litre de kres, donc un tampon léger ou KH.

Introduisez 5 % de dioxyde de carbone et 95 % de bulles d’oxygène dans le mélange pendant 10 à 15 minutes. Ajoutez ensuite deux millimolaires de chlorure de calcium, suivis de substrats, 10 millimolaires de glucose et 0,5 millimolaire de pyruvate. Pour ces expériences, deux systèmes distincts sont utilisés simultanément par acquisition de P 31 Spectra.

Un aimant BRUER 14 T est interfacé avec la console avancée à trois et un ordinateur équipé du logiciel top spin V 2.1 pour l’évaluation de la fonction cardiaque. Un système de perfusion cardiaque construit sur mesure est interfacé avec le laboratoire de puissance. Quatre 30 réquisitions de données.

Équipé du logiciel lab chart PRO six pour l’analyse des données. L’appareil de perfusion cardiaque comprend une pompe péristaltique à trois mini-impulsions contrôlée par un contrôleur de pompe STH utilisé pour perfuser le tampon KH dans la régulation de la température cardiaque pendant l’expérience RMN est essentielle. Les circulateurs chauffés sont utilisés pour maintenir la température entre 37,0 et 37,5 degrés Celsius pendant que le cœur est à l’intérieur de l’aimant et que la température est surveillée pendant toute la durée de l’expérience à l’aide d’une sonde de température à fibre optique.

Tout au long de l’expérience, la pression BT et la pression de perfusion sont surveillées par des transducteurs de pression qui sont reliés à un système d’acquisition de données et affichés à l’aide du logiciel inclus. Un transducteur physiologique est utilisé pour surveiller la pression VG et un transducteur de pression artérielle jetable est utilisé pour surveiller la pression de perfusion. Enfin, un cordon ombilical est utilisé pour fournir le tampon oxygéné chauffé au cœur.

Une fois à l’intérieur de l’aimant, avant le début de l’expérience, étalonnez les transducteurs de pression avec le manomètre de moment fig standard en premier lieu, sans pression dans le transducteur, pour mettre l’étalonnage à zéro. Gonflez ensuite ce manomètre en mode figue à une pression plus élevée. Entrez cette valeur dans le programme informatique.

Vérifiez ensuite que les transducteurs de pression ont été correctement calibrés en gonflant ce manomètre à des pressions connues et en les vérifiant sur l’écran de l’ordinateur. Une fois les transducteurs de pression étalonnés, calibrez la sonde RMN à l’aide d’un tube RMN de 10 millimètres contenant un échantillon standard de phosphate de sodium de 150 millimolaires. Effectuez l’étalonnage à l’aide du logiciel top spin.

Tout d’abord, réglez l’échantillon pour régler la fréquence de résonance du phosphore. Ensuite, calez l’échantillon pour créer un champ magnétique homogène. Ce calibrage initial facilite le signal et diminue le temps nécessaire pour commencer la période d’acquisition.

Une fois que le cœur est positionné dans la sonde pour commencer l’extraction du cœur de la souris, injectez à la souris 200 unités d’héparine intrapéritonéale pour réduire la coagulation. Après cinq minutes, administrez 175 milligrammes par kilogramme de Penta barbital de sodium par voie intrapéritonéale. Une fois la souris anesthésiée, placez-la sur son dos et collez les bras et les jambes pour exposer la zone de la poitrine.

Effectuez un pincement des orteils pour vous assurer que la souris est complètement anesthésiée. Couper. Ouvrez la cavité péritonéale et la poitrine avec des ciseaux et utilisez des pinces pour décoller la cage thoracique et exposer une cavité thoracique avec des pinces. Tenez le tissu pulmonaire et soulevez doucement le cœur avec des ciseaux incurvés.

Coupez les gros vaisseaux derrière le cœur et continuez lentement vers la tête de la souris jusqu’à ce que le cœur soit libre. Arrêtez immédiatement le cœur dans un tampon KH glacé. Gardez les organes sur de la glace et retirez rapidement les poumons.

Identifiez les lobes du thymus et retirez-les doucement pour exposer l’aorte. Retirez ensuite le thymus. Enfin, isolez l’aorte en retirant soigneusement tout tissu environnant.

À l’aide d’une micro-pince à suture, tenez généralement les deux parois de l’aorte pour exposer la lumière. Placez ensuite délicatement l’aorte sur la canule. Fabriqué à partir de tubes en polyéthylène de 0,965 millimètre de diamètre extérieur.

Maintenez l’aorte en place à l’aide d’une pince à micro-vaisseaux et attachez rapidement les sutures autour de l’aorte. Une fois les sutures attachées, retirez la pince. À l’aide de la pince, vérifiez soigneusement que la canule se trouve au-dessus de la racine aortique.

Ajoutez toutes les attaches supplémentaires nécessaires pour maintenir le cœur en place. Retirez tout tissu supplémentaire à l’aide de la pince et des micro-ciseaux. Faites ensuite une petite incision dans l’oracle gauche.

Tenez doucement le cœur et insérez soigneusement un tube en polyéthylène de 0,61 millimètre dans l’oreillette gauche, la cavité ventriculaire gauche et l’apex par l’apex. Coupez l’excédent de tube. Ensuite, insérez un ballonnet rempli d’eau dégonflé à travers l’oreillette dans le ventricule gauche.

Maintenez le ballon en place à l’aide de ruban adhésif. Ensuite, augmentez progressivement la vitesse de la pompe péristaltique pour fournir un débit suffisant au cœur. Continuez à perfuser le cœur avec un tampon KH en utilisant un débit constant équivalent à environ deux millilitres par minute jusqu’à ce que le cœur soit placé dans la sonde RMN.

Gonflez le ballonnet LV avec un petit volume à l’aide d’une seringue micrométrique pour vérifier que le transducteur de pression LV fonctionne pour la spectroscopie RMN. Tout d’abord, insérez soigneusement le cœur dans un tube RMN de 10 millimètres. Une large toupie de sanglier est placée autour du tube RMN pour aider à guider le tube dans la bonne position.

À l’intérieur de la sonde, fixez fermement l’ensemble de l’appareil au cordon ombilical à l’aide de ruban adhésif. Ensuite, abaissez lentement le cordon ombilical dans l’alésage supérieur de l’aimant jusqu’à ce que le tube RMN contenant le cœur soit à l’intérieur de la bobine de la sonde RMN de 10 millimètres. Une fois que le cœur est dans la bonne position à l’intérieur de la sonde, ajustez le débit de la pompe parasite afin d’obtenir une pression de perfusion de 80 millimètres de mercure.

Maintenez la pression de perfusion en activant le mécanisme de maintien sur le contrôleur de pompe. Prévoyez une période d’équilibre de 15 à 20 minutes pour le cœur. Pendant la période d’équilibre, ajustez le volume du ballon LV pour obtenir une pression diastolique finale de huit à 10 millimètres de mercure.

Optimisez ensuite les paramètres du spectromètre afin d’obtenir le meilleur signal phosphoreux possible. Réglez l’instrument RMN en réglant l’impulsion radio, c’est-à-dire la fréquence à laquelle le noyau de phosphore résonne. Ensuite, calez l’échantillon pour rendre le champ magnétique homogène après la période d’équilibre.

Commencer l’acquisition de plusieurs spectres RMN P 31. La période d’acquisition de chaque spectre dépend de l’intensité de champ de l’aimant, de la taille de l’échantillon et du rapport signal/bruit requis pour une expérience spécifique. Ici, les spectres sont obtenus à l’aide d’un aimant de 14 Tesla en faisant la moyenne du signal obtenu à partir de 256 impulsions de fréquence radio de 20 microsecondes avec un angle de retournement de 60 degrés et des retards de 2,0 secondes.

Cette expérience durera environ 10 minutes. Mesure typique de la fonction cardiaque, la pression développée par le VG est obtenue en soustrayant la pression diastolique finale ou EDP de la pression systolique. Chez une souris normale C 57 black six, la pression développée par le cœur LV est généralement comprise entre 100 et 110 millimètres de mercure à une pression diastolique fixe de huit à 10 millimètres de mercure.

Des courbes de style représentatives sont observées chez les souris témoins et les souris à bandes aortiques. La fonction systolique est représentée par la pression développée par le VG sur des volumes VG croissants, déterminés par le volume du ballonnet VG. La fonction diastolique est représentée par l’EDP sur l’augmentation des volumes VG.

Les spectres RMN P 31 d’un cœur de souris perfusé isolé fournissent des signaux de PHOSPHOCRÉATINE ou PCR, les trois phosphates d’un TP et d’un phosphate inorganique ou pi. Ici, le pic de l’IP est relativement faible. Ceci est typique d’un cœur à profusion aérobie alimenté en pyruvate ou en acides gras.

En plus du glucose pendant les périodes d’ischémie, ce pic augmente tandis que le pic de PCR diminue. Je viens de vous montrer comment préparer un cœur de souris pour la perfusion afin que la fonction cardiaque et l’énergie puissent être mesurées simultanément pendant l’expérience. Il est important de s’assurer que le cœur est correctement irrigué.

Sinon, vos données RMN ne seront pas fiables. Donc c’est tout. Merci et bonne chance dans vos expériences.