Intégration génique ciblée médiée par TALEN : utilisation de nucléases spécifiques à une séquence modifiée pour l’insertion précise d’un gène de protéine fluorescente dans des hiPSC

Commencez par laver les cultures iPSC une fois chacune avec du PBS, puis ajoutez 1 millilitre de réactif de dissociation cellulaire douce à 37 degrés Celsius dans chaque puits et incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant environ 5 minutes. Lorsque plus de 50 % des cellules se sont dissociées du récipient de culture, utilisez une pipette P1000 pour perturber mécaniquement les amas de cellules restants ou les cellules attachées. Ensuite, ajoutez 2 millilitres de milieu E8 dans chaque puits et utilisez une pipette de 10 millilitres pour désagréger davantage les cultures en suspensions unicellulaires.

Maintenant, versez les cellules récoltées dans un tube conique de 15 millilitres et faites-les tourner. Remettez le granulé en suspension dans une quantité minimale de milieu E8 pour le comptage. Ensuite, après avoir confirmé la viabilité des cultures par exclusion du bleu de trypan ainsi que leur dissociation suffisante, transférez 3 millions de cellules dans chacun des deux tubes coniques de 15 millilitres.

Pendant que les cellules sont en centrifugation, réglez le système d’électroporation sur le programme spécifique au type de cellule pour la lignée de cellules souches embryonnaires humaines, H9. Ensuite, ajoutez 10 microgrammes du donneur de recombinaison homologue seul à 1 pastille pour l’échantillon de contrôle, et 10 microgrammes du plasmide du donneur de recombinaison homologue avec 5 microgrammes de chaque plasmide TALEN pour l’échantillon expérimental.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution complète de transfection de cellules primaires P3 à température ambiante à chacune des pastilles de contrôle et expérimentales, et remettez les cellules en suspension. Transférez les échantillons dans des cuvettes individuelles, puis électroporatez les échantillons. Immédiatement après la transfection, ajoutez 500 microlitres de milieu E8 à température ambiante dans chaque cuvette, puis transférez les échantillons iPSC transectés goutte à goutte dans des boîtes individuelles de 10 centimètres contenant des fibroblastes embryonnaires de souris DR4.