Name: Visualisation de la réplication dADN mitochondrial dans des cellules individuelles par amplification du signal EdU (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-15T17:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Découvrez une technique d'amplification du signal EdU pour visualiser la réplication de l'ADN mitochondrial dans des neurones en culture. Cette méthode permet d'étudier la biogenèse mitochondriale et les maladies neurologiques associées.

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Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes Health NS-DK-38849 et 076160, la Juvenile Diabetes Research Foundation Center pour l&#39;étude de complications du diabète, le Programme de neurologie de recherche et de découverte et de l&#39;A. Alfred Taubman Institut de recherche médicale à la Université du Michigan. Ce travail a utilisé le Morphologie et Core Image Analysis du Centre de recherche sur le diabète du Michigan et de la formation, financée par les Instituts nationaux de la santé Grant 5P60 DK-20572 de l&#39;Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales. Les auteurs remercient Scott T. Clarke de Molecular Probes / Invitrogen pour ses précieux conseils sur les différentes Cliquez-iT EdU étiquetage des kits et le don généreux de réactifs pour soutenir le développement initial de la technique d&#39;amplification Edu.

1. Préparation de Neurones <ol><li> Dorsale racines ganglionnaires (DRG) sont cultivés sur des neurones stérile (autoclavés) 12 lamelles de verre mm dans une plaque de culture 24 bien. </li><li> Le stock de 10 mM d'Edu (dans le DMSO, Cliquez-iT EdU microplaques Assay Kit) est généralement dilué à 1:100 dans un milieu de culture pour obtenir une solution EdU 10X (100 uM) puis dilué 1:10 dans les puits de culture (par exemple 30 ul de la solution EdU 10X en un total de 300 ul de milieu de culture). Neurones DRG sont incubées avec une concentration finale de 10 uM EdU à 37 ° C et 5% de CO 2 entre 2-24 heures. La longueur du temps dépend de la manière dont les traitements affectent le taux de synthèse de l'ADN mitochondrial. </li><li> Dans une hotte, les neurones DRG sont fixés dans du paraformaldéhyde à 2% pendant 10-15 min à température ambiante, lavées deux fois dans du PBS 1X 2-5 minutes à chaque lavage et stockées dans l'eau douce du PBS 1X pour un maximum de 1 mois à 4 ° C. </li><li> Lamelles sont transférées avec une pince à pointe fine à une chambre humide préparée (plat BioAssay Corning avec fond noir pour tapissée revanche, enveloppé dans du papier aluminium pour protéger les composants sensibles de lumière et humidifié avec de l'eau saturée Kimwipes) et placé sur une feuille de parafilm M qui fournit une surface hydrophobe de limiter les solutions à la lamelle. Le protocole ci-dessous est conçu pour les 28 lamelles et les solutions sont préparées pour 32 lamelles (environ un volume supplémentaire de 14%). Solutions avec des composants coûteux ou limitées sont faits de sorte que 75-80 ul sont utilisés sur chaque lamelle. Sinon, 200-300 uL sont utilisés pour des solutions de lavage et de bloquer les laver à fond les solutions précédentes. </li><li> Ré-appliquer PBS 1X pour couvrir la surface de chaque lamelle (200-300 ul). Préparer le dosage Cliquez-it et tyramide kits d'amplification du signal comme décrit ci-dessous et dans les instructions du fabricant. </li></ol> Préparation de Click-iT EdU microplaques Assay Kit La plupart des composants du kit Cliquez-iT EdU Assay microplaques sont pré-faites et sont conservés à 4 ° C [2x Cliquez-iT tampon de réaction (composant E 10x), CuSO4 (100 mM, composante F), Cliquez-iT EdU fixateur ( Tampon composant D) et le blocage (Component 2x H)]. Cliquez-iT Additif Tampon Edu (Component 10x G) est stocké à -20 ° C à l'empêcher de tourner jaune-brun avec le temps. Ce composant supporte répétés de gel-dégel. L'Oregon Green 488 azide (volet B) devrait être divisé en petites portions (10-20 uL) pour minimiser les cycles gel-dégel et conservés à -20 ° C. Pour préparer une solution stock de conjugué anti-Oregon Green HRP (volet I), ajouter 75 ul de Milli Q dH O 2 dans le flacon. Mélanger doucement par pipetage ou par inversion pour éviter de faire mousser et stocker à 4 ° C. Ne pas vortex. Préparation de la TSA Kit N ° 12, avec HRP de chèvre anti-lapin IgG et Alexa Fluor 488 Kit tyramide Pour préparer la solution mère tyramide, dissoudre la matière solide (Alexa Fluor 488 tyramide, le composant A) dans 150 ul de DMSO (composant B). Retournez le flacon à plusieurs reprises pour dissoudre tout revêtement tyramide les côtés du flacon. Solution stock magasin en petites aliquotes (10-20 uL) à ≤ -20 ° C, desséchée et protégé de la lumière. 2. Cliquez-iT 5-éthynyl-2-désoxyuridine (EDU) Étiquetage REMARQUE: Toutes les solutions sont retirés avec une pipette de transfert ampoule avec une pointe de 200 ul apposée à la fin pour enlever délicatement les liquides sans cellules perdre. Évitez d'utiliser une ligne de vide, ce qui généralement supprimer des solutions trop vigoureusement. Une pipette ampoule est utilisée pour les inondations en douceur avec des lamelles de 200 à 300 uL de solutions de lavage pour laver la solution précédente. <ol><li> Les cellules sont perméabilisées avec 0,1% de Triton-X-100 dans du PBS 1X solution pendant 10 minutes à température ambiante dans une chambre couverte et humide. Utilisez 1% de Triton-X-100 solutions de stock. <ul><li> Faire 3000 ul de 0,1% de Triton-X-100 en ajoutant 300 ul 1% de Triton-X-100 d'actions à 2700μL PBS 1X. </li><li> Utilisez 75-80 ul par lamelle. </li></ul></li><li> Retirez le Triton X-100 solution et rincer deux fois avec du PBS 1X. </li><li> Activité peroxydase endogène est arrêtée par 1% de H 2 O 2 dans du PBS 1X solution pendant 30 minutes à température ambiante. Diluer 30% H 2 O 2 solution avec du PBS 1X. Cette solution doit être préparée, mais peuvent être faites pendant l'étape de perméabilisation 10 minutes ci-dessus (étape 3.1). <ul><li> Faire 3000 ul de 1% H 2 O 2 par ajout de 100 uL 30% H 2 O 2 à 2900 ul de PBS 1X. </li><li> Utilisez 75-80 ul par lamelle. </li><li> Retirer la solution de peroxydase et rincer deux fois avec du PBS 1X. </li></ul></li><li> Cliquez-iT Réaction EdU <ul><li> Pour 32 lamelles (32 x 80 uL =2560 uL) un total de 2560 uL est nécessaire. La réaction se fait en 2x 1280 ul, qui est la moitié du volume total de la réaction. </li><li> Fraîchement préparer le cocktail Réaction Cliquez-elle avant de commencer le correctif après 5 minutes (étape 3.5 ci-dessous). </li><li> Mélanger le cocktail par aspiration et refoulement. Ne pas vortexer lors de cette réaction. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 2 Cocktail de réaction x Les composants sont de Click-iT EdU microplaques Assay Kit </td><td> La moitié du volume: 1280 uL </td></tr><tr><td> Milli Q dH 2 O </td><td> 1132,8 uL </td></tr><tr><td> 2x tampon de réaction Cliquez-iT (composant E 10x) </td><td> 100,3 uL </td></tr><tr><td> Cliquez-iT Additif Tampon Edu (G Component 10x) </td><td> 25,6 uL </td></tr><tr><td> CuSO 4 (100 mm, F Component) </td><td> 25,6 uL </td></tr><tr><td> Oregon Green azide (un composant) </td><td> 6,4 uL </td></tr><tr><td> Total des </td><td> 1290,7 uL </td></tr></tbody></table> REMARQUE: Les volumes utilisés ci-dessus sont proportionnelles aux volumes figurant dans les directions Cliquez-iT microplaques EdU trousse de dosage. Le volume final de réaction Cocktail est un peu plus de 1280 pi. </li><li> L'Cliquez-iT 2X réactionnel est dilué avec un volume égal de Click-iT EdU fixateur (composant D) juste avant l'utilisation. Le mélange de ces même fait une solution de réaction uniforme pour toutes les lamelles. </li><li> Ajouter 1290,7 uL Cliquez-iT EdU fixateur (composant D) pour le cocktail 1290,7 réaction ul. Utilisez 75-80 ul par lamelle. </li></ul></li><li> Post-fixer les neurones avec Click-iT EdU fixateur (composant D) pendant 5 minutes à température ambiante. </li><li> Retirer corriger et d'ajouter un cocktail réaction ci-dessus (étape 3.4). Couvrir pour protéger de la lumière et incuber pendant 25 minutes à température ambiante. Retirez délicatement le cocktail de réaction. Laver deux fois avec diluée tampon de blocage 1X (2X composante H). <ul><li> Faire 5200 ul de tampon de blocage 1X en diluant 2600 pi de tampon de blocage (2x composante H) avec un volume égal de MilliQ d H 2 O (2600 ul). Utilisez 75-80 ul par lamelle. </li></ul></li><li> Sous un microscope épi-fluorescence, vérifiez Oregon Green coloration des noyaux de cellules de contrôle mitotique active. </li></ol> 3. Amplification du signal tyramide (TSA) de Edu Signal <ol><li> Ajouter 1% d'une solution à chaque bloc de TSA lamelle et incuber pendant 30 minutes à température ambiante. <ul><li> Faire uL d'une solution de 6000 blocs de 1% du CST en pesant 0,06 g de réactif de blocage TSA (TSA n ° 12 de kit, la composante D) et en l'ajoutant à 6000 ul de PBS 1X. Vortex pour mélanger. L'addition de sérum de chèvre 5% dans la solution de bloc TSA 1% sera souvent aider à réduire la liaison non spécifique. </li></ul></li><li> Centrifuger brièvement l'anti-Oregon Green peroxydase de raifort d'anticorps conjugués des stocks (volet I de l'Assay Cliquez-iT EdU microplaques), préparé 2-24 heures à l'avance de la TSA. Diluer l'anticorps primaire 1:300 dans 1% TSA solution de blocage et inverser ou d'une pipette de haut en bas doucement pour mélanger. Ne pas vortexer pour éviter de perturber l'anticorps HRP-conjugué. Retirer solution à 1% de bloc TSA, ajouter 75 ul de chaque lamelle et incuber une nuit à 4 ° C. <ul><li> L'anticorps peut être utilisé plus concentrée, comme 1:150, mais il est fourni en quantités limitées, donc l'utiliser avec parcimonie. Encore une fois, l'ajout de sérum de chèvre 5% dans la solution de bloc TSA 1% sera souvent aider à réduire la liaison non spécifique de l'anticorps anti-peroxydase de raifort Oregon Green conjugués. </li><li> Faire 2560 ul d'une solution d'anticorps 1:300 en ajoutant 8,53 uL du Lapin stock de lutte contre l'Oregon Green-HRP (Cliquez-iT EdU microplaques Assay) pour 2560 uL 1% Blocage TSA. Mélanger à la pipette doux ou inversion. </li></ul></li><li> Le lendemain, retirez la solution d'anticorps et rincer trois fois avec du PBS 1X. Incuber les lamelles dans le lavage final pour un 30-60 minutes supplémentaires à température ambiante afin d'assurer que les anticorps primaires non liés est enlevé. </li><li> Préparer la réaction tyramide pour 2560 uL (32 x 80 lamelles uL). <ul><li> Faire 400 ul d'un 0,15% H 2 O 2 solution (100X) en ajoutant 2 ul de 30% H 2 O 2 (TSA kit n ° 12, Composant F) à 398 uL tampon d'amplification (TSA n ° 12 de kit, composant E) . Cela devrait être fait juste avant nécessaire. </li><li> Pour un volume final de 2560 uL combiner: <ul><li> 25,6 tyramide-488 uL (TSA Kit Volet A) </li><li> 2508,8 tampon d'amplification uL (E TSA composant du kit) </li><li> 25,6 uL 0,15% H 2 O 2 (ci-dessus pour une finale de 0,0015% H 2 O 2) </li><li> Retirer du PBS 1X et incuber avec la réaction tyramide pendant 15 minutes à température ambiante. </li></ul></li></ul></li><li> Retirez la réaction tyramide et rincer trois fois avec du PBS 1X, l'incubation dans le lavage final pendant 30-60 minutes à température ambiante comme avant. </li><li> Vérifier l'ADNmt étiquetage sous un microscope épi-fluorescence. <ul><li> Mont lamelles sur des lames de microscope en verre avec un milieu de montage Antifade, comme Prolongez l'or avec le DAPI. Alternativement, l'étiquetage et l'amplification EdU peut être suivie par immunocytochimie fluorescents standards pour étiqueter les autres marqueurs cellulaires. </li></ul></li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Visualisation de la réplication d'ADN mitochondrial comme marqueur de la biogenèse mitochondriale Nous nous intéressons à la manière dont les neurones sensoriels (figure 1) réguler le nombre de mitochondries. Ce protocole d'étiquettes ADNmt nouvellement synthétisées avec un marqueur fluorescent comme un moyen de mesurer de nouvelles mitochondries. L'incorporation de l'EDU nucléotidique synthétique suivie par la chimie clic de l'amplification Oregon Green-azide et ultérieures avec les 488 Alexa-Fluor résultats tyramide dans l'étiquetage de l'ADNmt avec un signal de fluorescence verte (figure 2). Si fait correctement, le signal amplifié vert est suffisamment supérieure à la fluorescence de fond (tels que l'autofluorescence cellulaire ou un effet secondaire de la réaction HRP-TSA). Cette technique est conçue pour l'étiquette ADNmt nouvellement répliqué afin de visualiser et de quantifier l'ADNmt au sein de la biogenèse des compartiments subcellulaires de neurones (figure 3). L'étiquetage permet d'immunocytochimie EdU fluorescentes à la suite de l'étiquette d'autres marqueurs cellulaires tels que des neurofilaments (figure 3D). La réaction du CST peut aussi être fait avec d'autres fluorescents Alexa Fluor tyramides comme Alexa Fluor 594-tyramide. Il en résulte un signal vert fluo nucléaires de la réaction Orégon cliquez vert-azoture dans le noyau, mais aucun signal vert dans l'ADNmt, qui est indétectable avant la TSA. L'amplification avec Alexa Fluor 594-tyramide intensifie l'étiquette nucléaire et révèle l'EDU incorporé dans l'ADN mitochondrial avec un signal fluorescent rouge (figure 4). Une procédure d'amplification similaire est utilisé pour visualiser l'incorporation de BrdU dans l'ADN mitochondrial nouvellement synthétisées (figure 5), cependant, cette méthode nécessite une étape supplémentaire pour récupérer l'épitope BrdU soit par un acide sévère (HCl) ou de l'enzyme digérer, ce qui n'est pas nécessaire pour Edu l'étiquetage. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Représentant contraste d'interférence différentiel (DIC) des images d'embryons (à gauche) et adulte (à droite) ganglion de la racine dorsale (DRG) les neurones qui sont généralement utilisés pour l'analyse. Bars = 10 um. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Schéma représentant la procédure à suivre pour l'étiquetage EdU l'ADNmt avec un signal fluorescent vert. Le schéma représente le protocole en trois étapes pour l'étiquetage EdU l'ADNmt avec un signal fluorescent vert. Mitotiquement actives F11 cellules de neuroblastome servir de contrôle positif et d'illustrer le modèle d'étiquetage des EdU qui a été incorporé dans l'ADN nucléaire et mitochondrial. La première étape (P1) est d'incorporer un analogue de la thymidine dans l'ADN mitochondrial nouvellement synthétisées par des cellules d'incubation en présence de Edu. La deuxième étape (P2) est basée sur la chimie de cliquer à l'étiquette EdU incorporé avec une Oregon Green-azoture. Signal vert est visible dans les noyaux des cellules qui reproduit leur ADN nucléaire. L'étape finale (P3) est d'amplifier le Gr. Orégoneen-azoture de signal par incubation avec un anticorps de lapin HRP-conjugué contre Oregon Green suivie d'une incubation avec Alexa Fluor 488 tyramide marqué en présence de peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2) pour visualiser le signal vert dans l'ADNmt. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. EdU étiquetage de l'ADNmt dans le ganglion de la racine dorsale (DRG) les neurones. Neurones sont incubées avec Edu et le signal est ensuite amplifié à révéler l'ADNmt qui incorporait Edu. Représentant des images de fluorescence superposée sur la lumière transmise montrant verte ponctuée de signaux amplifiés EDU (EDU-OG-TSA, vert) incorporé dans l'ADN mitochondrial des deux nouvellement synthétisées embryonnaires (A) et adulte (BD) neurones DRG. La procédure d'étiquetage EdU permet immunofluorescence ultérieure des marqueurs neuronaux tels que neurofilaments (D, αNF, en rouge). Barres d'échelle = 10 um. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Schéma représentant la procédure à suivre pour l'étiquetage EdU l'ADNmt avec un signal rouge fluorescent. Le schéma représente le protocole en trois étapes pour l'étiquetage EdU l'ADNmt avec un signal rouge fluorescent. Mitotiquement actives F11 cellules de neuroblastome servir de contrôle positif et d'illustrer le modèle d'étiquetage des EdU qui a été incorporé dans l'ADN nucléaire et mitochondrial. La première étape (P1) est d'incorporer un analogue de la thymidine dans l'ADN mitochondrial nouvellement synthétisées par des cellules d'incubation en présence de Edu. La deuxième étape (P2) est basée sur la chimie de cliquer à l'étiquette EdU incorporé avec une Oregon Green-azoture. Signal vert est visible dans les noyaux des cellules qui reproduit leur ADN nucléaire. L'étape finale (P3) est d'amplifier l'Oregon Green-azoture de signal par incubation avec un anticorps de lapin HRP-conjugué contre Oregon Green suivie d'une incubation avec Alexa Fluor 594 tyramide marqué en présence de peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2) pour visualiser signal rouge de l'ADNmt. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. BrdU étiquetage et l'amplification du signal avec un signal tyramide vert ou rouge fluorescent dans l'ADNmt. Le schéma représente la procédure de marquage BrdU dans l'ADN mitochondrial nouvellement synthétisées avec soit un signal vert ou rouge fluorescent. Une première étape est nécessaire pour récupérer l'épitope BrdU soit par un acide (HCl) ou de l'enzyme digérer, ce qui n'est pas nécessaire pour l'étiquetage Edu. La prochaine étape est l'incubation avec une souris primaires d'anticorps anti-BrdU. Il est suivi par une incubation avec une peroxydase de raifort (HRP) de chèvre conjugué anticorps anti-souris. Enfin, le signal est amplifié avec un tyramide vert ou rouge marqué par fluorescence, en présence de peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2) pour visualiser les signaux dans l'ADN mitochondrial.

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</ol>

Nous avons développé un test sensible à l&#39;étiquette ADNmt nouvellement synthétisés dans des cellules individuelles en utilisant une amplification du signal tyramide d&#39;Edu. Un des plus gros problèmes lors de l&#39;optimisation de ce protocole a été le résultats incohérents entre les lamelles. Des changements ont été apportés aux protocoles Invitrogen kit pour éviter de mélanger de petits volumes sur des lamelles individuelles et l&#39;élaboration de solutions maître à utiliser pour toutes les lamelles. Les 75-80 uL utilisé pour chaque lamelle de verre de 12 mm circulaire est un volume idéal pour couvrir complètement la surface tout en fournissant suffisamment de solution pour donner des résultats cohérents entre les échantillons. Des temps d&#39;incubation et de concentrations de réactifs ont été optimisés, mais des améliorations pourraient être vus avec des ajustements pour eux. Le protocole est conçu pour fonctionner à chaque processus une fois. Cependant, certaines étapes ont été répétées avec de nouvelles solutions pour récupérer des échantillons qui ont échoué après la première tentative. En particulier, les étapes de réaction EdU clic (03/04 au 03/06) ont été répétés sans une augmentation significative de la fluorescence de fond. L&#39;incubation d&#39;anticorps anti-Oregon Green-HRP (04/01 au 04/03) et l&#39;amplification tyramide (04/04 au 04/05) des mesures ont également été répété, mais le plus souvent traduit par un mauvais signal à bruit en raison de la fluorescence de fond accrue. Les réactifs les plus sensibles sont les additifs Cliquez-iT Tampon Edu (Component G) et le lapin anti-Oregon Green-HRP anticorps (volet I) à partir du kit Cliquez-iT EdU Assay microplaques. L&#39;additif Cliquez-iT Tampon EdU tourne progressivement au fil du temps jaune lorsqu&#39;il est conservé à 4 ° C et entre 6-12 mois s&#39;assombrit considérablement. Stockage de l&#39;additif Cliquez-iT Tampon EdU à -20 ° C permettra d&#39;atténuer ce problème. L&#39;étiquetage et les étapes d&#39;amplification tyramide meilleur travail quand le lapin anti-Oregon Green-HRP anticorps est utilisé dans les 4-6 mois de la reconstituer dans MilliQ dH 2 O. L&#39;étiquetage légère de l&#39;ADNmt EdU permet des comparaisons directes avec d&#39;autres marqueurs cellulaires 9-11 et améliore l&#39;utilité de cette technique par rapport à d&#39;autres analogues de la thymidine, tels que le 5-bromo-2-désoxyuridine (BrdU), ce qui nécessite un traitement sévère pour récupérer son épitope dans l&#39;ADN. Notre laboratoire 11-12 et 13-15 autres ont utilisé avec succès BrdU pour étiqueter l&#39;ADNmt. La technique de marquage BrdU est similaire à celui utilisé pour Edu, mais a quelques différences importantes (figure 5). Après l&#39;étape de perméabilisation énumérés ci-dessus (3.1 à 3.2), l&#39;épitope BrdU est récupéré avec une étape de dénaturation (2 HCl pendant 30 min à 37 ° C suivie de trois lavages en PBS 1X). La BrdU est ensuite marqué avec un anticorps primaire contre le BrdU (Vector Laboratories dilué à 1:50 dans une solution de 1% le blocage de la trousse de TSA et incubée une nuit à 4 ° C). Une étape anticorps secondaire est nécessaire pour amplifier le signal BrdU (chèvre anti-IgG de souris conjugué à la HRP de la TSA trousses # 2 et # 5, dilué à 1:100 dans une solution à 1% de blocage et incubées pendant 45 min à température ambiante) avant les étapes TSA (4.3 à 4.5 ci-dessus). Avoir deux analogues de la thymidine, Edu et BrdU, d&#39;ADNmt étiquette est avantageux pour réaliser des expériences où l&#39;ADNmt étiquette double peut être étiqueté de manière séquentielle impulsion étiquetage paradigmes 11. Notre laboratoire est à l&#39;aide de l&#39;UDE et marquage au BrdU de l&#39;ADNmt d&#39;examiner la réglementation de la biogenèse mitochondriale dans le cadre de la neuropathie diabétique, une complication fréquente du diabète. Nous avons utilisé avec succès l&#39;amplification du signal pour mesurer les changements dans l&#39;ADN mitochondrial dans la biogenèse des neurones individuels 11-12. Cette technique sera utile dans d&#39;autres expériences visant à explorer les mécanismes de réplication de l&#39;ADNmt et le chiffre d&#39;affaires ou pour identifier les médicaments qui inhibent la synthèse ADNmt. En outre, les principes de base des signaux de Edu et BrdU amplifiant peut être appliquée à d&#39;autres études qui mesurent la réplication d&#39;ADN ou de réparation.

<table><tbody><tr><td>Lames de 12 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture BioAssay de 245 mm x 245 mm</td><td>Corning</td><td>431111</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Fisher Scientific</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-8532</td><td></td></tr><tr><td>Solution tampon phosphate saline 10X</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399</td><td></td></tr><tr><td>Pipette de transfert</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Peroxyde d'hydrogène, 30 % dans l'eau</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2633</td><td></td></tr><tr><td>Kit d'essai microplaque Click-iT EdU</td><td>Invitrogen</td><td>C10214</td><td></td></tr><tr><td>Kit TSA n°12, avec HRP&amp;#8212;anticorps de chèvre anti-lapin IgG et tyramide Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>T20922</td><td></td></tr><tr><td>Kit TSA n°15, avec HRP&amp;#8211;anticorps de chèvre anti-lapin IgG et tyramide Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>T20925</td><td></td></tr><tr><td>Réactif antifade ProLong Gold avec DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P-36931</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps polyclonal de lapin anti-neurofilament</td><td>Chemicon International</td><td>AB1981</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal de souris anti-BrdU</td><td>Vector Laboratories</td><td>VP-B209</td><td></td></tr><tr><td>Kit TSA n°2, avec HRP&amp;#8212;anticorps de chèvre anti-souris IgG et tyramide Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>T20912</td><td></td></tr><tr><td>Kit TSA n°5, avec HRP&amp;#8212;anticorps de chèvre anti-souris IgG et tyramide Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>T20915</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation de la réplication d&#39;adn mitochondrial dans des cellules individuelles par amplification du signal edu

Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification

Les mitochondries sont des régulateurs clés de l&#39;énergie cellulaire et la biogenèse mitochondriale est un élément essentiel de régulation de numéros de mitochondries dans les cellules saines 1-3. Une approche pour le suivi biogenèse mitochondriale est de mesurer le taux d&#39;ADN mitochondrial (ADNmt) réplication 4. Nous avons développé une technique sensible à l&#39;étiquette ADNmt nouvellement synthétisés dans des cellules individuelles, afin d&#39;étudier la biogenèse ADNmt. La technique combine l&#39;incorporation de 5-éthynyl-2&#39;-désoxyuridine (EDU) 5-7 avec une amplification du signal tyramide (TSA) 8 du protocole de visualiser la réplication au sein de l&#39;ADNmt compartiments subcellulaires des neurones. Edu est supérieur à d&#39;autres analogues de la thymidine, tels que le 5-bromo-2-désoxyuridine (BrdU), parce que la réaction initiale de cliquer à Edu étiquette 5-7 n&#39;exige pas que le traitement à l&#39;acide ou de dures enzyme digère qui sont nécessaires pour exposer l&#39;épitope BrdU . Le plus doux étiquetage des EdU permet la comparaison directe de son incorporation à d&#39;autres marqueurs cellulaires 9-10. La capacité de visualiser et de quantifier l&#39;ADNmt biogenèse fournit un outil essentiel pour étudier les mécanismes utilisés pour réguler la biogenèse mitochondriale et donnerait un aperçu de la pathogenèse associée à la toxicité des médicaments, du vieillissement, le cancer et les maladies neurodégénératives. Notre technique est applicable pour les neurones sensoriels ainsi que d&#39;autres types cellulaires. L&#39;utilisation de cette technique pour mesurer la biogenèse ADNmt a des implications importantes dans la poursuite de la compréhension de la physiologie normale à la fois cellulaire ainsi que les états pathologiques d&#39;ébriété.

Nous avons développé une technique sensible à l&#39;étiquette nouvellement synthétisés d&#39;ADN mitochondrial (ADNmt) dans des cellules individuelles, afin d&#39;étudier la biogenèse ADNmt. La technique combine l&#39;incorporation de EdU avec une amplification du signal tyramide (CST) du protocole de visualiser la réplication au sein de l&#39;ADNmt compartiments subcellulaires des neurones.

Visualisation de la réplication d&#39;ADN mitochondrial dans des cellules individuelles par amplification du signal EdU

Les mitochondries sont des régulateurs clés de l'énergie cellulaire et la biogenèse mitochondriale est un composant essentiel de la régulation du nombre de mitochondries dans les tissus sains...

L'objectif général de cette procédure est de marquer et de visualiser la réplication de l'ADN mitochondrial dans des neurones en culture. Cela est réalisé en incubant d'abord les neurones avec l'analogue de la thymidine EDU pendant deux à 24 heures. La deuxième étape de la procédure consiste à marquer l'EDU contenant un alcyne avec l'azoture de fluorophore Orgon vert 488 au moyen d'une réaction covalente catalysée par le cuivre.La dernière étape de la procédure consiste à amplifier le signal orgon vert à l'aide d'une étape d'amplification du signal à base d'aramide afin de visualiser l'EDU incorporé dans l'ADN mitochondrial nouvellement synthétisé. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent la réplication de l'ADN mitochondrial dans des compartiments sous-cellulaires spécifiques des neurones, grâce à la combinaison de la chimie de clicka EDU et d'une amplification subséquente du signal de type tear mind. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme le marquage par BRDU est que le marquage par EDU est plus simple et plus doux, permettant ainsi une coloration immunofluorescente supplémentaire de marqueurs neuronaux.Cette méthode peut répondre à des questions fondamentales concernant la régulation du nombre de mitochondries, notamment la manière dont les neurones s'adaptent aux besoins énergétiques variables de leurs compartiments subcellulaires, tels que les corps cellulaires, les axones, les dendrites et les terminaisons synaptiques. Ainsi, cette méthode permet d'élucider les mécanismes impliqués dans la pathogenèse de nombreuses maladies neurologiques liées aux mitochondries, telles que les neuropathies et la neurodégénérescence. Mais surtout, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes dans lesquels des modifications du nombre de copies d'ADN mitochondrial pourraient sous-tendre la pathogenèse de l'état pathologique, notamment la toxicité médicamenteuse, le cancer et le vieillissement.Ce vidéo montrera comment marquer l'ADN mitochondrial nouvellement synthétisé, abrégé en M-T-D-N-A, dans des neurones du ganglion de la racine dorsale cultivés sur des lamelles de verre stériles de 12 millimètres. Dans une plaque de culture à 24 puits, diluez le stock de 10 millimolaire de cinq-éthynyl-2'-désoxyuridine, abrégé en EDU provenant du kit d'essai Clicka EDO Microplate, d'un facteur de 1 à 100 dans le milieu de culture afin d'obtenir un stock de 10 XEDU. Le stock de 10 XEDU est ensuite ajouté directement dans le milieu de chaque puits. Incubez les neurones traités pendant deux à 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans une hotte.Fixer les neurones dans du paraformaldéhyde à 2 % pendant 10 à 15 minutes à température ambiante. Rincer deux fois dans du PBS 1X pendant deux à cinq minutes par rinçage. Les neurones fixés peuvent être conservés dans du PBS 1X frais à quatre degrés Celsius pendant jusqu'à un mois.Préparez une chambre humide comme décrit dans le texte accompagnant. Utilisez une pince fine pour transférer 28 lamelles fixées, incluant des contrôles positifs et négatifs d'EDU, sur des feuilles de paraforme hydrophobe M à l'intérieur de la chambre humide. Réappliquez 200 à 300 microlitres d'un XPBS pour recouvrir la surface de chaque lamelle.Préparez le kit d'analyse Click it comme décrit dans le texte et conformément aux instructions du fabricant afin de marquer l'ADN mitochondrial à l'aide de 75 à 80 microlitres d'une solution perméabilisante contenant 0,1 % de Triton X dans du PBS 1X pour chaque lamelle. Incubez à température ambiante pendant 10 minutes. Utilisez une pipette à pompe avec une pointe de 200 microlitres fixée à l'extrémité pour retirer délicatement le liquide sans perdre les cellules.Utilisez une pipette en caoutchouc pour inonder doucement la lamelle. Rincez avec 200 à 300 microlitres d'une XPBS afin d'éliminer complètement la solution précédente. Lavez chaque lamelle deux fois.Prélèver 75 à 80 microlitres de peroxyde d'hydrogène frais à 1 % dans un XPBS sur chaque lame. Incuber, recouvert, pendant 30 minutes à température ambiante afin d'inhiber l'activité peroxydasique endogène. Rincer deux fois avec un XPBS comme précédemment, puis préparer fraîchement le mélange de réaction « click » comme indiqué dans le texte accompagnant.Pipetez de haut en bas pour mélanger. Ne pas vortexer après la fixation des neurones avec 75 à 80 microlitres de fixateur click at EDU par lamelette, puis incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Pendant l'incubation post-fixation, diluez le mélange réactionnel avec un volume égal de fixateur clicka EDU.Ajoutez le cocktail de réaction sur chaque lame afin de la protéger de la lumière et incubez-la à température ambiante pendant 25 minutes. Éliminez délicatement le cocktail de réaction et rincez deux fois avec un tampon de blocage dilué à 1 x sous un microscope à fluorescence épiscopique. Vérifiez la coloration verte des organites dans les noyaux lorsque la coloration EDU est terminée.Commencez l'amplification du signal par TSA en ajoutant une solution de blocage TSA à 1 % sur chaque lame et incubez à température ambiante pendant 30 minutes. Faites brièvement tourner par centrifugation le stock d'anticorps conjugué à la peroxydase de raifort vert antioïdien préparé entre deux et 24 heures avant la dilution TSA ; diluez l'anticorps primaire au 1/300 dans la solution de blocage TSA et mélangez en retournant ou en pipetant sans vortexer. Ajoutez 75 microlitres sur chaque lame, puis incubez à quatre degrés Celsius toute la nuit.Le lendemain, rincer trois fois avec un XPBS à température ambiante. Incuber les lamelles dans le lavage final pendant 30 à 60 minutes supplémentaires afin de garantir l'élimination de l'anticorps primaire non lié. Préparer la réaction IDE conformément à la partie textuelle de ce protocole juste avant utilisation.Incuber les lamelles avec la réaction IDE pendant 15 minutes à température ambiante. Rincer trois fois avec un XPBS, en effectuant une incubation lors du dernier rinçage de 30 à 60 minutes comme précédemment, sous microscope. Vérifier l'étiquetage de l'ADN mitochondrial ; monter les neurones correctement colorés sur des lames en verre avec un milieu de montage ANTIFA contenant du DPI. Les images représentatives présentées ici, obtenues en contraste interférentiel différentiel, correspondent à des neurones du ganglion de la racine dorsale embryonnaires et adultes, couramment utilisés pour l'analyse.Ces schémas représentent la procédure de marquage de l'EDU dans l'ADN mitochondrial à l'aide d'un signal fluorescent vert. Les cellules de neuroblastome F11 en activité mitotique servent de contrôle positif et illustrent le profil de marquage de l'EDU incorporé dans l'ADN nucléaire et mitochondrial, comme le montrent ces images représentatives de fluorescence superposées à un champ clair. Les signaux ponctuels verts montrent le signal amplifié d'EDU incorporé dans le nouvel ADNmt synthétisé par les neurones des ganglions de la racine dorsale embryonnaires et adultes.La procédure de marquage par l'EDU permet une coloration immunofluorescente ultérieure de marqueurs neuronaux tels que le neurofilament en rouge. Ces schémas représentent la procédure de marquage de l'EDU et de l'ADN mitochondrial à l'aide d'un signal fluorescent rouge. Les cellules de neuroblastome F11 présentant une activité mitotique servent de contrôle positif et illustrent le profil de marquage de l'EDU incorporé dans l'ADN nucléaire et mitochondrial.Ce schéma représente la procédure d'étiquetage de la BRDU dans l'ADN mitochondrial nouvellement synthétisé à l'aide d'un signal fluorescent vert ou rouge. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de toujours inclure des contrôles utilisant des cellules mitotiquement actives afin de vérifier l'étiquetage réussi de l'EDU et des noyaux cellulaires avant de passer aux étapes d'amplification permettant de visualiser l'étiquetage de l'ADN mitochondrial. Après cette procédure, d'autres méthodes comme l'immunofluorescence classique peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que la régulation de la synthèse de l'ADN mitochondrial dans des sous-populations spécifiques de neurones ou des compartiments neuronaux. En raison de son développement, cette technique ouvrira la voie aux chercheurs en neurobiologie pour explorer la régulation du nombre de mitochondries dans des modèles cellulaires de physiologie normale ainsi que dans des modèles cellulaires simulant des pathologies altérées.États neurologiques.

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