Transfert de Southern pour détecter la recombinaison homologue dans le génome de cellules souches embryonnaires de souris

Pour chaque ADNg, mélangez 30 microlitres de tampon 10X pour Dra I, trois microlitres de Dra I et 10 microgrammes d’ADNg par échantillon. Ajoutez de l’eau jusqu’à ce que le volume final soit de 30 microlitres et incubez à 37 degrés Celsius pendant la nuit pour digérer les ADNg.

Préparez un gel d’électrophorèse d’agarose à 1 % avec du bromure d’éthidium. Chargez les échantillons précédemment acquis avec une échelle de 1 Kb sur le gel et faites-le fonctionner à 30 à 40 volts pendant la nuit. Le lendemain, faites tremper le gel dans un plateau contenant une solution d’acide chlorhydrique de 0,2 Newton. À l’aide d’un shaker, secouez doucement le plateau pendant 20 minutes à température ambiante.

Transférez le gel dans un plateau contenant une solution dénaturante de l’ADN. Agitez-le doucement pendant 20 minutes à température ambiante. Ensuite, transférez le gel dans un plateau contenant une solution neutralisante d’ADN et agitez-le doucement pendant 20 minutes à température ambiante. À l’aide d’un système de transfert rapide vers le bas, transférez les ADN du gel vers la membrane.

Ensuite, assemblez le TurboBlotter et la pile de transfert comme indiqué dans les instructions fournies par le fabricant. Après cela, retirez la membrane et lavez-la avec du citrate de sodium salin 2X pendant une minute. Absorbez le liquide avec des tissus, puis utilisez un réticulant UV pour réticuler l’ADN avec la membrane.

Pour commencer à étiqueter les sondes d’ADN avec de la radioactivité, ajoutez les ADN de la sonde dénaturés par la chaleur dans le tube contenant les billes de marquage de l’ADN prêtes à l’emploi. Pipetez de haut en bas pour mélanger et ajoutez 5 microlitres de désoxycytosine triphosphate radioactivement. Incuber à 37 degrés Celsius pendant quinze minutes. Purifiez les sondes étiquetées à l’aide de microcolonnes G-50, conformément aux instructions fournies par le fabricant. Utilisez un compteur à scintillation pour mesurer la radioactivité.

Pour commencer l’hybridation des membranes avec les sondes marquées, placez la membrane dans le tube d’hybridation. Ajouter la solution de pré-hybridation mixte. Placez le tube dans le four d’hybridation et laissez la pré-hybridation se dérouler à 42 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ensuite, sortez le tube du four et versez la solution de pré-hybridation dans un tube de 50 millilitres. Ajouter la sonde dénaturée et mélanger délicatement. Ajoutez la solution d’hybridation mixte dans le tube d’hybridation et remettez le tube dans le four d’hybridation. Ensuite, laissez l’hybridation se faire pendant la nuit.

Pour retirer les sondes non hybridées, placez la membrane dans un plateau contenant 1x citrate salin-sodium avec 0,1 % SDS et secouez doucement à 55 à 60 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après cela, enveloppez la membrane d’une pellicule plastique et fixez-la dans la cassette d’exposition. Dans une pièce sombre, exposez la membrane à 2 feuilles de film radiographique. Développez le film pour visualiser les résultats.