TALEN 매개 표적 유전자 통합: 형광 단백질 유전자를 hiPSC에 정밀하게 삽입하기 위해 엔지니어링된 염기서열 특이적 뉴클레아제 사용

먼저 PBS로 iPSC 배양액을 각각 한 번씩 세척한 다음 각 웰에 섭씨 37도의 완만 세포 해리 시약 1ml를 추가하고 약 5분 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 세포의 50% 이상이 배양 용기에서 해리된 경우 P1000 피펫을 사용하여 남아 있는 세포 덩어리 또는 부착된 세포를 기계적으로 파괴합니다. 그런 다음 각 웰에 2ml의 E8 배지를 추가하고 10ml 피펫을 사용하여 배양물을 단일 세포 현탁액으로 추가로 분해합니다.

이제 수확된 세포를 15ml 원뿔형 튜브에 붓고 스핀다운합니다. 계수를 위해 펠릿을 최소량의 E8 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 트리판 블루 배제(trypan blue exclusion)를 통해 배양물의 생존 가능성과 충분한 해리를 확인한 후 300만 개의 세포를 각각 2개의 15밀리리터 원뿔형 튜브로 이동합니다.

세포가 원심분리하는 동안 전기천공법 시스템을 인간 배아 줄기 세포주 H9에 대한 세포 유형별 프로그램으로 설정합니다. 그런 다음, 대조군 샘플에 대해 1개의 펠릿에 10마이크로그램의 상동 재조합 공여자만 추가하고, 실험 샘플에 대해 각 TALEN 플라스미드 5마이크로그램과 함께 상동 재조합 공여자 플라스미드 10마이크로그램을 추가합니다.

다음으로, 100마이크로리터의 실온 완전 P3 일차 세포 형질주입 용액을 대조군 및 실험용 펠릿 각각에 첨가하고 세포를 재현탁합니다. 샘플을 개별 큐벳으로 옮긴 다음 샘플을 전기 천공합니다. 형질주입 직후, 각 큐벳에 500마이크로리터의 실온 E8 배지를 첨가한 다음, 형질주입된 iPSC 샘플을 DR4 마우스 배아 섬유아세포가 포함된 개별 10cm 접시에 적방울 방식으로 옮깁니다.