Name: Lévaluation de la fonction cardiaque et Energétique dans les coeurs isolés de souris à laide 31 P NMR Spectroscopy (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-31T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Découvrez la perfusion cardiaque isolée en mode Langendorff combinée à la spectroscopie RMN du 31P pour évaluer la fonction et l'énergétique cardiaques chez la souris. Cette méthode permet le suivi simultané des phosphates à haute énergie et de la pression ventriculaire gauche.

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Les auteurs tiennent à remercier Lynne Spencer pour son soutien lors de la partie spectroscopie RMN de l&#39;expérience. Ce travail a été soutenu par des subventions du National Institutes of Health fonds R01 HL059246, R01 HL067970, R01 HL088634 (à M. Tian) et F32 HL096284 (le Dr Kolwicz).

<ol><li> Pour ces expériences, deux systèmes distincts sont utilisés simultanément. Pour l'acquisition de 31 spectres P, un aimant Bruker 14T est interfacé avec la console Avance III et d'un ordinateur équipé du logiciel TopSpin V2.1. Pour l'évaluation de la fonction cardiaque, un système personnalisé construit perfusion cardiaque est interfacé avec le PowerLab 4/30 d'acquisition de données, équipé de la LabChartPro 6 du logiciel d'analyse de données. </li><li> Le jour de l'expérience, 1 litre de tampon Krebs-Henseleit est préparée comme suit: 0,5 mM EDTA, 5,3 mm de KCl, 1,2 mm MgSO 4, 118mm NaCl, 25 mM NaHCO 3 et. Le mélange est ensuite barboter avec 5% de CO 2/95% O 2 pendant 10-15 minutes avant l'addition de 2 mM CaCl 2. Enfin, les substrats, sous la forme de 10 mM de glucose et 0,5 mM de pyruvate, sont ajoutés. </li><li> Régulation de la température lors de l'expérience est essentielle. Circulateurs chauffants sont utilisés pour maintenir la température entre 37,0 à 37,5 ° C tandis que le cœurest à l'intérieur de l'aimant. Température est surveillée pendant la durée de l'expérience en utilisant un capteur de température à fibre optique. </li><li> La pression de perfusion et de la pression ventriculaire gauche sont surveillés par des capteurs de pression reliés à un système d'acquisition de données et affichés à l'aide du logiciel inclus. Ceux-ci sont calibrés avec un sphygmomanomètre norme avant l'expérience. En outre, les conduites de pression sont vidées de manière adéquate afin d'éliminer toutes les bulles d'air. </li><li> Un échantillon standard de 150 mM de phosphate de sodium (qui est équivalent à la force ionique du tampon KH) est utilisé pour "calibrer" la sonde avant l'insertion du coeur. Ce qui facilite le signal diminue et le temps nécessaire pour commencer la période d'acquisition fois le coeur est positionné à l'intérieur de la sonde. </li><li> Pour réduire la coagulation, la souris reçoit une injection de 200 unités de l'héparine IP Après 5 minutes, du pentobarbital de sodium (175 mg / kg) IP est donnée. </li><li> Le cœur est rapidement excisé (avec les poumons d'und intacte thymus) et arrêté dans la glace froide tampon KH. </li><li> Bien conservés sur la glace, les poumons sont rapidement éliminés. Les lobes du thymus sont identifiés et délicatement décollée pour exposer l'aorte. Le thymus est supprimée. L'aorte est ensuite isolé en retirant avec précaution tout tissu environnant. </li><li> Micro pince de suture sont utilisés pour tenir doucement les deux parois de l'aorte à exposer le lumen. L'aorte est soigneusement placé sur la canule faite de 0,965 mm tubes en polyéthylène OD (PE50). L'aorte est maintenu en place avec une pince micro navire tandis que les sutures sont rapidement noué autour de l'aorte. La pince est retirée et les forceps sont utilisés pour contrôler soigneusement ce que la canule est au-dessus de la racine aortique. Liens supplémentaires sont ajoutés si nécessaire pour maintenir le cœur en place. </li><li> Tout tissu supplémentaire est retiré avec une pince et microciseaux. Une petite incision est faite dans l'oreillette gauche. Un tube de polyéthylène de 0,61 mm OD (PE10) est soigneusement inséré dans l'oreillette gauche, la cavité du VG, et à traversle sommet tout en douceur en maintenant le cœur. L'excès de tube est coupé. </li><li> Un dégonflé rempli d'eau ballonnet est inséré à travers l'oreillette dans le LV et est maintenu en place à l'aide de ruban adhésif ou des sutures. La vitesse de la pompe péristaltique est progressivement augmentée pour fournir un débit suffisant pour le coeur. Jusqu'à ce que le cœur est le lieu dans la sonde de la RMN, le cœur va continuer à être perfusé à débit constant équivalent à environ 2 ml / min. Le ballonnet est gonflé LV avec un petit volume à l'aide d'une seringue micromètre pour vérifier que le capteur de pression fonctionne LV. </li><li> Le cœur est soigneusement inséré dans un tube de RMN de 10 mm. Un large trou "spinner" est utilisé pour aider à orienter le tube dans la position correcte à l'intérieur de la sonde. L'ensemble du dispositif est alors solidaire de la "cordon ombilical" avec un ruban adhésif. </li><li> Le cordon ombilical est lentement abaissé dans l'alésage supérieur de l'aimant jusqu'à ce que le tube de coeur / RMN est à l'intérieur de la bobine de la sonde RMN 10 mm. </li><li> Une fois que l', ill'art est dans la bonne position à l'intérieur de la sonde, le débit de la pompe péristaltique est réglé pour obtenir une pression de perfusion de 80mmHg. (Rappelez-vous, que jusqu'à ce moment, le cœur a été perfusé avec un débit constant d'environ 2 ml / min). La pression de perfusion est alors maintenue en permettant le "hold" sur le mécanisme de commande de la pompe. Le coeur est alors d'un délai d'équilibration 15-20 minutes. Pendant ce temps, le volume du ballon LV est ajustée pour obtenir une pression en fin de diastole de 8-10 mmHg. </li><li> Au cours de la période d'équilibrage, il est nécessaire d'optimiser les paramètres du spectromètre afin d'obtenir le signal de phosphore meilleure possible. Ceci est accompli en mettant l'impulsion radio à la fréquence à laquelle le noyau de phosphore résonne ("tuning") et de rendre le champ magnétique homogène («calage»). </li><li> Après la période d'équilibrage, plusieurs spectres de RMN 31 P peut être obtenue. La période d'acquisition de chaque spectre est fonction de til intensité de champ de l'aimant, la taille de l'échantillon, et le rapport signal sur bruit requis pour un essai spécifique. Spectres sont obtenus à l'aide d'un aimant 14 Telsa par la moyenne du signal obtenu à partir de 256 impulsions à haute fréquence de 20 ms avec un angle de 60 degrés et les retards de bascules 2,0 secondes. Cette expérience aura besoin d'environ 10 minutes. </li></ol> Les résultats représentatifs Du matériel d'acquisition de données et le logiciel LabChart, plusieurs paramètres de la fonction cardiaque peut être mesuré à travers le protocole expérimental. La mesure de la fonction cardiaque typique, la pression développée ventriculaire gauche (LVDevP), est obtenue en soustrayant la pression en fin de diastole (PDE) de la pression systolique (figure 1). Cette mesure peut varier en fonction de la souche de la souris et l'état du cœur (par exemple, la surcharge de pression). Cependant, dans une normale C57BL6 LVDevP coeur de la souris est typiquement comprise entre 100-110 mmHg à taux fixe fin diastola pression publique de 8-10 mmHg. En outre, le programme permet LabChart pour la mesure de la fréquence cardiaque basée sur les mesures cycliques des ondes de pression LV. Encore une fois, cette mesure peut varier, mais les valeurs typiques sont de 350 à 400 bpm quand les cœurs sont autorisés à battre à taux intrinsèques. Cependant, le cœur peut être normalisée à l'aide d'un système de stimulation où la fréquence cardiaque est maintenue à 420 bpm. En outre, des mesures de contractilité (+ dP / dt) et de relaxation (-dP/dt) peut être estimée en utilisant la dérivée première de l'onde de pression LV. Pendant le protocole expérimental, il est facile de déterminer le mécanisme de Starling par incorporation d'une relation pression-volume. Ceci est accompli en faisant une augmentation graduelle du volume LV ballon et en notant la LVDevP ainsi que la PDE. Ces valeurs peuvent ensuite être tracées comme le montre la figure 2. Alors que la courbe de Starling est optimale, en notant le volume nécessaire pour atteindre une EDP de 8-10 mmHg peut donner une idée indirecte de LV chambre de dimension. Ceci peut être utilisé dans les modèles de bande aortiquetion que les coeurs hypertrophiés il faut généralement fournir un volume plus petit ballon en cœur dilaté besoin d'un plus grand volume par rapport aux témoins. Le tableau 1 présente des données représentatives de la fonction cardiaque comme acquis pendant le protocole de perfusion. Le 31 P Spectromètre RMN qui fournissent des signaux de la phosphocréatine (PCr) et les trois phosphates de l'ATP (γ-ATP, ATP-α, β-et ATP), ainsi que le phosphate inorganique (Pi), comme illustré à la figure 2. Analyse de chacun de ces pics donne une valeur pour l'aire sous la courbe. La quantité d'ATP est estimé en calculant la moyenne de la γ-ATP et l'ATP-β zones. (L'α-ATP n'est pas utilisé parce que les molécules de NAD contribuer à une partie inconnue du signal total). Le statut énergétique du cœur est déterminée par le quotient de la PCr et les zones ATP (PCr: rapport ATP). Cette valeur est généralement de 1,5 à 1,7 dans un coeur de souris fourni avec le glucose comme substrat primaire. Bien RMN 31 P nefournir des mesures directes de l'ATP ou la PCR, l'aire des pics est proportionnelle à la quantité du phosphore contenant des composés dans l'échantillon. Les valeurs de ces signaux peuvent être estimés à l'aide d'autres méthodes. Par exemple, des mesures directes de l'ATP par chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) dans une cohorte de cœur peuvent donner une concentration moyenne. Cette valeur peut alors être utilisé pour calibrer les surfaces moyennes ATP observées dans les spectres. La concentration PCR peut être calculé sur la base de la zone de PCr par rapport à la zone de l'ATP. Il est également possible d'estimer le pH en analysant le déplacement chimique relatif du phosphate inorganique (Pi) signal au signal PCr. 1 Utilisation de différentes séquences d'impulsions radio, la vitesse de réaction de la créatine kinase ou la vitesse de réaction de synthèse d'ATP peut également être mesurée 2. <img src="/files/ftp_upload/2069/2069tab1.jpg" alt="Tableau 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tableau 1"> Tableau 1. Base de la fonction cardiaque isolé perfusécœur. LVDevP: pression développée ventriculaire gauche; PTDVG: ventricule gauche en fin de diastole; HR: fréquence cardiaque; RPP: double produit; + dP / dt: dérivée première pression LV positive; -dP/dt: première pression négative dérivé LV; PP la pression de perfusion; CF:: débit coronarien. <img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Représentant ondes de pression LV de LabChart logiciel Pro. <img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Starling courbes représentatives de contrôle (trait plein) et l'aorte bandes (en pointillés) chez la souris. A) La fonction systolique représenté par LVDevP sur l'augmentation du volume LV tel que déterminé par le volume du ballon LV. B) La fonction diastolique représentée par EDP sur des volumes croissants LV tel que déterminé par le volume du ballon LV. LVDevP: la pression ventriculaire gauche développée (systolique moins pression diastolique pression); Informatique: en fin de diastole. <img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Représentant 31 P RMN de coeur isolé perfusé de souris. Remarquez le pic relativement petite Pi. Dans un coeur perfusé aérobie fourni avec des acides gras ou du pyruvate en plus du glucose, ce pic devrait être minime. Pendant les périodes d'ischémie, ce pic augmente tandis que le pic PCr diminue. Remarquez l'épaule à la droite du pic α-ATP. Il s'agit de la contribution des molécules de NAD. Pi: phosphate inorganique; PCr: phosphocréatine; ATP: adénosine triphosphate.

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</ol>

31 P RMN dans le coeur perfusé de Langendorff isolés de la souris fournit des données fiables et reproductibles. 3, 4 Toutefois, il est impératif que la canulation de l&#39;aorte et de l&#39;insertion du ballon LV sont bien faites pour permettre une telle performance cardiaque stable tandis que l&#39;intérieur de la RMN tube. En outre, la régulation de température est primordiale pour réaliser la fonction de base correcte. Un facteur important pour obtenir une bonne, spectres RMN analysables augmente le rapport signal sur bruit. Ceci peut être réalisé en assurant optimale &quot;tuning&quot; et &quot;caler&quot; sur l&#39;échantillon. Comme mentionné dans le texte du protocole, l&#39;utilisation d&#39;un échantillon standard avant l&#39;insertion du cœur peut faciliter ce processus. Il est également utile d&#39;avoir une taille adéquate &quot;échantillon&quot;. Coeurs pesant moins de 100 mg fournissent généralement inférieure PCr et de l&#39;ATP afin signaux augmentation du temps d&#39;acquisition sera nécessaire d&#39;obtenir des spectres de phosphore bonne. Il estplusieurs manières de modifier le protocole existant pour recueillir des renseignements supplémentaires sur la fonction cardiaque et de l&#39;énergétique. Dans notre laboratoire, nous avons perfusé coeurs avec des tampons de substrats mixtes qui peuvent inclure la présence de différentes combinaisons d&#39;acides gras (à des concentrations basses et hautes), le lactate, cétones, et l&#39;insuline. Avec l&#39;utilisation des isotopes stables dans le tampon de perfusion (c.-à-13 C substrats marqués), nous possédons la capacité d&#39;évaluer l&#39;utilisation du substrat par la contribution relative de l&#39;acétyl-CoA marqué le cycle de Krebs. 5-7 Pour cette application, nous effectuons isotopomère analyse de 13-C3 et C4-13 glutamate de spectroscopie 13 C-RMN. Ce gel-serrage nécessite le coeur à la fin de la perfusion de protocole et en effectuant une extraction de tissu congelé. Ce sera une expérience supplémentaire que l&#39;analyse requiert l&#39;utilisation d&#39;une sonde différente avec des paramètres de configuration séparés. D&#39;autres applications incluent l&#39;substitution du glucose avec désoxyglucose dans le tampon, tout en surveillant l&#39;accumulation en fonction du temps de 2-désoxyglucose phosphate dans le coeur en utilisant la spectroscopie RMN 31 P. Cette méthode permet la mesure de l&#39;absorption du glucose myocardique. 7, 8 En outre, notre laboratoire a analysé la fonction cardiaque et énergétique dans les protocoles de perfusion constitués d&#39;ischémie / reperfusion et le défi charge de travail élevée. 6, 8-10 En résumé, 31 P RMN dans les cœurs de souris isolées est une procédure techniquement difficile nécessitant l&#39;utilisation d&#39;équipements sophistiqués. Toutefois, les données qu&#39;elle donne une valeur inestimable pour le chercheur qui souhaite analyser la fonction et le bilan énergétique de modèles de souris transgéniques. Pour notre laboratoire, ces techniques ont joué un rôle essentiel dans notre compréhension des conséquences d&#39;une variété de facteurs de stress sur la fonction cardiaque, l&#39;énergétique et le métabolisme. 1, 11, 12

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du produit </td><td> Type </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Sulfate de magnésium </td><td> Réactif </td><td> Sigma Aldrich </td><td> M7506 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Réactif </td><td> Sigma Aldrich </td><td> E1644 </td></tr><tr><td> Le chlorure de potassium </td><td> Réactif </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P4505 </td></tr><tr><td> Le bicarbonate de sodium </td><td> Réactif </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S6297 </td></tr><tr><td> De chlorure de sodium </td><td> Réactif </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S7653 </td></tr><tr><td> Chlorure de calcium dihydraté </td><td> Réactif </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C5080 </td></tr><tr><td> Le D-glucose </td><td> Réactif </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G7528 </td></tr><tr><td> Pyruvate de sodium </td><td> Réactif </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P2256 </td></tr><tr><td> Bruker UltraShield 600WB plus </td><td> Équipement </td><td> Bruker </td><td> &amp; Nbs<html> p; </td></tr><tr><td> <a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank">PowerLab 4/30</a> </td><td> Équipement </td><td> <a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank">ADInstruments</a> </td><td> <a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank">ML866 / P</a> </td></tr><tr><td> <a href="http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/" target="_blank">LabChart 6 Pro</a> </td><td> Équipement </td><td> <a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank">ADInstruments</a> </td><td> <a href="http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/" target="_blank">MLS260 / 6</a> </td></tr><tr><td> <a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/FE224/" target="_blank">Quad Pont Amp</a> </td><td> Équipement </td><td> <a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank">ADInstruments</a> </td><td><html> s.com/products/hardware/corporate/product/FE224 / &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; ML224 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/research/product/ML175/" target="_blank">Contrôleur de pompe STH</a> </td><td> Équipement </td><td> <a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank">ADInstruments</a> </td><td> <a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/research/product/ML175/" target="_blank">ML175</a> </td></tr><tr><td> <a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML172/" target="_blank">Minipuls 3 Pompe péristaltique</a> </td><td> Équipement </td><td> <a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank">ADInstruments</a> </td><td> <a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML172/" target="_blank">ML172</a> </td></tr><tr><td> <a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT0699/" target="_blank">Transducteur BP jetable</a> </td><td> Équipement </td><td>struments.com &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; ADInstruments </td><td> <a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT0699/" target="_blank">MLT0699</a> </td></tr><tr><td> Tube 10mm échantillon RMN </td><td> Équipement </td><td> Wilmad LabGlass </td><td> 513-7PP-7 </td></tr><tr><td> PE10 tuyaux en polyéthylène </td><td> Équipement </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 427401 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT844/" target="_blank">Capteur de pression physiologique</a> </td><td> Équipement </td><td> <a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank">ADInstruments</a> </td><td> <a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT844/" target="_blank">MLT844</a> </td></tr><tr><td> PE50 tuyaux en polyéthylène </td><td> Équipement </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 427411 </td></tr><tr><td> Seringue micrométrique </td><td> Équipement </td><td> Gilmont Instruments </td><td> GS-1101 </td></tr><tr><td> McPherson forceps </td&gt; <td> Équipement </td><td> Miltex Inc </td><td> 18-949 </td></tr><tr><td> Microciseaux Castraviejo </td><td> Équipement </td><td> Instruments chirurgicaux Roboz </td><td> RS-5650 </td></tr><tr><td> Conditionneur de signal Neoptix </td><td> Équipement </td><td> Neoptix, Inc </td><td> Reflex - 1 </td></tr></tbody></table>

l&#39;évaluation de la fonction cardiaque et energétique dans les coeurs isolés de souris à l&#39;aide<sup&gt; 31</sup&gt; p nmr spectroscopy

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Modèles de souris transgéniques sont devenus des outils de recherche puissants à établir les relations de cause à effet entre les altérations moléculaires et des modèles de maladies cardio-vasculaires. Bien que la biologie moléculaire est nécessaire pour identifier les principaux changements dans la voie de signalisation, ce n&#39;est pas un substitut pour signification fonctionnelle. Alors que la physiologie peut apporter des réponses à la question de la fonction, combinant la physiologie à l&#39;évaluation biochimique de métabolites dans l&#39;intacte, le cœur battant permet de brosser un tableau complet de la fonction cardiaque et de l&#39;énergétique. Pendant des années, notre laboratoire a utilisé des perfusions cardiaques isolées combinées à résonance nucléaire (RMN) magnétique pour accomplir cette tâche. La fonction ventriculaire gauche est évaluée par la méthode de Langendorff mode de perfusions cardiaques isolés, alors que l&#39;énergétique cardiaque est mesuré en effectuant<sup&gt; 31</sup&gt; P spectroscopie de résonance magnétique des coeurs perfusés. Avec ces techniques, les indices de la fonction cardiaque en association avec les niveaux de phosphocréatine et d&#39;ATP peuvent être mesurés simultanément dans le cœur battant. En outre, ces paramètres peuvent être surveillés tout stress physiologiques ou pathologiques sont engagées. Par exemple, l&#39;ischémie / reperfusion ou élevés protocoles défi charge de travail peut être adoptée. L&#39;utilisation de l&#39;aorte cerclage ou d&#39;autres modèles de pathologie cardiaque sont aptes aussi bien. Quelles que soient les variantes dans le protocole, la signification fonctionnelle et dynamique des modifications moléculaires des modèles de souris transgéniques peuvent être correctement décrites, conduisant à de nouvelles connaissances sur les voies enzymatiques et métaboliques associées. Par conséquent,<sup&gt; 31</sup&gt; P spectroscopie RMN dans le coeur isolé perfusé est une technique de recherche précieux dans des modèles animaux de maladies cardio-vasculaires.

Langendorff mode de perfusion cardiaque isolée, en collaboration avec<sup&gt; 31</sup&gt; P spectroscopie RMN, combine les domaines de la biochimie et de la physiologie dans une expérience. Ce protocole permet la mesure dynamique de la teneur énergétique élevée en phosphate et chiffre d&#39;affaires dans le coeur tout en même temps surveiller la fonction physiologique. Quand elle est réalisée correctement, il s&#39;agit d&#39;une technique précieuse dans l&#39;évaluation de l&#39;énergétique cardiaque.

L&#39;évaluation de la fonction cardiaque et Energétique dans les coeurs isolés de souris à l&#39;aide<sup&gt; 31</sup&gt; P NMR Spectroscopy

Les modèles murins bio-ingéniérés sont devenus des outils de recherche puissants pour déterminer les relations causales entre les altérations moléculaires et les modèles de ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'observer la fonction cardiaque et les aspects énergétiques chez un cœur de souris isolé et perfusé. Cela est réalisé en perfusant un cœur de souris en mode LOR. À l'aide d'une solution tampon de Krebs enrichie en glucose et en pyruvate comme deuxième étape, un ballonnet rempli d'eau est inséré dans le ventricule gauche ou VG, ce qui permet une surveillance constante de la fonction cardiaque durant l'expérience.Ensuite, le cœur est placé dans un tube RMN de 10 millimètres et inséré dans l'aimant afin d'évaluer l'énergétique cardiaque en observant les résonances des phosphocréatines, de l'ATP et du phosphate inorganique. Les résultats obtenus montrent la fonction cardiaque et l'énergétique basées sur les ondes de pression du VG ainsi que sur la spectroscopie RMN du 31P et une spectrométrie de masse p. Bonjour, je suis Steve Kitz du Centre de Métabolisme MIT Cadre, Département d'Anesthésiologie à l'Université de Washington. Aujourd'hui, je vais vous montrer une procédure de perfusion cardiaque isolée combinée à une spectroscopie RMN du 31P.Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour évaluer la fonction cardiaque et l'énergétique chez nos modèles de souris bio-ingénierisés. Commençons donc. Pour commencer ce protocole, préparez un litre de tampon KRES, également appelé tampon KH léger.Introduire des bulles de 5 % de dioxyde de carbone et de 95 % d'oxygène dans le mélange pendant 10 à 15 minutes. Puis ajouter du chlorure de calcium à deux millimolaire, suivi des substrats, soit 10 millimolaires de glucose et 0,5 millimolaire de pyruvate. Pour ces expériences, deux systèmes distincts sont utilisés simultanément par acquisition de spectres P 31.Un aimant BRUER 14 T est associé à une console avancée à trois composants et à un ordinateur équipé du logiciel Top Spin V 2.1 pour l'évaluation de la fonction cardiaque. Un système de perfusion cardiaque sur mesure est relié au Power Lab. Quatre systèmes d'acquisition de données 30.Équipé du logiciel Lab Chart PRO six pour l'analyse des données. L'appareil de perfusion cardiaque comprend une pompe péristaltique Mini Pulse Three, contrôlée par un régulateur de pompe STH, utilisée pour perfuser le tampon KH. La régulation de la température cardiaque durant l'expérience de RMN est essentielle. Des circulateurs chauffants permettent de maintenir la température entre 37,0 et 37,5 degrés Celsius tandis que le cœur est placé dans l'aimant, et la température est surveillée tout au long de l'expérience à l'aide d'une sonde de température à fibre optique.Pendant toute la durée de l'expérience, la pression du VG et la pression de perfusion sont surveillées à l'aide de transducteurs de pression reliés à un système d'acquisition de données et affichées à l'aide du logiciel fourni. Un transducteur physiologique est utilisé pour surveiller la pression du VG et un transducteur de pression artérielle jetable est utilisé pour surveiller la pression de perfusion. Enfin, un cordon ombilical est utilisé pour acheminer le tampon chauffé et oxygéné vers le cœur.Une fois à l'intérieur de l'aimant, avant le début de l'expérience, étalonner les capteurs de pression à l'aide du manomètre étalon figurant sur la première image, sans appliquer de pression sur le capteur, afin de régler le zéro de l'étalonnage. Ensuite, gonfler ce manomètre figurant sur l'image à une pression plus élevée. Saisir cette valeur dans le programme informatique.Ensuite, vérifiez que les transducteurs de pression ont été correctement étalonnés en gonflant ce manomètre à figuration momentanée à des pressions connues et en les vérifiant sur l'écran de l'ordinateur. Une fois les transducteurs de pression étalonnés, étalonnez la sonde RMN à l'aide d'un tube RMN de 10 millimètres contenant un échantillon standard de phosphate de sodium à 150 millimolaire. Effectuez l'étalonnage à l'aide du logiciel Top Spin.Tout d'abord, régler l'échantillon afin d'ajuster la fréquence du signal du phosphore. Ensuite, effectuer le shiming de l'échantillon pour créer un champ magnétique homogène. Cette calibration initiale facilite la détection du signal et réduit le temps nécessaire pour commencer la période d'acquisition.Une fois le cœur positionné dans la sonde pour commencer l'extraction du cœur de souris, injecter 200 unités d'héparine par voie intrapéritonéale afin de réduire la coagulation. Après cinq minutes, administrer 175 milligrammes par kilogramme de pentobarbital de sodium par voie intrapéritonéale. Une fois la souris anesthésiée, la placer sur le dos et fixer les pattes avant et arrière avec du ruban adhésif afin d'exposer la région thoracique.Effectuez une pincée au niveau de l'orteil pour vous assurer que la souris est complètement anesthésiée. Ouvrez la cavité péritonéale et la poitrine avec des ciseaux, puis utilisez une pince pour écarter la cage thoracique et exposer la cavité thoracique. Saisissez le tissu pulmonaire et soulevez délicatement le cœur à l’aide de ciseaux courbes.Couper les gros vaisseaux situés derrière le cœur et continuer lentement vers la tête de la souris jusqu'à ce que le cœur soit libéré. Arrêter immédiatement le cœur dans du tampon KH glacé. Maintenir les organes sur de la glace et retirer rapidement les poumons.Identifier les lobes du thymus et les écarter délicatement pour exposer l'aorte. Ensuite, retirer le thymus. Enfin, isoler l'aorte en éliminant soigneusement tous les tissus environnants.À l'aide de forceps de suture microchirurgicaux, maintenez généralement les deux parois de l'aorte afin d'exposer la lumière. Ensuite, placez délicatement l'aorte sur la canule. Fabriquée à partir de tubulure en polyéthylène d'un diamètre extérieur de 0,965 millimètre.Fixez l'aorte en place à l'aide d'une pince pour micro-vaisseaux et liez rapidement des fils de suture autour de l'aorte. Une fois les points de suture noués, retirez la pince. Utilisez la pince à forceps pour vérifier soigneusement que la canule se trouve au-dessus de la racine aortique.Ajoutez tous les liens supplémentaires nécessaires pour maintenir le cœur en place. Retirez tout tissu excédentaire à l’aide de la pince et des ciseaux microchirurgicaux. Ensuite, pratiquez une petite incision dans l’oreillette gauche.Tenez délicatement le cœur et insérez soigneusement un tube en polyéthylène de 0,61 mm de diamètre externe à travers l'oreillette gauche, la cavité du ventricule gauche, puis faites-le sortir par l'apex. Coupez l'excès de tube. Ensuite, insérez un ballonnet dégonflé rempli d'eau à travers l'oreillette dans le ventricule gauche.Fixez le ballonnet en place à l’aide de ruban adhésif. Augmentez ensuite progressivement la vitesse de la pompe péristaltique afin d’assurer un débit suffisant vers le cœur. Continuez à perfuser le cœur avec le tampon KH à un débit constant équivalent à environ deux millilitres par minute jusqu’à ce que le cœur soit placé dans la sonde RMN.Remplir le ballonnet du VG avec un petit volume à l’aide d’une seringue micrométrique afin de vérifier le bon fonctionnement du transducteur de pression du VG pour la spectroscopie RMN. Insérer d’abord soigneusement le cœur dans un tube RMN de 10 millimètres. Un rotor à large orifice est placé autour du tube RMN pour faciliter le positionnement correct du tube.Dans la sonde, fixez fermement l'appareil entier au cordon ombilical à l'aide de ruban adhésif. Ensuite, abaissez lentement le cordon ombilical dans l'alésage supérieur de l'aimant jusqu'à ce que le tube RMN contenant le cœur se trouve à l'intérieur de la bobine de la sonde RMN de 10 millimètres. Une fois que le cœur est correctement positionné dans la sonde, ajustez le débit de la pompe parasite afin d'obtenir une pression de perfusion de 80 millimètres de mercure.Conserver la pression de perfusion en activant le mécanisme de maintien sur le contrôleur de la pompe. Laisser un temps d'équilibre de 15 à 20 minutes pour le cœur. Pendant la période d'équilibre, ajuster le volume du ballonnet du VG pour obtenir une pression diastolique finale comprise entre huit et dix millimètres de mercure.Ensuite, optimisez les paramètres du spectromètre afin d'obtenir le meilleur signal phosphore possible. Réglez l'appareil RMN en ajustant l'impulsion radio pour que la fréquence corresponde à la résonance du noyau de phosphore. Puis, effectuez le shimage de l'échantillon afin d'homogénéiser le champ magnétique après la période d'équilibration.Commencez l'acquisition de plusieurs spectres de RMN du phosphore 31. La durée d'acquisition de chaque spectre dépend de la puissance du champ magnétique, de la taille de l'échantillon et du rapport signal sur bruit requis pour une expérience spécifique. Ici, les spectres sont obtenus à l'aide d'un aimant de 14 Tesla en moyennant le signal issu de 256 impulsions radiofréquence de 20 microsecondes avec un angle de bascule de 60 degrés et des délais de 2,0 seconde.Cette expérience nécessitera environ 10 minutes. Une mesure typique de la fonction cardiaque, la pression développée du VG, s'obtient en soustrayant la pression télédiastolique ou EDP de la pression systolique. Chez une souris C57BL/6 normale, la pression développée du ventricule gauche est généralement comprise entre 100 et 110 millimètres de mercure pour une pression télédiastolique fixe de huit à 10 millimètres de mercure.Des courbes de compliance représentatives sont présentées pour des souris témoins et des souris soumises à un bandage aortique. La fonction systolique est représentée par la pression développée du VG en fonction de l'augmentation des volumes du VG, déterminée par le volume du ballonnet intraventriculaire. La fonction diastolique est représentée par la pression diastolique du VG en fonction de l'augmentation des volumes du VG.Le spectre de RMN du 31P d'un cœur de souris isolé et perfusé fournit des signaux provenant de la phosphocréatine (PCR), des trois phosphates de l'ATP et du phosphate inorganique (Pi). Ici, le pic de Pi est relativement faible. Ceci est typique d'un cœur perfusé en conditions aérobies et alimenté par du pyruvate ou des acides gras.En plus du glucose pendant les périodes d'ischémie, ce pic augmente tandis que le pic de PCR diminue. Je viens de vous montrer comment préparer un cœur de souris pour la perfusion afin que la fonction cardiaque et les paramètres énergétiques puissent être mesurés simultanément au cours de l'expérience. Il est important de s'assurer que le cœur est correctement perfusé.Sinon, vos données de RMN ne seront pas fiables. Voilà, c'est tout. Merci et bonne chance avec vos expériences.

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