Approches expérimentales pour l'étude mitochondrial Localisation et fonction d'une cellule du cycle nucléaire Kinase, Cdk1

L’objectif global de la procédure suivante est de déterminer la localisation soujochondriale d’une kinase du cycle cellulaire normalement nucléaire, puis d’analyser comment sa localisation mitochondriale affecte la progression du cycle cellulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche mitochondriale, telles que la façon dont le noyau communique avec les mitochondries pendant le cycle cellulaire. En marquant les protéines avec une séquence principale des mitochondries, nous pouvons tirer parti des expressions supérieures spécifiques des protéines dans les mitochondries, ce qui nous permet d’étudier leurs fonctions spécifiques aux mitochondries.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du ciblage mitochondriale de certaines protéines, elle peut également être appliquée à d’autres organites, tels que le noyau, le RE, le golgi et un lysosome. Après la culture, l’homogénéisation et la granulation des cellules selon le protocole de texte, transférez le surnageant dans un nouveau tube. Et centrifugez l’échantillon à 7 000 g et 4 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Utilisez ensuite 200 microlitres de tampon IBC glacé pour remettre le granulé en suspension et divisez l’homogénat en deux aliquotes. Centrifugez à nouveau les échantillons à 7 000 g et 4 degrés Celsius pendant 10 minutes. Et répétez le lavage.

Après avoir jeté le surnageant, ajoutez 30 microlitres de tampon de lyse cellulaire à l’une des pastilles et stockez le lysat à 80 degrés Celsius pour l’immunobuvardage. Pour effectuer l’extraction au carbonate de sodium avec la deuxième pastille afin de séparer les protéines solubles et membranaires, ajoutez 250 microlitres de carbonate de sodium à 0,1 molaire pH 11,0 et incubez sur de la glace pendant 30 minutes. Centrifuger à 100 000 g pendant 20 minutes.

Ensuite, récupérez le surnageant et ajoutez un volume égal d’acide trichloracétique à 20 % fraîchement préparé pour précipiter les protéines. Garder sur la glace pendant 30 minutes. Entre-temps, ajoutez 30 microlitres de tampon de lyse cellulaire à la pastille et sonicate selon le protocole textuel avant de le stocker à 80 degrés Celsius pour l’immunoblottage.

Après l’incubation de 30 minutes de TCA, centrifuger la réaction à 15 000 g pendant 10 minutes. Jetez le surnageant, puis utilisez 80 microlitres de tampon de lyse cellulaire pour remettre la pastille en suspension. Après avoir isolé les fractions mitochondriales des cellules comme décrit dans le protocole textuel, séparez les fractions mitochondriales en 10 portions égales.

Granulez les échantillons à 7 000 g et 4 degrés Celsius pendant 10 minutes. Utilisez 30 microlitres d’une gamme de concentrations de tampons hypotoniques de saccharose avec ou sans trypsine, pour dissoudre chaque pastille. Et incuber sur glace pendant 30 minutes.

Ajoutez 3 microlitres de PMSF de 10 millimolaires dans les flacons contenant de la trypsine pour arrêter la digestion de la trypsine. Et incuber sur glace pendant 10 minutes. Centrifugez les échantillons à 14 000 g et 4 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Et transférez le surnageant dans un nouveau tube. Pour lyser la pastille, ajoutez 30 microlitres de tampon de lyse cellulaire. Sonicez les échantillons comme décrit dans le protocole textuel et stockez-les à 80 degrés Celsius.

Pour construire des vecteurs Cdk-1 de cyclineB-1 marqués par GFP/RFP ciblés par les mitochondries, clonez la séquence de ciblage des mitochondries à partir du précurseur de la sous-unité 8A de la cytochrome-c oxydase humaine, et cadrez avec l’extrémité n de la GFP ou de la RFP aux sites Nhe1 et bAmH1, de pEGFP-N1 ou pERFP-N1, à l’aide de techniques de clonage moléculaire standard. À l’aide des amorces décrites dans le protocole textuel, amplifiez les gènes Cdk1 et cyclinB1 en suivant des techniques standard. Utilisez ensuite BamH1 pour digérer les produits PCR.

Exécutez les réactions sur un gel d’agarose à 1 %, avant d’utiliser une lame de rasoir pour découper des fragments d’ADN de la bonne taille. Utilisez ensuite un kit d’extraction de gel pour purifier l’ADN. Ensuite, digérez un microgramme de plasmides MTS-pEGFP-N1 et MTS-pERFP-N1 avec 1 microlitre de BamH1 à 37 degrés Celsius pendant 2 heures.

Ajoutez ensuite 1 microlitre de phosphatase alcaline intestinale de veau et incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après avoir exécuté les produits de digestion sur un gel d’agarose à 1 % et purifié l’ADN comme décrit ci-dessus, mettez en place une réaction de ligature à l’aide des réactifs énumérés dans le protocole de texte. Ensuite, incubez la réaction à 4 degrés Celsius pendant la nuit.

Transformez les cellules compétentes dH5-alpha d’E. coli avec 10 microlitres du mélange de ligature. Et cultivez les bactéries sur des plaques de gélose LB plus 10 milligrammes par millilitre de kanamycine à 37 degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, à l’aide d’une pointe de pipette stérile, prélevez une colonie dans une assiette. Et insérez l’embout dans un tube contenant 5 millilitres de LB kanamycin. Incuber la culture pendant la nuit et le lendemain matin, utilisez un mini kit de préparation selon le protocole textuel pour isoler le plasmide.

Pour transférer des cellules MCF-10A à croissance exponentielle, utilisez des plasmides Cdk1 ou cyclinB-1 pour préparer le réactif de transfection plasmidique dans un rapport de 1:2 dans 100 microlitres de sérum et de milieu sans antibiotiques. Transfectez les cellules et incubez à 37 degrés Celsius pendant 48 heures. Colorez et visualisez les mitochondries selon le protocole textuel.

Pour effectuer le tri cellulaire, transférez 2 fois 10 vers la 5e cellules avec les vecteurs souhaités dans une plaque à 6 puits en utilisant un rapport ADN/réactif de 1:2 préparé dans 2,5 millilitres de sérum et de milieu sans antibiotique. Après avoir incubé la transfection pendant 48 heures, utilisez la cytométrie en flux pour trier en direct les cellules de manière stable en exprimant les protéines Cdk-1 marquées GFP et clyclinB1 marquées RFP selon le protocole textuel. Pour mesurer la durée du cycle cellulaire à l’aide du test de cytométrie en flux de marquage EdU, les cellules ont été triées dans des plaques à 6 puits à une densité de 2,5 fois 10 jusqu’à la 5e cellule par puits.

Après une nuit d’incubation, ajouter EdU au milieu de culture à une concentration finale de 25 micromolaires et incuber pendant une heure supplémentaire. Ensuite, à deux heures d’intervalle, utilisez 1 % BSA dans 500 microlitres de PBS pour laver un puits de cellules. Et recueillir dans un tube de 1,5 millilitre.

Centrifugez les cellules à 350 g pendant 5 minutes. Jetez ensuite le surnageant. Délogez le granulé en ajoutant 100 microlitres de solution de fixation.

Bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Ensuite, utilisez 1 millilitre de 1 % BSA dans du PBS pour laver les cellules trois fois. Utilisez ensuite 0,5 millilitre d’éthanol à 70 % pour fixer les cellules à 4 degrés Celsius pendant la nuit.

Lors de la réalisation d’un marquage EdU avec des cellules transfectées avec des protéines marquées GFP et RFP, il est essentiel d’éteindre les signaux fluorescents de la GFP et de la RFP. Pour y parvenir, nous ajoutons une étape supplémentaire de fixation des cellules pendant la nuit en utilisant de l’éthanol à 70 %. Le lendemain, après avoir lavé et perméabilisé les cellules selon le protocole de texte, ajoutez 0,5 millilitre de cocktail réactionnel dans chaque tube et mélangez bien.

Après l’incubation dans l’obscurité et un autre lavage, utilisez 50 microgrammes par millilitre d’iodure de propidium ou de PI dans 1 % de PBS BSA pour colorer l’ADN. Analysez les cellules par cytométrie en flux pour suivre la population EdU-positive. Présentez un diagramme à points dispersés de cellules marquées à l’EdU colorées pour le contenu en ADN et l’EdU.

Utilisez le canal APC pour Alexa 647 EdU en utilisant un filtre passe-bande 670 à 30 bandes avec toute la lumière présente, moins de 685 nanomètres frappant ce filtre et le canal phycoérythrine pour PI avec un filtre passe-bande 581 à 15 bandes devant lui, avec toute la lumière présente à moins de 600 nanomètres frappant ce filtre. Avec une stratégie de contrôle standard pour l’acquisition, tracez le FSC zone par la SSC pour la morphologie, suivi de PI par Alexa 647 EdU pour la coloration cellulaire. Enregistrez les données de tous les tubes un par un, en acquérant 10 000 événements par échantillon.

Dans cette figure, la protéine de la matrice mitochondriale Hsp60 et la protéine de l’espace intermembranaire Timm13 ont été utilisées comme marqueurs de localisation soujochondriales. Similaire avec Hsp60, mais contrairement à Timm13, la cycline B1 et Cdk1 ont été protégées de la digestion de la trypsine, indiquant qu’elles se localisent dans la matrice mitochondriale. Comme le montre ici, par transfert Western des fractions mitochondriales isolées, à l’aide des constructions cyclineB1 et Cdk-1 marquées MTS et GFP, la surexpression de la cyclineB1 et/ou de Cdk-1 a été obtenue dans les mitochondries.

À l’aide d’un test de poursuite d’impulsions EdU, il a été démontré que les cellules de la phase S marquées progressaient à travers la phase G2M et apparaissaient en phase G1 aussi rapidement que 4 heures dans les cellules exprimant la cycline mitochondriale de type sauvage B1 Cdk-1. Par rapport à 6 heures, dans les cellules transfectées avec un contrôle vectoriel ou la cycline mutante B1 Cdk-1, indiquant que l’amélioration de la cycline mitochondriale B1 Cdk-1 accélère la progression du cycle cellulaire. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la génération d’ATP mitochondriale, la consommation d’oxygène, le potentiel membranaire et les espèces réactives de l’oxygène peuvent être mesurées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la façon dont la localisation mitochondriale de la kinase du cycle cellulaire Cdk-1 modifie la respiration mitochondriale et la production d’énergie.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’étudier la localisation mitochondriale et les fonctions spécifiques aux mitochondries d’une kinase nucléaire.