Name: Expression, Solubilisation détergent, et purification dun transporteur membranaire, la protéine MexB multirésistance (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Découvrez l'expression, la solubilisation et la purification de la protéine membranaire MexB, un transporteur de multirésistance de Pseudomonas aeruginosa. Cette méthode utilise E. coli et la chromatographie d'affinité.

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Ce projet a été soutenu par des subventions aux CJJ de la National Science Foundation et la Société des sciences biomoléculaires.

1. Jour 1: MexB de Pseudomonas aeruginosa est codée par pFB101. Le gène a été amplifié à partir MexB P. ADN génomique aeruginosa et inséré dans le Ndel et des sites de restriction Xhol du vecteur pET30b +. La construction comporte une étiquette hexahistidine C-terminale. <ol><li> Le plasmide est utilisé pour transformer E. coli souche C43 (DE3) 12, et les transformants sont étalés sur gélose LB contenant 30 ug / ml de kanamycine. </li></ol> 2. Jour 2: cultures de la nuit: <ol start="2"><li> Dans la soirée, 4 X 3 cultures LB ml contenant 30 ug / ml de kanamycine sont inoculés à partir des colonies transformantes frais. Alternativement, les cultures peuvent être inoculés à partir d'un perm congelés. Ces petites cultures sont cultivées sur un rouleau à 37 ° C pendant la nuit. </li></ol> 3. Jour 3: Grandir 6 litres cultures: <ol start="3"><li> Dans la matinée, l'utilisation des cultures durant la nuit pour inoculer 150 ml LB contenant 30 ug / ml de kanamycine. Cultiver la culture à 37 ° C sur un agitateur. </li><li> Dans l'après-midi, utilisez la petite culture pour inoculer 6 x 1L 2xYT supports contenant 30 ug / ml de kanamycine dans des flacons Fernbach. (Utilisez 25 ml par la culture pour une dilution 1:40). Cultivez les cultures à 37 ° C jusqu'à ce qu'ils atteignent une DO 600 de 0,4-0,6, à environ 1,5 heures </li><li> Lorsque les cultures atteignent la bonne densité, induisent l'expression des protéines en ajoutant 0,5 ml d'IPTG 1M. Mettre tous les flacons de retour dans le shaker et continuer à les pousser à 30 ° C pendant la nuit. </li></ol> 4. Jour 4: prélèvement de cellules et de purification des protéines: <ol start="6"><li> Ajouter les inhibiteurs de protéase, DNAse, et le lysozyme aux solutions tampons comme suit: Pour 50 mL de tampon de resuspension cellulaire, ajoutez 10 mg DNaseI (0,1 mg / ml en concentration finale), 1 EDTA complète sans comprimé d'inhibiteur de protéase, et une pincée de lysozyme . À 60 ml de tampon de resuspension membrane, ajouter 1 comprimé d'inhibiteur de protéase. Pour une autre 50 ml de tampon de resuspension membrane, ajouter 1 comprimé d'inhibiteur de protéase. Conservez tous les trois solutions sur la glace. </li><li> Centrifuger les cultures 30 min 5000 rpm à grande échelle centrifugeuse pour récolter les cellules. </li><li> Resuspendre les cellules dans 100 ml tampon de resuspension cellulaire (50 NaP mM, pH 7,0, NaCl 300 mM, MgCl2 2 mM, EDTA 1 complète sans comprimé d'inhibiteur de protéase, 0,1 mg / mL DNAse I, une pincée de lysozyme) </li><li> Faire passer la solution de cellules à deux reprises grâce à une cellule de pression française à 12.000 psi (762 pression manométrique). Recueillir le lysat cellulaire dans une bouteille conservés au froid sur la glace. </li><li> Transférer le lysat cellulaire à la SS34 tubes à centrifuger et centrifuger pour enlever les débris cellulaires pendant 30 min à 10000 rpm à 4 ° C dans un rotor SS-34. </li><li> Retirer délicatement le surnageant dans des tubes d'ultracentrifugation Ti647.5. Centrifuger 50 min à 40000 rpm à 4 ° C. Jeter le surnageant. </li><li> Reprendre le culot, qui contient les membranes cellulaires, à env. 25 ml de tampon de resuspension de membrane (50 NaP mM, pH 7,0, NaCl 300 mM, glycérol 5%, 1 EDTA complète sans comprimé d'inhibiteur de protéase). </li><li> Transférer la suspension de membrane d'un tube à centrifuger et centrifuger à nettoyer 40 000 rpm dans un rotor Ti647.5 pendant 50 min à 4 ° C. </li><li> Jeter le surnageant et remettre la membrane culot lavé dans 25 ml tampon de resuspension de membrane (50 NaP mM, pH 7,0, NaCl 300 mM, glycérol 5%, 1 EDTA complète sans comprimé d'inhibiteur de protéase). </li></ol> 5. Solublization protéine TM: <ol start="15"><li> Pour les membranes en suspension (environ 25 ml), ajouter 6 mL DDM 10% (concentration finale de détergent DDM = 2%) Rock le mélange à 4 ° C pendant 2 heures. </li><li> Centrifuger le mélange à 40000 rpm pendant 40 min à 4 ° C dans le rotor Ti647.5 pour séparer les protéines des complexes solubles de détergent à partir des protéines insolubles. Enregistrer le surnageant, qui contient les complexes protéiques MexB détergent. </li></ol> 6. IMAC: <ol start="17"><li> Mélanger le surnageant obtenu à partir de la rotation à haute vitesse avec des perles en métal Talon l'affinité équilibrée dans le tampon de resuspension. Incuber pendant 1 heure sur un rouleau à 4 ° C. </li><li> Verser la pâte dans un corps de colonne à écoulement par gravité et jetez le débit à travers. </li><li> Laver la colonne avec 20 ml (10 volumes de colonne) de tampon de liaison et de laver IMAC (50 NaP mM, pH 7, NaCl 300 mM, glycérol 5%, 0,2% DDM) </li><li> Eluer la protéine avec le tampon d'élution IMAC (50 NaP mM, pH 7,0, NaCl 300 mM, glycérol 5%, 250 mM imidazole, 0,2% DDM). </li><li> Prenez 15 uL échantillons des fractions d'élution, mélanger chacune avec 15 pi de tampon d'échantillon 2X SDS pour l'analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Spin de 30 secondes dans une microcentrifugeuse. Analyser les échantillons sur un 10% gel SDS de polyacrylamide d'estimer la quantité et la pureté de MexB dans chaque fraction. </li><li> Piscine des fractions contenant les complexes de protéines et de détergent MexB les concentrer dans un concentrateur tournent à 4 ° C. Veillez à ce que la protéine n'a pas précipiter à ce step. </li></ol> 7. Colonne de filtration sur gel: <ol start="23"><li> Pré-équilibrer une Superose 12 HL 30/10 colonne avec 24 ml de tampon de fonctionnement (50 NaP mM, pH 7,0, NaCl 300 mM, glycérol 5%, 0,2% de bêta-octylglucoside), et d'attendre une base plate. </li><li> Rincer la boucle Akta système de chargement avec un tampon de course. </li><li> Filtrer la solution de protéines en utilisant un filtre à seringue avant de l'appliquer à la colonne. </li><li> Chargez jusqu'à 240 ul de la solution de protéines sur la colonne, avec une concentration en protéines d'un maximum de 5 mg / ml. </li><li> Exécuter 1,5 volumes de colonne (36 ml) de tampon, de collecter 0,25 ml fractions. Les complexes protéiques MexB détergent doit éluer comme un pic autour de 10 - 15 ml de volume d'élution. </li><li> Prenez 5 échantillons uL des fractions de pointe. Mélanger chaque échantillon avec le tampon de 01h01 2X échantillon de SDS. Analyser les échantillons sur un gel de polyacrylamide 10% à estimer la quantité et la pureté de MexB dans chaque fraction </li><li> Piscine des fractions contenant MexB pur. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs: Figure 1 comprend un gel de polyacrylamide avec des fractions de colonne en commun de la colonne IMAC et fractions individuelles de la colonne de filtration sur gel. Après la colonne de filtration sur gel de la protéine semble pure par gel de polyacrylamide Coomassie tachés. La figure 2 comprend une trace de la colonne de filtration sur gel montrant le pic principal de l'élution complexe protéique de détergent de la colonne. Le rendement moyen de protéines MexB est d'environ 2 mg par 6 litres de culture 2xYT. <img src="/files/ftp_upload/2134/2134fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Gel SDS-PAGE de la purification du PDC MexB. Lane 1, les marqueurs de poids moléculaire. 2, Pooled fractions IMAC. 3-7, les fractions sur colonne de gel filtration. <img src="/files/ftp_upload/2134/2134fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Exemple de résultats filtration sur gel pour les complexes protéiques MexB détergents (PDC).

<ol><li>Eda, S., Maseda, H., Nakae, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+elegant+means+of+self-protection+in+gram-negative+bacteria+by+recognizing+and+extruding+xenobiotics+from+the+periplasmic+space%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An elegant means of self-protection in gram-negative bacteria by recognizing and extruding xenobiotics from the periplasmic space.</a> J. Biol. Chem. 278, 2085-2088 (2003).</li>
<li>Li, X. Z., Ma, D., Livermore, D. M., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+efflux+pump%28s%29+in+intrinsic+resistance+of+Pseudomonas+aeruginosa%3A+active+efflux+as+a+contributing+factor+to+beta-lactam+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Role of efflux pump(s) in intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa: active efflux as a contributing factor to beta-lactam resistance.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 38, 1742-1752 (1994).</li>
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<li>Maire, M. le, Champeil, P., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+membrane+proteins+and+lipids+with+solubilizing+detergents%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1508, 86-111 (2000).</li>
<li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli%3A+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> J. Mol. Biol. 260, 289-298 (1996).</li>
</ol>

En plus de la multirésistance, de nombreuses activités vitales cellulaires, y compris le transport des ions, la communication cellulaire, le transport des vésicules, le maintien de la structure cellulaire et interactions hôtes-pathogènes, impliquent des protéines qui sont incorporés dans la membrane cellulaire. Protéines transmembranaires forment plus de 30% de protéines connues et sont la cible de la majorité des produits pharmaceutiques en usage aujourd&#39;hui. Le pliage incorrect ou l&#39;activité de protéines trans...

<table><tbody><tr><td>tampon d'échantillonnage SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Souche bactérienne C43(DE3) d’E. coli</td><td>Lucigen</td><td>60345-1</td><td></td></tr><tr><td>sulfate de kanamycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4378</td><td></td></tr><tr><td>milieu 2XYT</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2466-2</td><td></td></tr><tr><td>Milieu LB</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC61189-5000</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3226-1</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7651</td><td></td></tr><tr><td>Comprimés d'inhibiteurs de protéases sans EDTA</td><td>Roche Group</td><td>11 873 580 001</td><td></td></tr><tr><td>NaP monobasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6566</td><td></td></tr><tr><td>NaP dibasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;n&lt;/em&gt;-dodécyl-&amp;#946;-D-maltopyranoside</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 15 ml</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>Bascule oscillante</td><td>Fisher Scientific</td><td>SSL 4</td><td></td></tr><tr><td>Résine d'affinité métallique Talon</td><td>Clontech Laboratories</td><td>635503</td><td></td></tr><tr><td>imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Gels de PAGE-SDS au polyacrylamide 10 %</td><td>Bio-Rad</td><td>161-1454</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de migration PAGE-SDS Tris/glycine</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0732</td><td></td></tr><tr><td>Marqueurs Kaleidascope de poids moléculaire pré-étalonnés</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0324</td><td></td></tr><tr><td>Colonne Superose 12 30/10</td><td>GE Healthcare</td><td>12 10/300 GL</td><td></td></tr><tr><td>Concentrateur centrifuge Amicon</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLFG R04 NL</td><td></td></tr><tr><td>Flacons de Fernbach</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-552-39</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur pour contenir des flacons Fernbach</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>système Akta</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse à grande échelle J6 avec rotor JLA-8.1000</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bouteilles de centrifugeuse de 1 l</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>969329</td><td></td></tr><tr><td>centrifugeuse RC-5</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rotor fixe SS34 et tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse de modèle au sol Sorvall</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rotor T647.5 et tubes avec bouchons</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>08322</td><td></td></tr><tr><td>Cellule de pression française</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>FA-032</td><td></td></tr></tbody></table>

expression, solubilisation détergent, et purification d&#39;un transporteur membranaire, la protéine mexb multirésistance

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

La multirésistance (MDR), la capacité d&#39;une cellule cancéreuse ou pathogène pour être résistant à un large éventail de structurellement et fonctionnellement indépendantes des médicaments anticancéreux ou des antibiotiques, est un problème actuel graves en santé publique. Cette multirésistance est largement due à l&#39;énergie dépendant de pompes à efflux de médicaments. Les pompes à expulser les médicaments anti-cancer ou des antibiotiques dans le milieu extérieur, abaissant leur concentration intracellulaire en dessous d&#39;un seuil toxique. Nous étudions la multirésistance chez Pseudomonas aeruginosa, un pathogène opportuniste bactérienne qui provoque des infections chez les patients atteints de nombreux types de blessures ou de maladie, par exemple, de brûlures ou de fibrose kystique, et aussi dans l&#39;immuno-compromis du cancer, de dialyse, transplantation et les patients. Les pompes à efflux MDR majeurs dans P. aeruginosa sont des complexes tripartite composé d&#39;une membrane protonique-drogue antiporteur intérieure (RND), un canal de la membrane externe (OMF), et une protéine de liaison périplasmique (PMF) 1-8. Les protéines RND et OMF sont des protéines transmembranaires. Protéines transmembranaires forment plus de 30% de toutes les protéines et 65% sont des cibles pour les médicaments actuels. Les domaines transmembranaires hydrophobes fabriquer les protéines insolubles dans un tampon aqueux. Avant une protéine transmembranaire peut être purifié, il est nécessaire de trouver des conditions de tampon contenant un détergent doux qui permettent à la protéine d&#39;être solubilisé comme un complexe protéique de détergent (PDC) 9-11. Dans cet exemple, nous utilisons une protéine RND, le P. transporteur transmembranaire aeruginosa MexB, pour démontrer comment exprimer une forme recombinante d&#39;une protéine transmembranaire, solubiliser l&#39;utiliser de détergents, et ensuite de purifier les complexes protéiques de détergent. Cette méthode générale peut être appliquée à l&#39;expression, la purification et la solubilisation de nombreuses autres protéines membranaires par recombinaison exprimée. Les complexes protéiques de détergent peuvent ensuite être utilisés pour la caractérisation biochimique ou biophysique, y compris aux rayons X la structure cristalline de détermination ou d&#39;études de réticulation.

Dans ce protocole, nous démontrons l&#39;expression, la solubilisation et la purification d&#39;une protéine membranaire exprimée par recombinaison, MexB, comme un complexe de protéines solubles de détergent. MexB est un transporteur de multirésistance membrane du opportunistes Pseudomonas aeruginosa bactérie pathogène.

Expression, Solubilisation détergent, et purification d&#39;un transporteur membranaire, la protéine MexB multirésistance

La multirésistance aux médicaments (MDR), soit la capacité d'une cellule cancéreuse ou d'un agent pathogène à être résistant à une large gamme de substances structurellement et fonctionnellement non apparentées...

Afin de purifier la protéine membranaire Mex B, celle-ci est d'abord exprimée dans E. coli à l'aide de méthodes d'ADN recombinant. Ensuite, les membranes sont isolées et les protéines membranaires sont solubilisées à l'aide d'un détergent doux. La protéine membranaire solubilisée est purifiée par chromatographie d'affinité métallique immobilisée (iMac), puis la protéine est davantage purifiée par chromatographie de filtration sur gel.Le degré de purification de la protéine est déterminé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS. Bien que cette procédure permette d'obtenir des informations sur les transporteurs transmembranaires responsables de la multirésistance aux médicaments, elle peut également être appliquée à d'autres protéines membranaires. La démonstration des procédures aujourd'hui sera effectuée par un étudiant diplômé de mon laboratoire. Pour cette procédure, MexB de Pseudomonas aeruginosa sera sous-cloné dans le vecteur d'expression pET-30b(+) de manière à ce que MexB soit exprimé avec une étiquette hexahistidine en position C-terminale. Commencer le soir en inoculant quatre cultures de 3 ml de milieu LB contenant de la kanamycine avec des transformants frais ou en utilisant un stock congelé, puis faire croître les cultures sur un rouleau à 37 °C pendant la nuit. Le matin.Utilisez les cultures de nuit pour ensemencer 150 millilitres de LB contenant 30 microgrammes par millilitre. Le Mycin peut-il faire croître la culture à 37 degrés Celsius sur un agitateur l'après-midi ? Utilisez la petite culture pour ensemencer six fois un litre, deux milieux XYT contenant 30 microgrammes par millilitre.De la canamycine dans des flacons à dos plat ? Utilisez 25 millilitres par culture pour une dilution de un à 40. Faites croître les cultures à 37 degrés Celsius jusqu'à ce qu'elles atteignent une densité optique.600 de 0,4 à 0,6, environ 1,5 heure. Lorsque les cultures atteignent la densité appropriée, induire l'expression des protéines en ajoutant 0,5 millilitre d'IPTG à une concentration d'un molaire. Remettre tous les flacons dans l'agitateurs et continuer la culture à 30 degrés Celsius pendant la nuit, jusqu'à la récolte des bactéries le lendemain matin.Récupérez les cultures à partir de l'agitateuse et refroidissez-les. Ensuite, pour récolter les cellules, transférez les cultures dans des tubes de centrifugation et centrifugez-les à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes à 5 000 tours par minute dans une centrifugeuse de grande capacité, pendant que les cellules sont en cours de centrifugation. Complétez 100 millilitres de tampon de resuspension cellulaire avec des inhibiteurs de DNAs protéase et de la lysozyme.Ajoutez également des inhibiteurs de protéases à deux aliquotes de tampon de resuspension des membranes, comme indiqué dans ce tableau. Conservez les trois solutions sur de la glace une fois la centrifugation terminée. Resuspendez les culots cellulaires dans 100 millilitres de tampon de resuspension des cellules.Ensuite, extrayez les cellules. La suspension cellulaire est chargée dans la cellule de pression française et la cellule est placée dans le presseur français. La pression est appliquée jusqu'à ce qu'elle atteigne 12 000 livres par pouce carré.La vanne est ouverte très légèrement afin que les cellules brisées s'écoulent goutte à goutte. Il est important de ne pas ouvrir la vanne trop grand, car les cellules seraient expulsées brusquement avec trop peu de pression et ne seraient pas efficacement lysées. Recueillir le lysat cellulaire dans un flacon maintenu au frais sur de la glace.Faites passer la solution cellulaire à travers une cellule de pression française à nouveau, à 12 000 livres par pouce carré. Transférez le lysat cellulaire dans des tubes de centrifugation en acier inoxydable 34 et centrifugez afin d'éliminer les débris cellulaires à 10 000 tours par minute pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius dans un rotor SS 34. Le lysat clarifié est ensuite obtenu.Utilisé pour préparer la fraction membranaire. Transférez soigneusement le surnageant dans des tubes d'ultracentrifugation ti. 6 4, 7 0.5, puis centrifugez dans un rotor TI 6 4 7 0.5 à 40 000 tours par minute pendant 50 minutes à quatre degrés Celsius.Jetez le surnageant. Utilisez une pipette pour resuspendre délicatement le culot, qui contient les membranes cellulaires, dans environ 25 millilitres de tampon de resuspension des membranes. Transférez la suspension de membranes dans un tube de centrifugeuse propre et centrifugez à 40 000 tours par minute pendant 50 minutes à 4 degrés Celsius dans un rotor TI I 6 4 7 0.5, puis resuspendez le culot de membranes lavées dans 25 millilitres de tampon de resuspension des membranes. Ensuite, solubilisez les protéines membranaires dans les membranes resuspendues d’environ 25 millilitres.Ajoutez six millilitres de DDM à 10 % afin d'obtenir une concentration finale en détergent de 2 % ; agitez doucement une heure à quatre degrés Celsius. Après une incubation de deux heures en présence de DDM, centrifugez le mélange à 40 000 tours par minute pendant 40 minutes à quatre degrés Celsius dans le rotor TI I 6 4 7 0.5, afin de séparer les complexes protéine-détergent solubles des protéines insolubles. Conservez le surnageant contenant les complexes protéine Mex B-détergent pour l'utiliser lors de la purification. Mélangez le surnageant contenant les complexes protéine Mex B-détergent avec deux millilitres de billes d'affinité métallique chargées en ions, équilibrées dans le tampon de resuspension Resus, puis incubez une heure sur un rouleau à quatre degrés Celsius après la liaison des protéines à la résine.Verser la suspension dans le corps d'une colonne à écoulement par gravité et éliminer l'écoulement initial. Laver la colonne avec 20 millilitres ou 10 volumes de colonne de tampon de liaison et de lavage iMac ; une fois le lavage de la colonne terminé. Éluer les protéines liées à l'aide de 10 millilitres de tampon d'élution iMac.Prélevez des échantillons de 10 microlitres de chaque fraction d'élution. Mélangez avec 10 microlitres de tampon d'échantillonnage SDS deux fois concentré et analysez sur un gel de polyacrylamide 10 % SDS.Estimez la quantité et la pureté de Mex B dans chaque fraction. Récupérez les fractions contenant les complexes détergent-protéine de Mex B et concentrez-les à l’aide d’un concentrateur à centrifugation à quatre degrés Celsius. Veillez à ce que la protéine ne précipite pas à cette étape.Effectuez plusieurs centrifugations courtes et surveillez la précipitation. Après chaque centrifugation, passez à la purification des fractions regroupées à l’aide d’une colonne de filtration sur gel. Équilibrez préalablement une colonne Super Rose 12 HL 30/10 avec 24 millilitres de tampon de migration et attendez d’obtenir une ligne de base stable.Ensuite, rincez la boucle de chargement du système à colonne avec le tampon de migration. Avant d'appliquer la protéine sur la colonne, filtrez la solution protéique à l'aide d'un filtre à seringue. Puis chargez jusqu'à 240 microlitres de la solution protéique sur la colonne, contenant une protéine à une concentration allant jusqu'à cinq milligrammes par millilitre.Éluer avec 1,5 volume de colonne de tampon et recueillir des fractions de 0,25 millilitre. Les complexes protéiques au détergent XB sortent en un pic aux environs de 10 à 15 millilitres de volume d'élution. Prélever des échantillons de cinq microlitres des fractions correspondant au pic.Mélangez chaque échantillon un à un avec un tampon d'échantillonnage SDS deux fois concentré. Analysez les échantillons sur un gel de polyacrylamide à 10 % afin d'estimer la quantité et la pureté de me Mex B dans chaque fraction, puis réunissez les fractions contenant ME B pur. Ce gel de polyacrylamide a été chargé avec les fractions récupérées à partir de la colonne iMac et des fractions individuelles provenant de la colonne de filtration sur gel. Après la colonne de filtration sur gel, la protéine apparaît pure sur le gel de polyacrylamide coloré au kumasi.Un tracé de la colonne de filtration sur gel montre le pic principal du complexe protéine-détergent élué de la colonne. Le rendement moyen de la protéine mxb est d'environ deux milligrammes par six litres de culture 2XYT. Une fois maîtrisée, cette procédure peut être réalisée en huit heures si elle est effectuée correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'exprimer, de solubiliser et de purifier une protéine membranaire.

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Le protocole présenté décrit l’analyse du transport médié par les protéines membranaires au niveau du transporteur unique à l’aide de bicouches lipidiques sans solvant couvrant les pores. Ceci est réalisé par la création de puces de réseaux de nanopores produites en vrac, combinée à l’acquisition et à l’analyse de données hautement parallèles, permettant la mise en place future de criblages effecteurs de protéines membranaires.

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Nous présentons ici deux protocoles ultrarapides pour la reconstitution des protéines membranaires dans des protéoliposomes coniques et la fusion de ces protéoliposomes avec des bicouches lipidiques cible pour la livraison sans tensioactifs de ces protéines de membrane dans la bicouche traduisaient. La combinaison de ces approches permet un assemblage rapide et facile à contrôler des systèmes complexes membranaires multi-composants.

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