Integrazione genica mirata mediata da TALEN: utilizzo di nucleasi specifiche per sequenza ingegnerizzate per l'inserimento preciso del gene della proteina fluorescente nelle hiPSC

Iniziare lavando le colture iPSC una volta ciascuna con PBS, quindi aggiungere 1 millilitro di reagente di dissociazione cellulare delicato a 37 gradi Celsius in ciascun pozzetto e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per circa 5 minuti. Quando più del 50% delle cellule si è dissociato dal recipiente di coltura, utilizzare una pipetta P1000 per interrompere meccanicamente eventuali grumi di cellule rimanenti o cellule attaccate. Quindi, aggiungere 2 millilitri di terreno E8 a ciascun pozzetto e utilizzare una pipetta da 10 millilitri per disaggregare ulteriormente le colture in sospensioni a cellula singola.

Ora, versa le cellule raccolte in un tubo conico da 15 millilitri e girale verso il basso. Risospendere il pellet in una quantità minima di terreno E8 per il conteggio. Quindi, dopo aver confermato la vitalità delle colture mediante esclusione del blu di tripano e la loro sufficiente dissociazione, trasferire 3 milioni di cellule in ciascuna delle due provette coniche da 15 millilitri.

Durante la centrifugazione delle cellule, impostare il sistema di elettroporazione sul programma specifico per il tipo di cellula per la linea di cellule staminali embrionali umane, H9. Quindi, aggiungere 10 microgrammi del solo donatore di ricombinazione omologa a 1 pellet per il campione di controllo e 10 microgrammi del plasmide donatore di ricombinazione omologa insieme a 5 microgrammi di ciascun plasmide TALEN per il campione sperimentale.

Quindi, aggiungere 100 microlitri di soluzione completa di trasfezione di cellule primarie P3 a temperatura ambiente a ciascuno dei pellet di controllo e sperimentali e risospendere le cellule. Trasferire i campioni in singole cuvette e quindi elettroporare i campioni. Immediatamente dopo la trasfezione, aggiungere 500 microlitri di terreno E8 a temperatura ambiente a ciascuna cuvetta, quindi trasferire i campioni di iPSC sezionati goccia a goccia in piastre individuali da 10 centimetri contenenti fibroblasti embrionali di topo DR4.