Name: Approches expérimentales pour létude mitochondrial Localisation et fonction dune cellule du cycle nucléaire Kinase, Cdk1 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 15 s
Description: Découvrez comment étudier la localisation mitochondriale de la kinase Cdk1 et ses effets sur le cycle cellulaire. Cette méthode permet d'analyser la communication entre noyau et mitochondries.

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Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH CA133402, CA152313 et le Department of Energy Office of Science DE-SC0001271. Nous remercions le Flow Cytometry Shared Resource Laboratory de l’Université de Californie à Davis, financé par le NCI P30 CA0933730, et les subventions NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 et S10 RR 026825, ainsi que l’aide technique de Mme Bridget McLaughlin et de M. Jonathan Van Dyke, pour leur aide dans les expériences de cytométrie en flux.

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Comme les protéines destinées à d&#39; autres organites sous - cellulaires, les protéines mitochondriales cible possèdent des signaux de ciblage au sein de leur structure primaire ou secondaire qui les dirigent vers l&#39;organite avec l&#39;assistance de translocation de protéines complexes et plieuses 21,22. Mitochondrie séquences de ciblage (MTS) obtenues à partir des protéines résidentes exclusivement mitochondriales telles que COX8 peuvent être ajoutés à extrémité N-terminale d&#39;une séquence de gène à...

Chez les mammifères, la progression du cycle cellulaire dépend d&#39;événements hautement ordonnés contrôlés par des cyclines et des kinases cycline-dépendantes (CDK) 1. Grâce à son cytoplasmique, nucléaire, et la localisation centrosomale, CyclinB1 / Cdk1 est capable de synchroniser différents événements dans la mitose, comme l&#39; éclatement de l&#39; enveloppe nucléaire et la séparation centrosome 2. CyclinB1 / Cdk1 protège les cellules contre l&#39; apoptose mitose 3 et favorise la fission mitochondriale, une étape critique pour une répartition égale des mitochondries des cellules filles nouvellement formées 4. Dans la prolifération des cellules de mammifères, mitochondriale d&#39;ATP est généré par la phosphorylation oxydative (OXPHOS) la machine (chaîne de transport d&#39;électrons), qui est composée de 5 complexes de sous-unités multiples; Complexe I - V complexe (CI-CV). Nicotinamide adénine dinucléotide (NADH): ubiquinone oxydoréductase ou complexe I (CI) est le plus grand et le moins bien compris des cinq complexes 5. Le c complexeonsists de 45 sous-unités, dont 14 forment le noyau catalytique. Une fois assemblé, le complexe prend une structure en forme de L avec une branche qui pénètre dans la matrice et l&#39;autre bras noyé dans la membrane interne de 6,7. Les mutations dans les sous - unités de CI sont à l&#39;origine d&#39;une variété de troubles mitochondriaux 8. Un CI fonctionnellement efficace OXPHOS est nécessaire non seulement pour la respiration mitochondriale globale 9, mais aussi pour la cellule réussie progression du cycle 10. Démêler les mécanismes sous-jacents au fonctionnement de ce complexe enzymatique liée à la membrane dans la santé et la maladie pourrait permettre le développement de nouvelles procédures de diagnostic et des stratégies thérapeutiques de pointe. Dans une étude récente, nous avons constaté que le / complexe Cdk1 de CyclinB1 translocation dans les mitochondries dans le G2 / (mitose) phase (Gap 2) M et phosphoryle sous-unités CI pour améliorer la production d&#39;énergie mitochondriale, ce qui pourrait compenser les besoins énergétiques accrus de cellules pendant la cellule cycle de 11. Ici, nous SHOwcase procédures expérimentales et les stratégies qui peuvent être utilisés pour étudier la translocation mitochondriale des kinases autrement nucléaires / cytoplasmiques, leurs substrats mitochondriaux ainsi que les conséquences fonctionnelles de leur localisation mitochondriale utilisant CyclinB1 / Cdk1 comme un exemple. La constatation que le / complexe Cdk1 de CyclinB1 translocation dans les mitochondries en cas de besoin incité les études de surexpression et knockdown de ce complexe spécifique de mitochondries. Pour parvenir à une expression spécifique des mitochondries de protéines, on peut ajouter une séquence de ciblage mitochondrial (MTS) à l&#39;extrémité N-terminale de la protéine d&#39;intérêt. Mitochondrie séquences de ciblage permettent le tri des protéines mitochondriales dans les mitochondries où ils résident normalement 12. Nous avons utilisé une séquence de ciblage 87 mitochondries de base dérivé du précurseur du cytochrome humain sous-unité c oxydase 8A (COX8) et cloné dans Green Fluorescent Protein (GFP) -tagged CyclinB1 ou rouge fluorescentProtein (RFP) -tagged Cdk1 contenant des plasmides dans le cadre. Cette méthode nous a permis de cibler CyclinB1 et Cdk1 dans les mitochondries, en changeant spécifiquement l&#39;expression mitochondrial de ces protéines sans affecter leur piscine nucléaire. Par marquage par fluorescence ces protéines, nous avons été en mesure de suivre leur localisation en temps réel. De même, nous avons introduit MTS dans un plasmide contenant DP-tagged dominante Cdk1 négative, ce qui nous a permis de frapper spécifiquement vers le bas l&#39;expression mitochondrial et les fonctions de Cdk1. Il est essentiel de faire la distinction entre les fonctions mitochondriales et nucléaires des kinases qui ont deux localisations comme Cdk1. Ingénierie MTS dans la N-terminale de ces kinases fonctionnelles double offre une grande stratégie qui est facile à employer et efficace. Etant donné que Cdk1 est une kinase du cycle cellulaire, il est essentiel de déterminer la progression du cycle cellulaire lorsque Cdk1 est localisé dans les mitochondries. Pour ce faire, nous avons utilisé une nouvelle méthod pour surveiller la teneur en ADN dans les cellules. Les méthodes traditionnelles comprennent l&#39;utilisation de la BrdU (bromodésoxyuridine), un analogue de la thymidine synthétique, qui incorpore dans l&#39;ADN nouvellement synthétisé au cours de la phase S du cycle cellulaire pour remplacer thymidine. Ensuite, les cellules qui se répliquent activement leur ADN peuvent être détectés en utilisant des anticorps anti-BrdU. Un inconvénient de cette méthode est qu&#39;elle nécessite la dénaturation de l&#39; ADN pour fournir un accès pour l&#39;anticorps BrdU par des méthodes chimiques comme le traitement de l&#39; acide ou de la chaleur, ce qui peut entraîner une incompatibilité entre les résultats 13,14. Sinon, nous avons utilisé une approche similaire pour surveiller les cellules qui se divisent activement avec un analogue de la thymidine différente, EdU. la détection EdU ne nécessite pas sévère dénaturation de l&#39;ADN en tant que traitement de détergent permet au réactif de détection pour accéder à la EdU dans l&#39;ADN nouvellement synthétisé. La méthode EdU a prouvé être plus fiable, cohérente et avec un potentiel d&#39;analyse à haut débit 15. Enfin, le to déterminer les substrats mitochondriaux de Cdk1, nous avons utilisé un outil de protéomique appelé 2D-DIGE, qui est une version avancée de l&#39;électrophorèse sur gel à deux dimensions classique. électrophorèse bidimensionnelle sépare les protéines en fonction de leur point isoélectrique dans la première dimension et un poids moléculaire dans le second. Etant donné que des modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation affectent le point isoélectrique et le poids moléculaire des protéines, des gels 2D peuvent détecter les différences entre les états de phosphorylation de protéines dans les différents échantillons. La taille (surface et intensité) de la protéine voit des changements au niveau des protéines d&#39;expression, ce qui permet une comparaison quantitative entre plusieurs échantillons. En utilisant cette méthode, nous avons été en mesure de différencier les protéines phosphorylées en type sauvage par rapport aux cellules mutantes mitochondries ciblées Cdk1 exprimant. Les taches de protéines spécifiques qui ont montré dans le type sauvage, mais il manquait dans le mutant Cdk1 préparation des mitochondries ciblées ont été isolées etidentifié par spectrométrie de masse. Dans les gels 2D traditionnels, les colorants triphénylméthane sont utilisés pour visualiser les protéines sur le gel. 2D-DIGE utilise des étiquettes de protéines fluorescentes avec un effet minimal sur la protéine mobilité électrophorétique. Des échantillons de protéines différentes peuvent être marqués avec différents colorants fluorescents, mélangés entre eux et séparés par des gels identiques, ce qui permet le co-électrophorèse des échantillons multiples sur un seul gel 16. Cela permet de minimiser les variations de gel de gel, ce qui est un problème critique dans les études protéomiques à base de gel.

<table><tbody><tr><td>32P ATP&nbsp ;</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU002001MC&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-souris</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>A-11003</td><td>Alexa-546 conjugué</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-lapin</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>A11029</td><td>Alexa-488 ATP conjugué</td></tr><tr><td></td><td>Research Organics</td><td>1166A</td><td>Pour le dosage de la kinase in vitro</td></tr><tr><td>Anticorps Cdk1</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>9112</td><td></td></tr><tr><td>Tampon kinase Cdk1</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020S</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Kit d’imagerie</td><td>Life Technologies</td><td>C10337</td><td>Pour l’analyse du cycle cellulaire avec marquage EdU</td></tr><tr><td>Anticorps COX IV</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>4844S</td><td>Pour l’immunomarquage mitochondrial Anticorps</td></tr><tr><td>Cycline B1</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-752</td><td></td></tr><tr><td>Complexe enzymatique CyclinB1/Cdk1</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020S</td><td>Eviter le gel/dégel</td></tr><tr><td>Kit d’étiquetage fluor CyDye DIGE</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>25-8009-83</td><td></td></tr><tr><td>Kit de gel DIGE et de tampon DIGE</td><td>GE Santé Sciences de la vie</td><td>28-9480-26 AA</td><td></td></tr><tr><td>Diméthylformamide&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319937</td><td>DMF</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0611</td><td>DTT</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>EMD Millipore</td><td>71004</td><td>Pour la mutagénèse dirigée enzyme</td></tr><tr><td>Dpn I</td><td>Stratagene</td><td>200519-53</td><td>Pour la mutagénèse dirigée</td></tr><tr><td>Dry Strip Fluide de couverture</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1335-01</td><td>Utilisé comme huile minérale</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T. Baker</td><td>4040-03</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>409910250</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Vacufuge Concentrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-748-13</td><td>Utilisé comme concentrateur de centrifugeuse sous vide</td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Solution de montage anti-évanouissement</td></tr><tr><td>Fortessa Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>649908</td><td>Pour le cycle cellulaire analyse avec marquage EdU</td></tr><tr><td>Histone H1</td><td>Calbiochem</td><td>382150</td><td>Pour le dosage in vitro de la kinase</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Pour la purification de fragments d’ADN à partir de gels d’agarose</td></tr><tr><td>Immobiline DryStrip Gels</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>18-1016-61</td><td>Bandes IEF (focalisation isoélectrique)</td></tr><tr><td>Glutathion immobilisé</td><td>Thermo Scientific</td><td>15160</td><td>Perles de glutathion-agarose</td></tr><tr><td>Iodoacétamide Sigma</td><td>Aldrich</td><td>I1149</td><td>IAA</td></tr><tr><td>IPGphor 3 Unité de focalisation isoélectrique</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>11-0033-64</td><td>IPGphor Porte-bandelettes</td></tr><tr><td>Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside&nbsp ;</td><td>RPI Corp</td><td>156000-5.0</td><td>IPTG</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9783</td><td>Pour tampon de lyse cellulaire</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668027</td><td>réactif de transfection</td></tr><tr><td>Lysine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5501</td><td>Pour le marquage CyDye</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>EMD Chemicals</td><td>5960</td><td></td></tr><tr><td>Mitoctracker Rouge/Vert</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>M7512/M7514</td><td>Colorants fluorescents mitochondriaux</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>EMD Chemicals</td><td>6310</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1</td><td>Clonetech</td><td>6085-1</td><td>Vecteur exprimant la GFP</td></tr><tr><td>Pfu</td><td>Stratagene</td><td>600-255-52</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-5X-1&nbsp ;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9545-53</td><td>Vecteur exprimant la GST</td></tr><tr><td>Fluorure de phénylméthylsulfonyle</td><td>Shelton Scientific</td><td>IB01090</td><td>PMSF</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Life Technologies</td><td>14040</td><td>Tube de</td></tr><tr><td>dialyse PBS Spectra/Por 4</td><td>Spectrum Labs</td><td>132700</td><td>en tant que tube à membrane poreuse pour la dialyse</td></tr><tr><td>Coloration de gel de phosphoprotéine de diamant Pro-Q</td><td>Life Technologies</td><td>P-33300</td><td>Pour la coloration des phosphoprotéines sur des gels 2D Cocktail d’inhibiteurs de</td></tr><tr><td>protéinase</td><td>Calbiochem</td><td>539134</td><td>Pour tampon de lyse cellulaire</td></tr><tr><td>Kit de mutagénèse dirigée QuikChange</td><td>Stratagene</td><td>200519-5</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>d’isolement de plasmides</td><td>Qiagen</td><td>27104</td> MiniPrep</tr><tr><td>RO-3306</td><td>Alexis Biochemicals</td><td>270-463-M001</td><td>Inhibiteur de Cdk1</td></tr><tr><td>Roténone</td><td>MP Biomedicals</td><td>150154</td><td>Inhibiteur du complexe I</td></tr><tr><td>Carbonate de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>S93359</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de sodium EMD Chemicals</td><td>SX0420-5</td><td>Pour tampon de lyse cellulaire</td></tr><tr><td>Orthovanadate de sodium</td><td>MP Biomedicals</td><td>159664</td><td>Pour tampon de lyse cellulaire</td></tr><tr><td>Pyrophosphate de sodium décahydrate</td><td>Alfa Aesar</td><td>33385</td><td>Pour tampon de lyse cellulaire</td></tr><tr><td>Sodium &bêta ;-glycérophosphate</td><td>Alfa Aesar</td><td>L03425</td><td>Pour tampon de lyse cellulaire</td></tr><tr><td>SpectraMax M2e&nbsp ;</td><td>Molecular Devices</td><td>M2E</td><td>Lecteur de microplaques</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Pilon de broyeur de tissus</td><td>Kimble Chase</td><td>885301-0007</td><td>Pour l’isolement des mitochondries</td></tr><tr><td>Tube de broyeur de tissus</td><td>Kimble Chase</td><td>885303-0007</td><td>Pour l’isolement des mitochondries</td></tr><tr><td>Solution d’acide trichloracétique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0699</td><td>TCA</td></tr><tr><td>Tris</td><td>MP Biomedicals</td><td>103133</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x-100</td><td>Teknova</td><td>T1105</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Calbiochem</td><td>650211</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon Imager</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9558-09</td><td>Scanner de gel laser pour 2D-DIGE</td></tr><tr><td>Ubiquinone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7956</td><td></td></tr></tbody></table>

approches expérimentales pour l&#39;étude mitochondrial localisation et fonction d&#39;une cellule du cycle nucléaire kinase, cdk1

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Bien que les mitochondries possèdent leur propre machinerie transcriptionnelle, seulement 1 % des protéines mitochondriales sont synthétisées à l’intérieur de l’organite. Les protéines codées par le noyau sont transportées dans les mitochondries guidées par leurs séquences de ciblage des mitochondries (MTS) ; cependant, la majorité des protéines mitochondriales localisées n’ont pas de MTS identifiable. Néanmoins, le fait que MTS puisse ordonner aux protéines d’aller dans les mitochondries fournit un outil précieux pour étudier les fonctions mitochondriales de protéines normalement nucléaires et/ou cytoplasmiques. Nous avons récemment identifié le complexe kinase du cycle cellulaire CyclinB1/Cdk1 dans les mitochondries. Pour étudier spécifiquement les fonctions mitochondriales de ce complexe, la surexpression mitochondriale et l’inactivation de ce complexe sans interférer avec ses fonctions nucléaires ou cytoplasmiques étaient essentielles. En marquant CyclinB1/Cdk1 avec MTS, nous avons pu réaliser une surexpression mitochondriale de ce complexe pour étudier ses cibles mitochondriales ainsi que ses fonctions. Grâce au marquage de Cdk1 dominant-négatif avec MTS, l’inhibition de l’activité de Cdk1 a été réalisée en particulier dans les mitochondries. Les cibles mitochondriales potentielles du complexe CyclinB1/Cdk1 ont été identifiées à l’aide d’une approche protéomique basée sur gel. Contrairement à l’analyse traditionnelle sur gel 2D, nous avons utilisé la technologie d’électrophorèse sur gel par différence tridimensionnelle (2D-DIGE) suivie d’une coloration phosphoprotéique pour marquer par fluorescence les protéines phosphorylées différentiellement dans les cellules mitochondriales exprimant Cdk1. L’identification de taches de phosphoprotéine qui ont été altérées chez les mitochondries porteuses de Cdk1 de type sauvage par rapport aux mitochondries dominantes négatives de Cdk1 a révélé l’identité des cibles mitochondriales de Cdk1. Enfin, pour déterminer l’effet de la localisation mitochondriale de CyclinB1/Cdk1 dans la progression du cycle cellulaire, un test de prolifération cellulaire utilisant un analogue synthétique de la thymidine EdU (5-éthynyl-2′-désoxyuridine) a été utilisé pour surveiller les cellules tout au long du cycle cellulaire et répliquer leur ADN. Dans l’ensemble, nous avons démontré une variété d’approches disponibles pour étudier la localisation mitochondriale et l’activité d’une kinase du cycle cellulaire. Il s’agit de méthodes avancées, mais faciles à suivre, qui seront bénéfiques à de nombreux chercheurs en biologie cellulaire.

Localisation sous-mitochondrial de CyclinB1 et Cdk1 l&#39;extraction du carbonate de sodium est utilisé pour déterminer si une protéine se trouve à l&#39;intérieur de la mitochondrie ou sur la surface extérieure, à savoir la membrane externe. Une fois une protéine est représentée à localiser l&#39;intérieur des mitochondries, en outre la détermination de la sous-mitochondrial localisation peut se faire via mit...

Ici, nous décrivons comment étudier la localisation mitochondriale d’une kinase (cycle cellulaire), et comment déterminer sa position sous-mitochondriale ainsi que les substrats/cibles mitochondriaux potentiels. L’expression forcée de protéines dans les mitochondries fournit un outil utile pour étudier les conséquences fonctionnelles de la localisation mitochondriale d’une protéine d’intérêt.

Approches expérimentales pour l&#39;étude mitochondrial Localisation et fonction d&#39;une cellule du cycle nucléaire Kinase, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

L'objectif général de la procédure suivante est de déterminer la localisation soubmitochondriale d'une kinase du cycle cellulaire normalement nucléaire, puis d'analyser comment sa localisation mitochondriale affecte la progression du cycle cellulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche mitochondriale, telles que la manière dont le noyau communique avec les mitochondries au cours du cycle cellulaire. En marquant des protéines avec une séquence d'adressage mitochondrial, nous pouvons tirer parti d'expressions spécifiquement accrues de la protéine dans les mitochondries, afin d'étudier leurs fonctions spécifiques à cet organite.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le ciblage mitochondrial de certaines protéines, elle peut également être appliquée à d'autres organites, tels que le noyau, le réticulum endoplasmique, le golgi et le lysosome. Après la culture, l'homogénéisation et la centrifugation des cellules selon le protocole décrit, transférez le surnageant dans un nouveau tube. Puis centrifugez l'échantillon à 7 000 g et à 4 degrés Celsius pendant 10 minutes.Ensuite, utilisez 200 microlitres de tampon IBC glacé pour resuspendre le culot, et divisez l'homogénat en deux aliquotes. Centrifugez à nouveau les échantillons à 7 000 g et 4 degrés Celsius pendant 10 minutes. Répétez ensuite le lavage.Après avoir éliminé le surnageant, ajouter 30 microlitres de tampon de lyse cellulaire à l'un des culots, puis conserver le lysat à 80 degrés Celsius pour une immunotransfert. Pour effectuer une extraction au carbonate de sodium sur le second culot afin de séparer les protéines solubles des protéines liées aux membranes, ajouter 250 microlitres de carbonate de sodium 0,1 molaire à pH 11,0 et incuber sur de la glace pendant 30 minutes. Centrifuger à 100 000 ×g pendant 20 minutes.Ensuite, récupérez le surnageant et ajoutez un volume égal d'acide trichloroacétique fraîchement préparé à 20 % pour précipiter les protéines. Laissez sur glace pendant 30 minutes. Pendant ce temps, ajoutez 30 microlitres de tampon de lyse cellulaire au culot et soniquez selon le protocole décrit dans le texte avant de stocker à 80 degrés Celsius pour l'immunotransfert.Après l'incubation de 30 minutes avec l'acide trichloroacétique (TCA), centrifuger le mélange réactionnel à 15 000 g pendant 10 minutes. Jeter le surnageant, puis utiliser 80 microlitres de tampon de lyse cellulaire pour remettre en suspension le culot. Après avoir isolé les fractions mitochondriales à partir des cellules comme décrit dans le protocole en texte, séparer les fractions mitochondriales en 10 portions égales.Centrifuger les échantillons à 7 000 g et à 4 degrés Celsius pendant 10 minutes. Utiliser 30 microlitres d'une gamme de concentrations de tampons de saccharose hypotoniques avec ou sans trypsine pour dissoudre chaque culot. Incuber sur de la glace pendant 30 minutes.Ajouter 3 microlitres de PMSF à 10 millimolaire dans les vials contenant la trypsine pour arrêter la digestion par la trypsine. Incuber sur de la glace pendant 10 minutes. Centrifuger les échantillons à 14 000 g et à 4 degrés Celsius pendant 10 minutes.Et transférez le surnageant dans un nouveau tube. Pour lyser le culot, ajoutez 30 microlitres de tampon de lyse cellulaire. Soniquez les échantillons comme décrit dans le protocole écrit et stockez-les à 80 degrés Celsius.Pour construire des vecteurs GFP/RFP ciblant les mitochondries et portant la cycline B1-Cdk1, cloner la séquence de ciblage mitochondrial à partir du précurseur de la sous-unité 8A de la cytochrome-c oxydase humaine, et l'insérer en phase avec l'extrémité N-terminale de la GFP ou de la RFP aux sites NheI et BamHI du pEGFP-N1 ou du pERFP-N1, en utilisant des techniques standards de clonage moléculaire. À l'aide des amorces décrites dans le protocole textuel, amplifier les gènes Cdk1 et cyclineB1 selon des techniques classiques. Ensuite, digérer les produits de PCR par BamHI.Effectuez les réactions sur un gel d'agarose à 1 %, puis utilisez une lame de rasoir pour exciser les fragments d'ADN de la taille correcte. Ensuite, purifiez l'ADN à l'aide d'un kit d'extraction de gel. Digestez ensuite un microgramme de plasmides MTS-pEGFP-N1 et MTS-pERFP-N1 avec 1 microlitre de BamH1 à 37 degrés Celsius pendant 2 heures.Ensuite, ajouter 1 microlitre de phosphatase alcaline intestinale de veau et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après avoir séparé les produits de digestion sur un gel d'agarose à 1 % et purifié l'ADN comme décrit ci-dessus, préparer une réaction de ligation en utilisant les réactifs indiqués dans le protocole écrit. Puis incuber la réaction à 4 degrés Celsius toute la nuit.Transformer des cellules compétentes E. coli dH5-alpha avec 10 microlitres du mélange de ligation. Et cultiver les bactéries sur des boîtes de gélose LB additionnée de 10 milligrammes par millilitre de kanamycine à 37 degrés Celsius pendant la nuit.Le jour suivant, utilisez une pointe de pipette stérile pour prélever une colonie à partir d'une boîte de culture. Insérez ensuite la pointe dans un tube contenant 5 millilitres de LB kanamycine. Incubez la culture toute la nuit, puis le lendemain matin, utilisez un kit de minipréparation selon le protocole indiqué pour isoler le plasmide.Pour transfecter des cellules MCF-10A en croissance exponentielle, utilisez des plasmides Cdk1 ou cyclineB-1 afin de préparer le réactif de transfection plasmidique dans un rapport de 1:2 dans 100 microlitres de milieu sans sérum ni antibiotique. Transfectez les cellules et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 48 heures. Coloriez et visualisez les mitochondries conformément au protocole décrit dans le texte.Pour effectuer le tri cellulaire, transfecter 2 fois 10 à la puissance 5 cellules avec les vecteurs désirés dans une plaque de 6 puits en utilisant un rapport 1:2 d'ADN par rapport au réactif de transfection préparé dans 2,5 millilitres de milieu sans sérum ni antibiotique. Après avoir incubé la transfection pendant 48 heures, utiliser la cytométrie en flux pour trier vivantes les cellules exprimant de façon stable les protéines Cdk-1 marquées avec GFP et cyclineB1 marquée avec RFP selon le protocole décrit. Pour mesurer la durée du cycle cellulaire à l’aide du test de cytométrie en flux avec marquage par EdU, ensemencer les cellules triées dans des plaques de 6 puits à une densité de 2,5 fois 10 à la puissance 5 cellules par puits.Après une incubation nocturne, ajouter l'EdU dans le milieu de culture à une concentration finale de 25 micromolaire et incuber pendant une heure supplémentaire. Ensuite, à des intervalles de deux heures, utiliser 1 % de BSA dans 500 microlitres de PBS pour laver une plaque de cellules. Et recueillir dans un tube de 1,5 millilitre.Centrifuger les cellules à 350 g pendant 5 minutes. Ensuite, éliminer le surnageant. Détacher le culot en ajoutant 100 microlitres de solution de fixation.Mélanger soigneusement et incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Ensuite, utiliser 1 millilitre de BSA à 1 % dans du PBS pour laver les cellules trois fois. Puis utiliser 0,5 millilitre d'éthanol à 70 % pour fixer les cellules à 4 degrés Celsius pendant toute la nuit.Lorsque l'on effectue un marquage EdU avec des cellules transfectées exprimant des protéines marquées par GFP et RFP, il est essentiel d'éteindre les signaux fluorescents provenant de la GFP et de la RFP. Pour y parvenir, nous ajoutons une étape supplémentaire de fixation des cellules pendant la nuit en utilisant de l'éthanol à 70 %. Le jour suivant, après avoir lavé et perméabilisé les cellules selon le protocole décrit, ajouter 0,5 millilitre de cocktail de réaction dans chaque tube et bien mélanger.Après l'incubation à l'obscurité et un autre lavage, utilisez 50 microgrammes par millilitre de propidium iodure ou PI dans du PBS contenant 1 % de BSA pour colorer l'ADN. Analysez les cellules par cytométrie en flux afin de suivre la population positive pour EdU. Présentez un graphique de dispersion en points des cellules marquées par EdU, colorées pour la teneur en ADN et pour EdU.Utilisez le canal APC pour l'EdU Alexa 647 en employant un filtre passe-bande 670/30 avec toute la lumière présente, inférieure à 685 nanomètres atteignant ce filtre, et le canal phycoérythrine pour le PI avec un filtre passe-bande 581/15 placé devant, avec toute la lumière présente inférieure à 600 nanomètres atteignant ce filtre. Avec une stratégie de sélection standard pour l'acquisition, tracez la surface de la diffusion avant (FSC) en fonction de la surface de la diffusion latérale (SSC) pour la morphologie, puis le PI en fonction de l'EdU Alexa 647 pour la coloration cellulaire. Enregistrez les données pour tous les tubes un par un, en acquérant 10 000 événements par échantillon.Dans cette figure, la protéine de la matrice mitochondriale Hsp60 et la protéine de l'espace intermembranaire Timm13 ont été utilisées comme marqueurs de localisation souse mitochondriale. Contrairement à Timm13, mais de façon similaire à Hsp60, la cycline B1 et la Cdk1 ont été protégées de la digestion par la trypsine, indiquant qu'elles se localisent dans la matrice mitochondriale. Comme illustré ici, par immunobuvardage des fractions mitochondriales isolées, en utilisant les constructions de cycline B1 et de Cdk-1 marquées par le MTS et la GFP, une surexpression de la cycline B1 et/ou de la Cdk-1 a été obtenue dans les mitochondries.À l'aide d'un test de suivi par pulsation à l'EdU, il a été démontré que les cellules marquées en phase S progressaient à travers la phase G2M et apparaissaient en phase G1 aussi rapidement que 4 heures chez les cellules exprimant la cyclineB1 mitochondriale de type sauvage associée à la Cdk-1. Comparativement à 6 heures chez les cellules transfectées avec un contrôle vecteur ou la cyclineB1 mutante associée à la Cdk-1, ce qui indique qu'un accroissement de la cyclineB1 mitochondriale Cdk-1 accélère la progression du cycle cellulaire. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la production mitochondriale d'ATP, la consommation d'oxygène, le potentiel membranaire et les espèces réactives de l'oxygène peuvent être mesurées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme savoir comment la localisation mitochondriale de la kinase du cycle cellulaire Cdk-1 modifie la respiration mitochondriale et la production d'énergie.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'étudier la localisation mitochondriale et les fonctions spécifiques aux mitochondries d'une kinase nucléaire.

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