Expression, Solubilisation détergent, et purification d'un transporteur membranaire, la protéine MexB multirésistance

Afin de purifier la protéine membranaire Mex B, Mex B est d’abord exprimé dans e coli à l’aide de méthodes d’ADN recombinant. Ensuite, les membranes sont isolées et les protéines membranaires sont solubilisées avec un détergent doux. La protéine membranaire solubilisée est purifiée par iMac et la protéine est purifiée par chromatographie de filtration sur gel.

Le niveau de purification de la protéine est déterminé à l’aide de l’électrophorèse sur gel SDS poly ACRYLAMIDE. Bien que cette procédure puisse donner un aperçu des transporteurs transmembranaires multirésistants, elle peut également être appliquée à d’autres protéines membranaires démontrant que les procédures d’aujourd’hui seront formées par un étudiant diplômé de mon laboratoire. Pour cette procédure, Mex B de pseudomonas Aosa sera sous-cloné dans le vecteur d’expression PET 30 B plus de sorte que Mex B est exprimé avec une étiquette d’histamine HEXA terminale C. Commencez le soir en inoculant quatre cultures de mycine en boîte de trois millilitres avec des transformants frais ou utilisez un bouillon congelé, cultivez les cultures sur un rouleau à 37 degrés Celsius pendant la nuit le matin.

Utilisez les cultures de nuit pour inoculer 150 millilitres de LB contenant 30 microgrammes par millilitre. Mycin peut-il faire pousser la culture à 37 degrés Celsius sur un shaker l’après-midi ? Utilisez la petite culture pour inoculer six fois un litre, deux milieux XYT contenant 30 microgrammes par millilitre.

La mycine dans les flacons de fougère peut-elle être renvoyée ? Utilisez 25 millilitres par culture pour une dilution de un à 40. Cultivez les cultures à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles atteignent une densité optique.

600 de 0,4 à 0,6, environ 1,5 heure. Lorsque les cultures atteignent la bonne densité, induisez l’expression des protéines en ajoutant 0,5 millilitre d’une molaire. L’IPTG. Remettez tous les flacons dans le shaker et continuez à les faire pousser à 30 degrés Celsius pendant la nuit jusqu’à la récolte des bactéries le lendemain matin.

Récupérez les cultures du shaker et refroidissez-les. Ensuite, pour récolter les cellules, transférez les cultures dans des tubes à centrifuger et centrifugez-les à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes à 5 000 rotations par minute dans une centrifugeuse à grande échelle pendant que les cellules sont en centrifugation. Complétez 100 millilitres de tampon de suspension cellulaire avec de l’ADN, des inhibiteurs de protéase et du lysozyme.

Complétez également deux aliquotes de suspension membranaire Resus Buffer avec des inhibiteurs de protéase, comme indiqué dans ce tableau. Conservez les trois solutions sur de la glace une fois la centrifugation terminée. Resus passe les granules cellulaires dans 100 millilitres de tampon de suspension de réanimation cellulaire.

Ensuite, extrayez les cellules. La suspension de la cellule est chargée dans la cellule de pression française et la cellule est placée sur la presse française. La pression est appliquée jusqu’à ce qu’elle atteigne 12 000 livres par pouce carré.

La valve est ouverte en très petite quantité afin que les cellules brisées s’écoulent. Il est important de ne pas trop ouvrir la valve et de laisser les cellules jaillir car elles seront libérées avec trop peu de pression et ne seront pas efficacement cassées. Recueillez le lysat cellulaire dans une bouteille, conservée au frais sur de la glace.

Passez de nouveau la solution de cellule dans une cellule de pression française à 12 000 livres par pouce carré. Transférez le lysat cellulaire dans des tubes de centrifugation SS 34 et centrifugez-le pour éliminer les débris cellulaires à 10 000 rotations par minute pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius dans un rotor SS 34. Le lysat clarifié est le suivant.

Utilisé pour préparer la fraction membranaire. Transférez délicatement le supinate dans ti. 6 4, 7 0,5 tubes ultra-centrifugeurs, centrifugeuse dans un rotor TI 6 4 7 0,5 à 40 000 rotations par minute pendant 50 minutes à quatre degrés Celsius.

Jetez le supinate. À l’aide d’une pipette, remettez doucement en suspension la pastille, qui contient les membranes cellulaires dans environ 25 millilitres de tampon de suspension de membrane Resus, transférez la suspension de membrane dans un tube de centrifugation propre et centrifugez le gain dans un rotor TI I 6 4 7 0,5 de 40 000 rotations par minute pendant 50 minutes de quatre degrés Celsius et remettez en suspension la palette de membrane lavée dans 25 millilitres de tampon de suspension de membrane Resus. Ensuite, solubiliser les protéines membranaires dans les membranes remises en suspension à environ 25 millilitres.

Ajouter six millilitres de 10 % DDM de sorte que la concentration finale de détergent soit de 2 % DDM secouer le mélange à quatre degrés Celsius pendant deux heures après l’incubation de deux heures en présence de la centrifugeuse DDM, le mélange à 40 000 rotations par minute pendant 40 minutes à quatre degrés Celsius dans le rotor TI I 6 4 7 0,5. Afin de séparer les complexes détergents protéiques solubles des protéines insolubles. Conservez le natant en décubitus dorsal qui contient les complexes détergents protéiques Mex B pour l’utiliser dans le mélange de purification, le natant en décubitus dorsal contenant les complexes détergents protéiques Mex B avec deux millilitres de billes d’affinité métallique lon équilibrées dans le tampon de suspension Resus Incuber pendant une heure sur un rouleau à quatre degrés Celsius après liaison des protéines à la résine.

Versez la boue dans un corps de colonne d’écoulement par gravité et jetez l’écoulement à travers. Lavez la colonne avec 20 millilitres ou 10 volumes de colonne de reliure iMac et lavez la mémoire tampon lorsque le lavage de la colonne est terminé. Éluez les protéines liées avec 10 millilitres de tampon d’élution iMac.

Prélever des échantillons de 10 microlitres de chaque fraction d’élution. Mélanger avec 10 microlitres de deux fois l’échantillon SDS, tamponner et analyser sur un poly acrylamide à 10 %. Gel SDS.

Estimez la quantité et la pureté de mex B dans chaque fraction. Tirez les fractions contenant les complexes détergents de protéines Mex B et concentrez-les dans un concentrateur de spin à quatre degrés Celsius. Veillez à ce que la protéine ne précipite pas à cette étape.

Utilisez plusieurs rotations courtes et surveillez les précipitations. Après chaque essorage, procédez à la purification des fractions regroupées à l’aide d’une colonne de filtration sur gel. Pré-équilibrez un super rose 12 HL 30 sur 10 colonnes avec 24 millilitres de tampon de fonctionnement et attendez une ligne de base plate.

Ensuite, rincez la boucle de chargement du système actor avec le tampon en cours d’exécution. Avant d’appliquer la protéine dans la colonne, filtrez la solution protéique à l’aide d’un filtre à seringue. Chargez ensuite jusqu’à 240 microlitres de la solution protéique sur la colonne avec une protéine allant jusqu’à cinq milligrammes par millilitre.

Exécutez des volumes de 1,5 colonne de tampon et collectez des fractions de 0,25 millilitre. Les complexes détergents protéiques XB éluent sous forme de pic à environ 10 à 15 millilitres de volume d’élution. Prélever des échantillons de cinq microlitres des fractions de pointe.

Mélangez chaque échantillon un à un avec deux fois le tampon d’échantillon SDS. Analysez les échantillons sur un gel de polyacrylamide à 10 % pour estimer la quantité et la pureté de MEX B dans chaque fraction, tirez les fractions contenant du ME B pur. Ce gel de polyacrylamide a été chargé avec des fractions tirées de la colonne iMac et des fractions individuelles de la colonne de filtration de gel. Après la colonne de filtration du gel, la protéine apparaît pure sur le gel de polyacrylamide coloré au kumasi.

Une trace de la colonne de filtration sur gel montre le pic principal du complexe détergent protéique s’échappant de la colonne. Le rendement moyen en protéine mxb est d’environ deux milligrammes par six litres de deux cultures XYT Une fois maîtrisée, cette procédure peut être effectuée en huit heures si elle est effectuée correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’exprimer, de solubiliser et de purifier une protéine membranaire.