Transfert de Southern pour détecter la recombinaison homologue dans le génome de cellules souches embryonnaires de souris

Le transfert de Southern consiste à identifier des séquences d’ADN spécifiques à partir d’un mélange complexe d’ADN par détection par sonde.

Pour identifier la recombinaison homologue ou les événements HR dans les cellules souches embryonnaires de souris avec transfert Southern, obtenez de l’ADN génomique à partir des cellules. Incuber avec une enzyme de restriction pour digérer l’ADN en fragments plus petits.

Chargez l’ADN sur un gel d’agarose. Effectuez une électrophorèse pour la séparation des fragments en fonction de la taille.

Traitez le gel avec une solution acide pour éliminer les bases puriques, en détachant l’ADN double brin, l’ADNdb. Ajouter une solution alcaline dénaturante. Le pH élevé perturbe les liaisons hydrogène, dénaturant l’ADNdb détaché en ADN simple brin, l’ADNsb. Incuber avec une solution neutralisante pour neutraliser le pH du gel.

Assemblez le système de transfert à l’aide de papiers buvards, d’une membrane en nylon et de gel empilés sur la membrane. Effectuez le transfert. L’ADNsb se transfère du gel à la membrane par capillarité descendante.

Irradier la membrane avec des rayons ultraviolets, en réticulant et en immobilisant l’ADN. Placez la membrane dans un tube contenant une solution d’hybridation. Incuber par rotation, en recouvrant la membrane et en empêchant la liaison non spécifique de la sonde.

Enfin, incubez la membrane avec le tampon d’hybridation contenant des sondes monobrin marquées radioactivement. Les sondes se lient à des régions spécifiques de l’ADN via la complémentarité des séquences.

Lavez la membrane en retirant les sondes non liées. Exposez la membrane aux rayons X. Des bandes distinctes sur la membrane distinguent les régions de l’ADN contenant des événements HR des régions de contrôle.