Visualisation de la réplication d'ADN mitochondrial dans des cellules individuelles par amplification du signal EdU

L’objectif global de cette procédure est d’étiqueter et de visualiser la réplication M-T-D-N-A dans les neurones en culture. Ceci est accompli en incubant d’abord les neurones avec l’analogue de la thymidine EDU pendant deux à 24 heures. La deuxième étape de la procédure consiste à marquer l’EDU qui contient une alkin avec l’azoture fluorescent orgon green 4 88 par une réaction covalente catalysée par le cuivre.

La dernière étape de la procédure consiste à amplifier le signal vert orgon avec l’étape d’amplification du signal aramide afin de visualiser l’EDU qui a été incorporé dans l’ADN MT nouvellement synthétisé. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent la réplication de l’ADN MT dans des compartiments subcellulaires spécifiques des neurones grâce à la combinaison de la chimie clicka EDU et de l’amplification ultérieure du signal mental de larmes. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le marquage BRDU est que le marquage EDU est plus facile et plus doux, ce qui permet une coloration immunofluorescente supplémentaire des marqueurs neuronaux.

Cette méthode peut répondre à des questions clés dans la régulation du nombre de mitochondries, telles que la façon dont les neurones répondent aux charges énergétiques changeantes dans leurs compartiments subcellulaires, y compris les corps cellulaires, les axones, les dendrites et la terminaison synaptique. Cette méthode peut donc donner un aperçu des mécanismes sous-jacents à la pathogenèse de plusieurs maladies neurologiques mitochondriales, y compris la neuropathie et la neurodégénérescence. Mais surtout, il peut également être appliqué à d’autres systèmes où les changements dans la copie de l’ADN mitochondrial sont probablement à la base de la pathogenèse de l’état pathologique, y compris la toxicité des médicaments, le cancer et le vieillissement.

Cette vidéo montrera comment étiqueter l’ADN mitochondrial nouvellement synthétisé abrégé M-T-D-N-A dans les neurones ganglionnaires de la racine dorsale qui ont été cultivés sur des lamelles en verre stériles de 12 millimètres. Dans une plaque de culture à 24 puits, diluez le stock de 10 millimolaires de cinq éthanol et de deux doxyuridine, abrégé EDU du kit de dosage de microplaques Clicka EDO de un à 100 dans un milieu de culture pour un stock de 10 XEDU. Le stock de 10 XEDU est ensuite ajouté directement dans le milieu dans chaque puits, incuber les neurones traités pendant deux à 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans une hotte.

Fixez les neurones dans de l’aldéhyde paraforme à 2 % pendant 10 à 15 minutes à température ambiante. Lavez deux fois dans un XPBS pendant deux à cinq minutes à chaque lavage. Les neurones fixes peuvent être stockés dans un XPBS frais à quatre degrés Celsius jusqu’à un mois.

Préparez une chambre humide comme décrit dans le texte d’accompagnement. À l’aide d’une pince à pointe fine, transférez 28 lamelles de recouvrement fixes, y compris les commandes EDU positives et négatives, sur des feuilles de paraforme M hydrophobe à l’intérieur de la chambre humide. Réappliquez 200 à 300 microlitres d’un XPBS pour couvrir la surface de chaque lamelle.

Préparez le kit de test click it comme décrit dans le texte et les fabricants et les instructions pour étiqueter l’ADN mitochondrial à 75 à 80 microlitres d’une solution perméable contenant 0,1 % de tritton X dans un XPBS à chaque couvercle, glissez, couvrez et incubez-le à température ambiante pendant 10 minutes. Utilisez une pipette de transfert à bulbe avec une pointe de 200 microlitres à fixer à l’extrémité. Pour retirer doucement le liquide sans perdre de cellules.

À l’aide d’une pipette à bulbe, inonder doucement le couvercle. Glisser avec 200 à 300 microlitres d’un XPBS pour bien laver la solution précédente. Lavez chaque lamelle deux fois.

Pipeter 75 à 80 microlitres de peroxyde d’hydrogène frais à 1 % dans un XPBS sur chaque lamelle. Incuber couvert pendant 30 minutes à température ambiante pour éteindre l’activité endogène de la peroxydase. Rincez deux fois avec un XPBS comme avant de préparer fraîchement le cocktail de réaction comme détaillé dans le texte d’accompagnement.

Versez-le de haut en bas pour mélanger. Ne pas vortex postfixer les neurones avec 75 à 80 microlitres de clic à EDU fixateur par lamelle de couverture incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Pendant l’incubation postfix, diluez le cocktail réactionnel avec un volume égal de fixateur clicka EDU.

Ajoutez le cocktail de réaction à chaque housse pour la protéger de la lumière et incubez-le à température ambiante pendant 25 minutes. Retirez délicatement le cocktail de lavage à réaction deux fois avec un tampon de blocage dilué sous un microscope épi-fluorescent. Vérifiez la coloration en vert d’orgon dans les noyaux lorsque la coloration EDU est terminée.

Commencez l’amplification du signal de termite ou TSA, ajoutez 1 % de solution de bloc TSA à chaque lamelle de couverture et incubez la température ambiante pendant 30 minutes. Essorez brièvement le stock d’anticorps conjugués antione : raifort vert, peroxydase Préparé deux à 24 heures avant la TSA, diluez l’anticorps primaire un à 300 dans une solution bloquant la TSA et retournez ou pipetez pour mélanger le vortex de nœuds. Ajoutez 75 microlitres à chaque couvercle, glissez et incubez à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, rincez trois fois avec un XPBS à température ambiante. Incuber les lamelles lors du lavage final pendant 30 à 60 minutes supplémentaires pour s’assurer que l’anticorps primaire non lié est éliminé. Préparez la réaction de l’IDE conformément à la partie texte de ce protocole immédiatement avant l’utilisation.

Incuber les lamelles avec la réaction IDE pendant 15 minutes à température ambiante. Laver trois fois avec un XPBS en incubant dans le lavage final pendant 30 à 60 minutes comme précédemment au microscope. Vérifiez si le marquage de l’ADN MT monte avec succès les neurones colorés sur des lames de verre avec un support de montage ANTIFA contenant le DPI Les images représentatives du contraste intervenant différentiel des neurones ganglionnaires de la racine dorsale embryonnaire et adulte sont généralement utilisées pour l’analyse.

Ces schémas représentent la procédure d’étiquetage de l’EDU en MTD NA avec un signal fluorescent vert. Les cellules de neuroblastome F11 mitotiquement actives servent de contrôle positif et illustrent le modèle de marquage de l’EDU qui a été incorporé dans l’ADN nucléaire et mitochondrial dans ces images de fluorescence représentatives superposées sur un fond clair. Les signaux ponctués verts montrent le signal EDU amplifié incorporé dans le M-D-D-N-A nouvellement synthétisé des neurones ganglionnaires de la racine dorsale embryonnaire et adulte.

La procédure de marquage EDU permet une coloration immunofluorescente ultérieure des marqueurs neuronaux tels que le neurofilament en rouge. Ces schémas représentent la procédure d’étiquetage de l’EDU et du MTD NA avec un signal fluorescent rouge. Les cellules de neuroblastome F11 mitotiquement actives servent de contrôle positif et illustrent le modèle de marquage de l’EDU qui a été incorporé dans l’ADN nucléaire et mitochondrial.

Ce schéma représente la procédure d’étiquetage des EDBR dans les M-T-D-N-A nouvellement synthétisés avec un signal fluorescent vert ou rouge. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’exécuter des contrôles à l’aide de cellules mitotiquement actives afin de vérifier le succès du marquage EDU et des noyaux cellulaires avant de passer aux étapes d’amplification pour visualiser le marquage de l’ADN MT Suite à cette procédure. D’autres méthodes, comme l’immunofluorescence standard, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la façon dont la synthèse de l’ADN des mitochondries est régulée dans des sous-populations spécifiques de neurones ou de compartiments neuronaux. En raison de son développement, cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine de la neurobiologie pour explorer la régulation du nombre mitochondrial dans des modèles de culture de physiologie normale ainsi que dans des modèles de culture qui simulent une maladie altérée.

États neurologiques.